土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測(cè)定

1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測(cè)定摘 要：從飯?zhí)瞄T(mén)口和生化樓樓下的土壤中分離、純化、培養(yǎng)獲得七個(gè)菌株，其中五個(gè)為能分泌淀粉的芽孢桿菌，通過(guò)一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)其中兩個(gè)菌株的種屬進(jìn)行了初步鑒定，并對(duì)其中一株菌所產(chǎn)的淀粉酶活力進(jìn)行了測(cè)定。關(guān)鍵字：土壤 芽孢桿菌 淀粉酶 鑒定 活力 土壤微生物類(lèi)群在全球自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的作用,它推動(dòng)著生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán),維持生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和氣候等綜合因素對(duì)微生物的影響和作用,同時(shí)其生命活動(dòng)也反映出土壤肥力、土壤改良與植物營(yíng)養(yǎng)的密切關(guān)系。芽孢桿菌是土壤細(xì)菌中最具活力的

2、部分之一,也是土壤細(xì)菌的主要種群之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小組合作，由老師指導(dǎo)，小組自行設(shè)計(jì)、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)土壤微生物進(jìn)行分離、純化及鑒定，發(fā)酵及產(chǎn)物測(cè)定，對(duì)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰M(jìn)行一個(gè)比較全方面的鍛煉和培養(yǎng)。（1）了解微生物分離純化的原理及微生物分離純化常用方法和技術(shù)；（2）掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理及方法；（3）掌握微生物的搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理及方法；（4）培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析解決問(wèn)題及判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力；（5）對(duì)所學(xué)習(xí)過(guò)的微生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合技能訓(xùn)練；（6）從不同環(huán)境土壤樣品中篩選出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并分析比較各產(chǎn)淀粉酶菌株的產(chǎn)淀粉酶活力及總結(jié)各芽孢桿菌在土壤中的

3、分布情況。1.原理及方法概述1.1原理1.1.1芽孢桿菌1.1.1.1形態(tài)學(xué)特性：芽孢桿菌細(xì)胞呈直桿狀，0.5-2.5m1.2-10m，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端或方端。細(xì)胞染色大多數(shù)在幼齡培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。1.1.1.2生理學(xué)特性：芽孢桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性，嚴(yán)格需氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。多數(shù)為腐生菌,主要分布于土壤、動(dòng)植物體表及水體中。該屬細(xì)菌的重要生理特性是能夠產(chǎn)生對(duì)對(duì)熱、pH和鹽各種多樣性的不利條件具有特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。發(fā)現(xiàn)于不同的生境，少數(shù)種對(duì)脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物致病。）1.1.2淀粉酶 淀粉酶是催化

4、淀粉水解的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。目前生產(chǎn)應(yīng)用的淀粉酶主要來(lái)源于微生物，并集中在幾種細(xì)菌和真菌中，尤其以芽孢桿菌所產(chǎn)的淀粉酶較多。其原因首先芽孢桿菌屬中能產(chǎn)生淀粉酶的菌種較多；其次，芽孢桿菌屬產(chǎn)的淀粉酶有較好的應(yīng)用價(jià)值。土壤中可利用的微生物很多，因此從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，分離純化，并進(jìn)行酶活測(cè)定，能獲得有經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的菌株。1.1.4生理生化鑒定 由于各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，所以它們能利用的底物（如糖、醇及各種含氮物質(zhì)等）不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不相同，因此可利用各種生理生化反應(yīng)來(lái)鑒別不同的細(xì)菌。根據(jù)伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，在芽孢桿菌屬中，我們鑒

5、定用的生理生化實(shí)驗(yàn)有：（1）革蘭氏染色試驗(yàn)（2）芽孢染色試驗(yàn)(3)淀粉水解試驗(yàn)（4）吲哚試驗(yàn)（5）VP試驗(yàn)（6）細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）（7）耐鹽試驗(yàn)（8）溫度實(shí)驗(yàn)（9）PH試驗(yàn)(10)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)(11)硝酸鹽還原試驗(yàn)(12)明膠液化試驗(yàn)(13)酪氨酸水解試驗(yàn)(14)酪素水解試驗(yàn)(15)運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)（鞭毛穿刺試驗(yàn)）(16)接觸酶試驗(yàn)(17)溶菌酶試驗(yàn)(18)卵磷脂試驗(yàn) (19) 馬尿酸鹽實(shí)驗(yàn)（不做）（20）苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)（不做）（21）精氨酸水解實(shí)驗(yàn)（不做）1.2方法1.2.1分離純化方法 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。由

6、于芽孢具有較強(qiáng)抗熱能力，分離純化時(shí)可采用熱處理的方法，高溫加熱處理，殺死樣品中所有不含芽孢的菌類(lèi)，在培養(yǎng)過(guò)程中得到很好的富集。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培

7、養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。1.2.2單染色 用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡(jiǎn)便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美藍(lán)、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時(shí)，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。1.2.3芽孢染色 細(xì)菌的芽孢的形狀、大小和著生位置是鑒定的重要依據(jù)

8、。芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般的染色法只能使菌體著色而芽孢不著色。其方法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦著色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。1.2.4革蘭氏染色 它可以將所有細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌兩大類(lèi)，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法，可以把它歸到生理生化鑒定上。其方法是先用結(jié)晶紫初染，再加媒染劑碘液以增加染料與細(xì)胞的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成相對(duì)分子質(zhì)量較大的復(fù)合物，然后進(jìn)行脫色（乙醇），最后用沙黃液復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色者為陽(yáng)性；如被脫色后又染上復(fù)染劑顏色（紅色）者則為陰性。1.2.5淀粉水解試驗(yàn) 有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外

9、淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。因此可用于篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。1.2.6搖瓶發(fā)酵的測(cè)定原理（1）淀粉水解（淀粉酶）生成麥芽糖（還原糖）（2）在堿性條件下，還原糖與3,5-二硝基水楊酸共熱，3,5-二硝基水楊酸被還原為3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色物質(zhì))，還原糖則被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度量呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定棕紅色物質(zhì)的吸光值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出樣品中還原糖的含量。（3）40時(shí)在5min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）計(jì)算公式:酶活力單位（U）=C酶V酶n

10、（C酶酶液中麥芽糖的濃度 V酶提取液的總體積 n酶液的稀釋倍數(shù)）2.實(shí)驗(yàn)材料與用具2.1材料 土樣2種樣品1：生化樓樓下河道邊樣品2：菊苑飯?zhí)煤箝T(mén)附近2.2培養(yǎng)基2.2.1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏 （3g） 蛋白胨（10g） 氯化鈉 （5g） 瓊脂（15g）蒸餾水 （1000ml）pH 7.2-7.4 2.2.2淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基（淀粉牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）可溶性淀粉（2g） 牛肉膏（3g） 蛋白胨（10g） 氯化鈉（5g ） 瓊脂（15g） 蒸餾水（1000ml）pH 7.2-7.42.2.3硝酸鹽培養(yǎng)基 甲液（對(duì)氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL乙液（-奈胺0.5g + 5

11、mol/醋酸100mL）硝酸鉀(0.2g) 蛋白胨 (5g)蒸餾水(1000ml)pH 7.2-7.4 2.2.4卵黃試驗(yàn)培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 (3.3g) 葡萄糖(1g) 配成100ml培養(yǎng)基 卵黃鹽水(5ml)卵黃、鹽水分別滅菌，按1:1制取培養(yǎng)基與卵黃鹽水混合倒平板2.2.5吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨 (10g) 氯化鈉 (5g)蒸餾水 (1000ml) pH 7.2-7.4 2.2.6 VP實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基 蛋白胨(10g) 氯化鈉 (5g) 葡萄糖 (5g) 蒸餾水 (1000ml)pH 7.2-7.4 2.2.7糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基葡萄糖/木糖/甘露醇/阿拉伯糖 （10g） 蛋白胨(10g) 氯化鈉

12、(5g) K2HP04(0.2g) 1溴甲酚紫(3ml) 蒸餾水 (1000ml) pH 7.2-7.42.2.8酪氨酸水解試驗(yàn)培養(yǎng)基 酪氨酸(0.5g稀釋到10ml)營(yíng)養(yǎng)瓊脂(3.3g稀釋到100ml) （分開(kāi)滅菌，酪氨酸溶液110，營(yíng)養(yǎng)瓊脂121，用時(shí)再混合，）2.2.9酪素分解試驗(yàn)培養(yǎng)基 脫脂奶粉（5g，稀釋到50ml） 瓊脂（1.5稀釋到50ml）（分開(kāi)滅菌，酪素110，營(yíng)養(yǎng)瓊脂121，現(xiàn)用現(xiàn)倒） 2.2.10運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)培養(yǎng)基 可溶性淀粉（2g） 牛肉膏(3g)蛋白胨(10g) 氯化鈉(5g)瓊脂 (5g)蒸餾水 (1000ml)pH 7.2-7.42.2.11檸檬酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基(制斜

13、面）氯化鈉(5g) 硫酸鎂(MgSO47H2O)(0.2g) 磷酸二氫銨(1g) 磷酸氫二鉀 (1g)0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液 (40mL) 檸檬酸鈉(5g)蒸餾水(1000mL) pH 6.82.2.12牛肉湯培養(yǎng)基 牛肉膏(3g) 蛋白胨(10g) 氯化鈉(5g)蒸餾水(1000ml) 瓊脂(20g)pH 7.2-7.4和pH 5.22.2.13種子培養(yǎng)基可溶性淀粉（2.0%） 酵母膏（0.5%）蛋白胨（0.5%） NaCl（0.5%） KH2PO4（0.1%）蒸餾水（100mL）pH=6.02.2.14發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉（2.0%）酵母膏（0.5%）蛋白胨（0.5%） NaCl（0.

14、5%） KH2PO4（0.1%）CaCl22H2O（0.05%）MgSO47H2O(0.05%)FeSO4H2O(0.05%) 蒸餾水100mL pH=6.0（培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌：利用水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達(dá)到100 以上高溫（121 ）滅菌的方法。）2.3試劑 1HCl、蒸餾水、結(jié)晶紫染色液、草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅染液、5孔雀綠染色、碘液、95乙醇、乙醚、40NaOH、-酚萘、3,5-二硝基水楊酸（DNS試劑配制）、1mg/ml麥芽糖溶液2.4儀器鑰匙、錐形瓶、水浴鍋、膠頭滴管、移液槍、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、玻璃涂棒、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、錐形瓶4個(gè)（2個(gè)種子培養(yǎng)

15、、2個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)）、試管2.5其他用品無(wú)菌防水紙袋、記號(hào)筆、標(biāo)簽、報(bào)紙、橡皮筋3實(shí)驗(yàn)方法與步驟3.1土樣采集 樣品1：生化樓樓下河道邊樣品2：菊苑飯?zhí)煤箝T(mén)附近近3.1.1以1為單位采用五點(diǎn)取樣法在各點(diǎn)采樣，距表層5-15，用鑰匙在五點(diǎn)處各取1的土壤，裝入無(wú)菌防水紙袋，封口。稱(chēng)重，編號(hào)1、2.3.1.2記錄所取2個(gè)樣品周?chē)沫h(huán)境狀況。3.2篩選菌株3.2.1初步篩選：3.2.1.1稱(chēng)取各土壤樣品10g于90ml無(wú)菌水的錐形瓶(錐形瓶中放有玻璃珠)1、2中(即為稀釋的土壤懸浮液)，塞好棉塞，充分振蕩20min，使土壤中菌體或芽孢子均勻分散，并置于80恒溫水浴中保持20min，/100恒溫水浴中保持1

16、0min，以殺死非芽孢的菌體。3.2.1.2取各裝有9ml無(wú)菌水的試管5支，編號(hào)為10-2,10-3,10-4用移液槍吸取1號(hào)錐形瓶?jī)?nèi)土壤懸浮液1ml加入編號(hào)為10-2的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹洗數(shù)次，即成為10-2的土壤稀釋液；同法從編號(hào)10-2試管內(nèi)取1ml加入編號(hào)為10-3的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹洗數(shù)次，即成為10-3的土壤稀釋液；依次連續(xù)稀釋為10-4的土壤稀釋液。并同法完成另一份樣品的稀釋。3.2.2進(jìn)一步篩選純化：3.2.2.1制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，并在無(wú)菌操作下倒平板(共13個(gè)，19=2321其中2個(gè)土樣，3個(gè)稀釋度，每種2個(gè)平行對(duì)照，,1個(gè)為空白對(duì)照)。3.2.2.

17、2取各土樣稀釋度為10-2,10-3,10-4的懸浮液進(jìn)行涂布平板(每種樣品的每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板)。用移液槍吸取各土樣各個(gè)稀釋度的土壤懸浮液100ul，放入平板中，用灼燒后的玻璃涂棒沿一個(gè)方向涂勻。并置于37溫箱中培養(yǎng)24h。（第一天）3.2.2.3取出所有平板，觀察三個(gè)稀釋度下的平板的菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)在30300的平板，舍棄不符合的平板。在所選平板中選取形態(tài)大小顏色等不同的菌落68種，分別用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑起，分別進(jìn)行分區(qū)劃線(3個(gè)區(qū))并做標(biāo)記。(按每種土樣選取5種菌計(jì)算，約10=25個(gè)平板)。將接種過(guò)的平板倒置于37溫箱中培養(yǎng)24h。繼續(xù)分區(qū)劃線，重復(fù)3次。（第二三四天）3.2.

18、3鏡檢 將第四次劃線得到的單個(gè)菌落進(jìn)行單染色。檢查獲得的菌種是否單一，是否為桿狀菌。若出現(xiàn)不同菌種則說(shuō)明并未純化，則繼續(xù)劃線培養(yǎng)直至鏡檢菌落單一。 單染色法 涂片（1HCl清潔，滴加1DH2O于載玻片，挑菌與水混勻）-干燥-固定（涂面朝上，微火，2-3次）-染色（冷卻，加結(jié)晶紫1-2d，染色1-2min）-水洗（倒去染色液沖洗至無(wú)色）-干燥-鏡檢。3.2.4篩選產(chǎn)淀粉酶菌株： 將分離的單個(gè)菌落接種至淀粉水解培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接種3個(gè)菌落，每種菌接種一個(gè)平板。37溫箱中培養(yǎng)24h。記錄并編號(hào)。30-48h后，觀察培養(yǎng)基中是否有透明圈產(chǎn)生，挑選有透明圈的聚落則為能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。（第五天）3

19、.2.5再次鏡檢： 挑選有透明圈的菌落，再進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，驗(yàn)證菌落為紫色，革蘭氏陽(yáng)性菌且有綠色芽孢出現(xiàn)。以致確定其具有芽孢，為芽孢桿菌。3.2.5.1革蘭氏染色 涂片-干燥-固定-初染（加草酸銨結(jié)晶紫染液1-2min后，倒去沖洗至無(wú)色）-媒染（碘液沖去涂面1min，水洗）-脫色（95酒精，25s，立即沖洗）-復(fù)染（番紅染液1min，水洗吸干）-鏡檢。3.2.5.2芽孢染色 涂片-干燥-固定-加溫染色（加5孔雀綠染色，微火加熱至冒蒸汽維持5min）-冷卻水洗（至無(wú)色）-復(fù)染（加番紅染色2min，水洗吸干）-油鏡鏡檢。(芽孢染色要培養(yǎng)30h，我們直接從鑒定淀粉水解酶的培養(yǎng)基中挑出菌進(jìn)行了

20、芽孢染色)。在不同培養(yǎng)基中挑選所得滿足條件的菌種并編號(hào)A、B、C.假設(shè)一共n種菌。接種至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，每種菌接種兩支試管，一支保存，一支進(jìn)行各項(xiàng)生化鑒定。37溫箱中培養(yǎng)24h。標(biāo)明菌種產(chǎn)地。3.3菌種鑒定：3.3.1形態(tài)學(xué)鑒定：3.3.1.1群體：從各試管斜面培養(yǎng)基上取菌種重新接種到新的平板上，37溫箱中培養(yǎng)24h。觀察其形態(tài)特征（大小、顏色、干濕、邊緣、質(zhì)地、氣味、是否易被挑起）3.3.1.2個(gè)體 單染色（桿狀，排列方式，大小） 革蘭氏染色（陽(yáng)性）芽孢染色（菌體染成紫色，芽孢為綠色，產(chǎn)孢位置，大小等）3.3.2生理生化鑒定3.3.2.1 pH=5.7的耐酸性試驗(yàn)：A.將獲得的菌種

21、分別接種到pH=5.7和pH=7.2的肉湯中(其中pH=7.2的肉湯做對(duì)照） B.置37溫箱中培養(yǎng)24hC.若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁則用“”表示，代表該菌能耐酸，反之“-”。3.3.2.1吲哚試驗(yàn)A.將獲得的菌種和空白對(duì)照分別接種到蛋白胨水培養(yǎng)液中B.置37溫箱中培養(yǎng)24hC.在各管內(nèi)加入乙醚1ml，充分振蕩，使吲哚萃取到乙醚中，靜置分層，然后沿管壁加入10d吲哚試劑，若有吲哚存在，則乙醚層顯玫瑰紅色，為陽(yáng)性，用“”表示，反之用“-”。3.3.2.3 VP試驗(yàn)A.將獲得的菌種和空白對(duì)照分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中B.置37溫箱中培養(yǎng)24hC.加入40NaOH溶液10-20d，再加入等量-酚萘在37

22、溫箱中保留15min，若培養(yǎng)液變紅，則為陽(yáng)性，用“”表示，反之。3.3.2.4糖發(fā)酵試驗(yàn)（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）A.將獲得的菌種分別接種到葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖發(fā)酵水培養(yǎng)液中（杜氏小管)(各糖含量為1）B.置37溫箱中培養(yǎng)24hC.若培養(yǎng)液變成黃色，則產(chǎn)酸，若杜氏小管中有氣泡，則產(chǎn)氣(整個(gè)過(guò)程中不能人為制造氣泡)3.3.2.5酪氨酸水解試驗(yàn)A.將營(yíng)養(yǎng)瓊脂融化，冷卻至室溫，與酪氨酸混勻制成平板B.將獲得菌種接種到點(diǎn)接到培養(yǎng)基上，置37溫箱中培養(yǎng)24hC.記錄菌落周?chē)拖旅娴睦野彼崾欠癖环纸舛赏该?.3.2.6酪素水解試驗(yàn)A.將獲得菌種接種到點(diǎn)接到培養(yǎng)基上B.置37溫箱中培養(yǎng)24hC.記錄菌落周?chē)?/p>

23、下面的酪素是否被分解而成透明3.3.2.7運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)A.使用半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管， 將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自 上而下直刺到離管底 1-1.5cm 處，沿原穿刺線拔出接種針B.置于 37恒溫箱培養(yǎng) 24h。C.觀察是否產(chǎn)生樹(shù)根狀生長(zhǎng)，若有，則菌株有鞭毛，但是如果是需氧型的話會(huì)在培養(yǎng)基表面上形成一薄膜；若是不會(huì)運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的穿刺線很清晰，直立生長(zhǎng)，則無(wú)鞭毛。3.3.2.8檸檬酸鹽試驗(yàn)A.將獲得菌種接種到點(diǎn)接到培養(yǎng)基上B.置37溫箱中培養(yǎng)24hC.若培養(yǎng)基為藍(lán)色，則表明能利用檸檬酸鹽作為碳源生長(zhǎng)，以“+”表示。若培養(yǎng)基為綠色則為陰性，以“”表示。（連續(xù)培養(yǎng)觀察大約一星期左右為宜）3.3.2

24、.9耐鹽性試驗(yàn)A.設(shè)置2,5,7,10鹽濃度梯度的培養(yǎng)基(用營(yíng)養(yǎng)瓊脂再加氯化鈉即可)B.將菌種接種在培養(yǎng)基上C.置37溫箱中培養(yǎng)24h，觀察并比較菌落長(zhǎng)勢(shì)3.3.2.10溫度試驗(yàn)A.設(shè)置5,25,45,37,60的溫度梯度B.將菌種接種到各個(gè)培養(yǎng)基上C.置不同溫度下培養(yǎng)24h3.3.2.11明膠液化試驗(yàn)A.穿刺接種，深度至明膠層2/3處，B.于37度溫箱培養(yǎng)24hC.取出靜置冰箱中待其凝固后，觀察是否被細(xì)菌液化，如被液化，則為陽(yáng)性，能產(chǎn)生蛋白酶3.3.2.12硝酸鹽還原試驗(yàn)A.將菌種接到液體培養(yǎng)基中0123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.20.61.01.41.82.0蒸餾水（mL）2.01

25、.81.41.00.60.20B.37度溫箱保持24hC.將甲、乙液等量混合后（約0.1 mL）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果若呈現(xiàn)紅色則為陽(yáng)性“+”，若無(wú)紅色出現(xiàn)則為陰性“-”3.3.2.13卵黃試驗(yàn)A.點(diǎn)解卵黃試驗(yàn)培養(yǎng)基B.37度溫箱培養(yǎng)24hC.觀察分解情況，產(chǎn)生白色圓圈表示卵磷脂分解生成脂肪，說(shuō)明有卵磷脂酶。用“”表示有透明圈，反之“-”。3.3.2.14溶菌酶試驗(yàn)A.先配制0.1的無(wú)菌溶菌酶母液B.與肉湯培養(yǎng)基混合成0.01的培養(yǎng)基C.接種并37溫箱24h培養(yǎng)，觀察若肉湯澄清則被溶菌酶抑制，用“-”表示，渾濁則不被溶菌酶抑制，用“+”表示3.3.2.15過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)A.挑選菌種于玻片上

26、，并固定干燥C.滴加過(guò)氧化氫觀察是否產(chǎn)生起泡，能夠產(chǎn)生起泡的菌種能夠產(chǎn)過(guò)氧化氫酶，用“+”表示，反之則用“-”。3.3.3定種根據(jù)伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)及各個(gè)鑒定項(xiàng)目的結(jié)果，給所挑選的菌株鑒定到種3.4酶活測(cè)定3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作3.4.1.1麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 0.1g麥芽糖+100mL蒸餾水3.4.1.2按照下表配制麥芽糖梯度溶液3.4.1.3各加3，5二硝基水楊酸試劑2ml,沸水浴準(zhǔn)確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至20ml3.4.1.4在分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520nm進(jìn)行比色，記錄吸光值3.4.1.5以吸光值為縱坐標(biāo)，麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.4.2樣液的測(cè)定3.4.2.1 發(fā)

27、酵液的制備，選擇一個(gè)菌株，接三環(huán)菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，160 rpm/min , 37 ，48 h后，取1ml發(fā)酵液于離心管中，4000 rpm/min離心10 min，收集上清液3.4.2.2取上清液，加1%淀粉溶液1mL、緩沖液3mL，于60水浴中預(yù)熱5min3.4.2.3加檸檬酸緩沖液1mL，于60水浴中保溫30min3.4.2.4加入1.5mLDNS，沸水浴5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20 mL。3.4.2.5空白對(duì)照 加發(fā)酵液后加濃鹽酸至pH=3.6以下鈍化淀粉酶，使酶失活，其余步驟同上3.4.2.6定容后，搖勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520nm處進(jìn)行比色，記錄吸光值，從麥

28、芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1取樣結(jié)果4.1.1鏡檢從土樣1中分離出3個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)鏡檢判斷均已純化，分別標(biāo)記為1A,1B,1C從土樣2中分離出4個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)鏡檢判斷均已純化，分別標(biāo)記為2A,2B,2C,2D4.1.2淀粉培養(yǎng)基篩選及產(chǎn)孢情況1A1B1C2A2B2C2D淀粉酶+-+-革蘭氏+芽孢+“+”表示產(chǎn)淀粉酶/芽孢/陽(yáng)性，反之“-”，無(wú)淀粉酶的菌株不做芽孢染色觀察4.1.3形態(tài)學(xué)結(jié)果編號(hào)1A個(gè)體較小，短桿狀，排列散落，單個(gè)或短鏈狀菌落白色略透明，菌落中等，表面光滑，非常濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子端生，多游離，不膨大編號(hào)1B個(gè)體較小

29、，短桿或近橢圓，多短鏈狀排列菌落淺黃色不透明，菌落較小，表面粗糙，有明顯褶皺，較干燥，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子端生，膨大明顯編號(hào)2A個(gè)體較細(xì)，長(zhǎng)桿狀，鏈狀排列菌落黃色不透明，菌落較大，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子偏端，不膨大編號(hào)2B個(gè)體桿狀，中等長(zhǎng)度，長(zhǎng)鏈狀排列菌落白色不透明，菌落較大，表面粗糙，略干燥，邊緣不平整呈絨毛狀，難挑起產(chǎn)孢情況中生，不膨大，多游離編號(hào)2C個(gè)體較小，長(zhǎng)桿狀，多短鏈狀排列菌落白色不透明，菌落較大，表面濕潤(rùn)光滑有光澤，邊緣平整，易挑起產(chǎn)孢情況孢子偏端生，輕微膨大4.2生理生化鑒定結(jié)果 選取1B、2C進(jìn)行生理生化鑒定項(xiàng)目1B2C1212VP+-+吲哚+-+

30、糖 發(fā) 酵葡萄糖+木糖-阿拉伯糖-甘露醇-溫 度5-25+37+45+60-耐 鹽2+5-7+10+硝酸鹽還原-+酪素分解-+酪氨酸分解-卵磷脂酶-+接觸酶+溶菌酶-+PH5.7-運(yùn)動(dòng)性+明膠液化-檸檬酸鹽+-根據(jù)伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)1C應(yīng)為凝結(jié)芽孢桿菌,2C為蜂房芽孢桿菌4.3酶活測(cè)定情況選擇編號(hào)2C的菌株作為酶活測(cè)定對(duì)象4.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定第一組（我們組）麥芽糖g/L00.20.61.01.41.82.0吸光度00.0350.2780.5270.6291.0651.229第三組（其他組）麥芽糖g/L00.20.61.01.41.82.0吸光度00.0550.2860.6630.9671.1

31、771.394由于第三組所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況較好，因此將第三組的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算4.3.2所選菌株的酶活測(cè)定空白樣品1樣品2吸光度00.1800.1660.1830.179麥芽糖g/L0.340.320.350.34經(jīng)計(jì)算樣品1的酶活=（0.34+0.32）/218=2.64樣品2的酶活=（0.35+0.34）/218=2.76編號(hào)2C的菌株在該發(fā)酵配方的培養(yǎng)下酶活U=（2.64+2.76）/2=2.75.結(jié)果分析與討論5.S實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和總體操作上 這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)于我們來(lái)說(shuō)是一個(gè)較為長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，加之實(shí)驗(yàn)設(shè)備器材有限，需要排隊(duì)輪候，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程的整體規(guī)劃和安排

32、，以及各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的嚴(yán)謹(jǐn)操作，都有利于減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間和等待。例如這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要我們從土壤中提取的芽孢桿菌，因此在操作需要進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌控制防止雜菌污染，實(shí)驗(yàn)器具在操作前的滅菌，培養(yǎng)基使用前的滅菌，無(wú)菌室的消毒和無(wú)菌操作等等，這些操作都需要一個(gè)比較長(zhǎng)的時(shí)間等待，我們?cè)诘却臅r(shí)間里可以提前做好下一個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作，例如培養(yǎng)基的配制、接種、清洗器具等，有助于我們縮短整個(gè)實(shí)驗(yàn)的用時(shí)在由土壤制備菌懸液時(shí)，需要加入玻璃珠使細(xì)胞離散有利于形成單菌落，在實(shí)驗(yàn)前需要將玻璃珠放入錐形瓶中一同高壓蒸汽滅菌，有組別事先忘記加入玻璃珠，需要重新加入玻璃珠再次滅菌，增加了多余的環(huán)節(jié)，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間；我們小組在進(jìn)行VP實(shí)驗(yàn)過(guò)程

33、中，由于使用了錯(cuò)誤的試劑，無(wú)法得到準(zhǔn)確正常的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要重新配置培養(yǎng)基和接種，造成了時(shí)間和材料的浪費(fèi)5.2菌株分離純化時(shí)，三次劃線后，只有一個(gè)平板出現(xiàn)明顯單菌落，大多數(shù)呈現(xiàn)為菌苔，鏡檢結(jié)果表明所選菌株均已純化；說(shuō)明我們所選擇的時(shí)間周期（24h）對(duì)多數(shù)菌株的來(lái)說(shuō)培養(yǎng)過(guò)長(zhǎng)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是接種培養(yǎng)還是留種，都應(yīng)當(dāng)適當(dāng)縮短培養(yǎng)時(shí)間，防止培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致菌種老化或者活性降低5.3在革蘭氏染色中，所有產(chǎn)淀粉酶的菌株結(jié)果都為陽(yáng)性，但是在該實(shí)驗(yàn)中缺乏陰性對(duì)照，難以判斷是否因?yàn)槿旧⒚撋牟僮骰蛘邥r(shí)間問(wèn)題導(dǎo)致觀測(cè)出現(xiàn)偏差或者個(gè)人對(duì)顏色深淺判斷一定的主觀影響，因此在進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，建議與革蘭氏陰性菌

34、例如大腸桿菌混合，形成對(duì)照，使觀測(cè)更易判斷和描述，結(jié)果更準(zhǔn)確和有說(shuō)服力5.4芽孢染色操作較為困難，操作不當(dāng)可能導(dǎo)致染色效果不明顯或者洗脫時(shí)菌體容易被沖掉，需要耐心操作；小組操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，可以在滴入3-5滴孔雀綠溶液后，置于火焰上方較高處直接烘烤，冒白煙（不沸騰）至干之后直接洗脫，比較簡(jiǎn)便，且可以達(dá)到較好的觀察效果；但該操作缺乏重復(fù)和對(duì)照，不能判斷是巧合造成的僅對(duì)我們所選取的菌株有效還是有推廣的可行性5.5淀粉酶檢驗(yàn)的時(shí)候，有兩株菌落形態(tài)相似的菌株出現(xiàn)相反的情況，說(shuō)明這兩株菌株很大可能是不同的，有些菌株菌落看起來(lái)相似，但實(shí)際上可能是不同的菌株，也反映了生理生化鑒定和基因檢測(cè)的必要性5.6耐鹽性

35、試驗(yàn)中，兩種菌在2、7、10鹽濃度培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后都能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明這兩種菌對(duì)于高濃度的鹽環(huán)境具有一定的抗逆性；但是在5鹽濃度的兩個(gè)平行培養(yǎng)基上兩種菌株總共4個(gè)接種點(diǎn)都不生長(zhǎng)，其中編號(hào)1B的菌株在常溫下放置5天后又出現(xiàn)生長(zhǎng)的跡象，除去接種操作過(guò)程中存在的問(wèn)題，推測(cè)可能為配置耐鹽過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，鹽的用量不準(zhǔn)確或者倒平板時(shí)對(duì)各個(gè)平板對(duì)應(yīng)的鹽濃度標(biāo)示錯(cuò)誤，因此該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能存在不準(zhǔn)確和偏差；在時(shí)間條件允許的情況下，應(yīng)該對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)5.7溫度實(shí)驗(yàn)中，兩種菌在在5和60的極端環(huán)境中不生長(zhǎng)，在25和45中生長(zhǎng)，且在45中長(zhǎng)勢(shì)較好，說(shuō)明這兩種菌的生長(zhǎng)最適溫度都偏高，其中編號(hào)1B的菌落出現(xiàn)擴(kuò)散的現(xiàn)象

36、，可能原因是接種過(guò)程中沾到斜面上的冷凝水，使得菌體擴(kuò)散；結(jié)合純化培養(yǎng)時(shí)該菌株也出現(xiàn)類(lèi)似的情況和培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該縮短的判斷，猜測(cè)此菌株培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，開(kāi)始出現(xiàn)老化的跡象，在45的條件下1B菌株的可能的最適培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于24h.而用于條件所限制，本次實(shí)驗(yàn)只選擇了4個(gè)溫度梯度，中間間隔過(guò)大，不能很好地反應(yīng)這兩種菌對(duì)環(huán)境的抗逆性情況5.8糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基配制后基本為紫色，但是部分培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌后變?yōu)榫萍t色，查詢(xún)資料后知道該實(shí)驗(yàn)使用的酸堿指示劑溴甲酚紫是作為酸堿指示劑加入在，變色范圍pH5.2（黃）-6.8（紫），通過(guò)詢(xún)問(wèn)老師得知使用高壓蒸汽滅菌在升溫和降溫的過(guò)程較長(zhǎng)，在這個(gè)過(guò)程中，可能某些物

37、質(zhì)發(fā)生變化，使得溶液的酸堿度發(fā)生變化；思考：是否可以用pH試紙直接檢測(cè)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基的酸堿度；或者培養(yǎng)后再加入酸堿指示劑；可能結(jié)果較不為直觀，但應(yīng)該可達(dá)到相同的目的，即產(chǎn)酸產(chǎn)氣的檢測(cè)5.9 VP實(shí)驗(yàn)中，在加入-酚萘后上層溶液變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，保溫后無(wú)任何明顯變化，詢(xún)問(wèn)老師后得知，可能為加入藥品錯(cuò)誤，堿性不足，發(fā)生了其他的反應(yīng)；之后發(fā)現(xiàn)其他組別也出現(xiàn)類(lèi)似的情況，基本確定為加入的堿性物質(zhì)濃度不足，沒(méi)有形成強(qiáng)堿環(huán)境，具體變化不明；重復(fù)試驗(yàn)，其中編號(hào)1B出現(xiàn)一個(gè)陽(yáng)性一個(gè)陰性結(jié)果，由于接種時(shí)種子培養(yǎng)基內(nèi)存在較多冷凝水，可能沒(méi)取到菌種或者數(shù)量較少，不排除受污染的情況；由于時(shí)間關(guān)系未再進(jìn)行重復(fù)，該實(shí)驗(yàn)也提

38、醒我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該保持小心、仔細(xì)，藥品的選用和用量都可能對(duì)結(jié)果造成干擾，并且也再次提醒我們重復(fù)實(shí)驗(yàn)和平行對(duì)照的重要性5.10在酪素水解、酪氨酸水解和卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)中，由于酪素、酪氨酸和卵黃中含有蛋白質(zhì)等物質(zhì)在高溫條件下變性，因此不能直接高溫（121）蒸汽滅菌，應(yīng)當(dāng)根據(jù)材料的不用采取不同的方法，例如酪素和酪氨酸在110滅菌，蛋黃在無(wú)菌條件下取用即可5.11 pH5.7的耐酸性實(shí)驗(yàn)表明，兩種菌對(duì)偏酸性的抗逆性較低；溶菌酶試驗(yàn)表明編號(hào)2C的菌株對(duì)溶菌酶具有一定的抗逆性；這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該使用肉湯培養(yǎng)基同pH7.0的肉湯作對(duì)比，通過(guò)渾濁度可以直觀地對(duì)比出菌株生長(zhǎng)或者不生長(zhǎng)，但是對(duì)于菌株的生長(zhǎng)情況比較難以

39、把握，在溶菌酶試驗(yàn)中可以使用固體培養(yǎng)基，用小濾紙片浸沒(méi)在溶菌酶中，通過(guò)透明圈的大小來(lái)判斷抑制情況5.12檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)中，編號(hào)1B的菌種能對(duì)檸檬酸鹽進(jìn)行利用，但該實(shí)驗(yàn)一直到第五天才出現(xiàn)輕微現(xiàn)象，第六天才出現(xiàn)明顯現(xiàn)象，說(shuō)明芽孢桿菌對(duì)檸檬酸鹽的利用能力較低，需要長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)觀察才能做出判定5.13我們通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定得出來(lái)的結(jié)果并非十分準(zhǔn)確，僅是初步鑒定，缺乏比較嚴(yán)格的重復(fù)和對(duì)照，部分項(xiàng)目可能存在誤差，部分項(xiàng)目由于條件限制沒(méi)有實(shí)施，實(shí)際操作中對(duì)微生物的種的鑒定還應(yīng)該進(jìn)行基因檢測(cè)和鑒定才能最終判斷5.14 我們選取淀粉檢驗(yàn)時(shí)透明圈較大的2C作為酶活檢測(cè)對(duì)象，實(shí)際結(jié)果酶活力較并不高；通過(guò)課堂知識(shí)和老師講解，我們知道種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方不同是由于微生物的最適生長(zhǎng)條件和最適產(chǎn)物條件的不同，對(duì)于我們選用的菌株，要得出最適的發(fā)酵配方是需要建立大量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的，我們通過(guò)查詢(xún)資料得帶的配方只能作為參考使用，實(shí)際上可能并非該菌株的最優(yōu)配方；因此測(cè)得的酶活力相應(yīng)的只能作為一個(gè)參考量，并非該菌株的酶活的最優(yōu)結(jié)果6綜合討論通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)于一個(gè)實(shí)驗(yàn)，從開(kāi)始查閱資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)到實(shí)驗(yàn)操作、記錄和總結(jié)有一個(gè)比較清晰的了解，同時(shí)也確實(shí)體會(huì)到了做實(shí)驗(yàn)的辛苦。對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，我們還存在一些不足，例如對(duì)于查閱資料的整理和使用，以及項(xiàng)目的選擇，都存在一些不清