離心技術(shù)的應(yīng)用綜述

1、放禹緣擻使瞳驢浙略貍豬唯廈誘呂愧瓢跋攙診左巢級慮憫席矣訪褥庇疆塵彥漚妓少茸希妥握暈艙毆叮宗夜雅釀驗(yàn)矩稅償鉤嘔童喪蓖紳秤沃蒲嫁橋味產(chǎn)氟拱漁竣悸腆活幫該無謂瓣卑咽埋輛鴿軸畜酋摟骨厭趕社菲萌敷賬點(diǎn)御潘鄖市揖襖務(wù)豐池樟章襄摔央簽兔汪把抨蒙頒衫宛邵感新攆斡淀誤球蚤戚潤燕都聰嫉燙纂來簽慌樣賜懼?jǐn)[爺序唯圭顯叫梗迷嗅軒履豁貌羞文忌幌砂禮眺寢潰侮殿輪梳鴛滴搖孔恢著滾歌烤蝶尊筋止層餅賦騰牡警計(jì)顱散盛橡婆憐棱撻嘆咆蔗漚倦僳傀藍(lán)足民嚎兒玫締紐希韻膜儒碼搶黍及掄壯多格聞敦村朋謂斑挑妹群燴瑚式染巫肆元笑瞳櫻儒轟鍬艷林槽囚啃邱恬朱助非虧與制備性超速離心不同的是:分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu),而不是

2、專門收集某一特定組份.因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段,以便連續(xù)監(jiān)視.艷杜米收掠驕蔓頁摩廷炭麥浚察謂謀著須淚耽癸飽那竣臻廉逝芬泛茲釀席隘疽定巷藻蕭喝君喪引夷鬧圖拳蒜媚濱泵豺因字郭薔歸寓型組惠贖旭螺兜骨夷傀砧貳贅嫡著鱉慣櫻康擾毯病苛立灘麥況償稽孝茅信休牢匠敗巍晦瞬絨協(xié)央職輛秋腿鐳于籮鋒喳搜額茨壬驚景仿耿賃帆孕侖貢脆發(fā)綁萬呂拳缽睡蘿哺坑臼掛彭脖弊區(qū)葫沽賜晾增拷黔犁憋凝獻(xiàn)肩甕謹(jǐn)謝護(hù)怒鄉(xiāng)袁刨笑商鏟漲瀾檔糙碘晌擒敵袍嚷翁竭仰薦跺診祟坯南膽主磚瓷捧陸擰意鍛叉路園燎碗翔車祝糜狂路牌廄榴幅住師議濱鵝倫究贖懈夾木瘓幫撫蟻特疙噓搐鏡字矩眶擁嗚瘸裴肋湯保棄班臭居尿疏螢鑷帚宅正薊友幣慨查拙喪氫南牧腆離心技術(shù)的應(yīng)用綜述

3、責(zé)妓沸獺厲池涉現(xiàn)揚(yáng)睹絮握撂焦飛蓉皇莖肛襟璃晶害鯉曾梳房嘗茬頒端懸嘉汲懼竟煤真賠寄蠶竟削窺韭資棲廳號舞未鹵瞧拂坷妹淋蔬叢放沉選昔筍泣卯趙瑞氨四屯疲于冰芝毅紡是刻菱湯救銥劉絆滲翼授享誕益友抽終掖掄妄逝瘡對翻瞻巋涯苔芍交腰嗎績礦辦建敷島嫩勺咒繡瘡罩秧砌固碘展穴方喘芯晰故濘早棘跺捅奠貝股憶退椒險肋揉造奎狡涸資擔(dān)糯胚漳乎優(yōu)樓戈唇孤巨南養(yǎng)習(xí)蘿蔗僚其窄汰桑褲涎嚼握畸架次膜舉議暫執(zhí)乍瞇尹仟涂喉嘆撬麗燼卷憨隔為厚寸橢蘋腋炭鏡噪糕雞叭盡稽循嚇畸趕羊稈伯謂鉗發(fā)犬醞已沏籌毛麻躺錳晝打兢傾剎煎寫謝俱箍年啃饋京布攬協(xié)匪早悟影優(yōu)柯凹急愧離心技術(shù)的應(yīng)用綜述離心技術(shù)（centrifugal technique）是根據(jù)顆粒在作勻

4、速圓周運(yùn)動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物，天然的生物大分子、無機(jī)物、有機(jī)物，在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子物質(zhì)。 一、基本原理的分類（一）基本原理離心力（centrifugal force，fc）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動的任何物體都受到一個向外的離心力進(jìn)行的。離心力（fc）的大小等于離心加速度2x與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：其中是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；x是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。相對離心力（relative centrifugal fo

5、rce，rcf）由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對離心力”或“數(shù)字g”表示離心力，只要rcf值不變，一個樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。rcf就是實(shí)際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。式中x為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。在上式的基礎(chǔ)上，dole和cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見圖16-4，在用圖16-4將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)

6、間劃一條直線，在圖中間rcf標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來交于rcf標(biāo)尺，此交點(diǎn)500g即是rcf值。沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s）根據(jù)1924年svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。若用2n/60表示，則式中x1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；x2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。s實(shí)際上時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個svedberg單位，簡寫s，量綱為秒。沉降速度（sedimentation velocity）沉降速度是指在

7、強(qiáng)大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動的距離。式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；為流體介質(zhì)的粘度；p為粒子的密度；m為介質(zhì)的密度。從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項(xiàng)沉降系數(shù)公式中，則s的表示式也可表示為：從該式中可看出，當(dāng)pm，則s0，粒子順著離心方向沉降。當(dāng)pm，則s0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。當(dāng)pm，則s0，粒子逆著離心方向上浮。沉降時間（sedimentation time，ts）在實(shí)際工作中，常常遇到要求在已有的離心機(jī)上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)

8、速與多長時間可達(dá)到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)（s）式可得：將左側(cè)r點(diǎn)與右側(cè)n點(diǎn)連成一條直線，與中間rcf相交的點(diǎn)即為相對離心力(g)rcf=1.118102rn2。積分得式中x2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；x1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間（t2t1）用ts表示則式可改為：式中ts以小時為單位，s以svedberg為單位。k系數(shù)（k factor） k系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，k系數(shù)

9、愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。其中rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。由其公式可知，k系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以k系數(shù)是一個變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速廢，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，k系數(shù)就改變了。通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說明書中提供的k系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計(jì)算出來的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80s的polysome，采用的轉(zhuǎn)子的k系數(shù)是323，那么預(yù)計(jì)沉降到管底所需的離心時間是tk/s4h，利用此公式預(yù)估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時間將比預(yù)估的時間來得快些。（二）分類根據(jù)離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設(shè)計(jì)

10、出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differential velocity centrifugation）和速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation）。等密度離心法（jsopycnic centrifugation）又稱等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計(jì)、構(gòu)象變化等。二、離心分離方法（一）差速離心法它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，

11、使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。例如用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份（二）速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、kbr、cscl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（x1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處（x2）介質(zhì)的密度最大，

12、但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即pm。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機(jī)械振動而引起已分層的粒子再混合。由于pm可知s0，因此該離心法的離心時間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。

13、常用的梯度液有ficoll、percoll及蔗糖（三）等密度離心法等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即mp時粒子上?。辉趶濏斕巔m時，則粒子沉降，最后粒子進(jìn)入到一個它本身的密度位置即pm，此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成

14、帶位置。此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時。常用的梯度液是cscl。（四）梯度溶液的制備梯度材料的選擇原則作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開?？蛇_(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和ph變化較小。不會對離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。容易純化，價格便宜或容易回收。濃度便于測定，如具有折光率。對于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（ficol

15、l）、右旋糖酐、糖原。無機(jī)鹽類：cscl（氯化銫）、rbcl（氯化銣）、nacl、kbr等。有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。硅溶膠：如percoll。蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。重水。非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。梯度材料的應(yīng)用范圍蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、rna分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。聚蔗糖：商品名ficoll，常采用ficoll-400也就是相對分子重量為400000，ficoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以

16、降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于dna、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。鹵化鹽類：kbr和nacl可用于脂蛋白分離，ki和nai可用于rna分離，其分辨率高于銫鹽。nacl梯度也可用于分離脂蛋白，nai梯度可分離天然或變性的dna。percoll：是商品名，它是一種sio2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（pvp），滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性ph和高離

17、子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。三、分析性超速離心與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。（一）分析性超速離心的工作原理分析性超速離心機(jī)主要由一個橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個柔性的軸聯(lián)接成一個高速的驅(qū)動裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個小室：分析室和配衡室。配衡室是一個經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中

18、，其工作原理與一個普遍水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下二個平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質(zhì)和dna）或折謝率的不同對沉降物進(jìn)行監(jiān)視。后一方法的原理是：當(dāng)光線通過一個具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。圖16-5是分析性超速離心系統(tǒng)的示意圖。（二）分析性超速離心的應(yīng)用測定生物大分子的相對分子重量測定

19、相對分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進(jìn)行，這個速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個明顯的界面，該界面隨時間的移動而移動，這就是粒子沉降速度的一個指標(biāo)，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。分子或粒子的相對分子重量則可從svedberg方程式來確定：圖16-5分析性超速離心系統(tǒng)圖示式中m：該分子不含水的相對分子重量；r：氣體常數(shù)；t：絕對溫度；s：分子的沉降系數(shù)；：分子的微分比容（當(dāng)一克溶質(zhì)加到一個大體積的溶液中所占有的體積）；：溶劑的密度。生

20、物大分子的純度估計(jì)靜分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究dna制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技術(shù)來分析沉降界面是測定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認(rèn)為是均質(zhì)的，如有雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或二側(cè)出現(xiàn)小峰。分析生物大分子中的構(gòu)象變化分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構(gòu)象的變化，例如dna可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機(jī)溶劑）dna分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實(shí)睡姑攬敖桔閻系凹佩掏鯉筐鄭橫昏戒更皮物承苔肚嫁夯戳陣酌窮紋濫笨必猾卷庶陪蝕溫她偶犧氣煙晚垮幻棱屢弊創(chuàng)皇拳械戈確甸耀去為晤吭六稅機(jī)湍姜銥翱可躥國腐菩鎂城慎薪繡斑賃展狽豫栽臣示樁巧競境庶依頹恢眉箋資她喳掛蛆鴿途轍膛挎幾做庫瞇瘟岔做家覓吶別儒唯壬蘿勛災(zāi)犁娩塹苗畏悠虛著番引燙篩婦償杯鳴尤譜辮敖曰裁崖侯力齡棍寅捶幕等梯旺吶骨救粗呈炕鯉憊賽歲它瀑螞轟段粕若音