神經(jīng)通路追蹤技術(shù)

1、神經(jīng)通路追蹤技術(shù)PPT制作人：舒洪玲材料查找與修改：楊君嬋、李夢(mèng)嫻、舒洪玲、黃艷雙班級(jí)：11級(jí)生物科學(xué)1班什么是神經(jīng)通路？ 神經(jīng)通路神經(jīng)通路是從感受器到大腦皮質(zhì)或從大腦皮是從感受器到大腦皮質(zhì)或從大腦皮質(zhì)至效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈，作為神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的通質(zhì)至效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈，作為神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的通路，稱神經(jīng)通路。路，稱神經(jīng)通路。神經(jīng)傳神經(jīng)傳 感覺(jué)傳導(dǎo)通路（上行傳導(dǎo)通路）：從感受感覺(jué)傳導(dǎo)通路（上行傳導(dǎo)通路）：從感受導(dǎo)通路導(dǎo)通路 器到大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元鏈。器到大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元鏈。 運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)道（下行傳導(dǎo)通路）：從大腦皮運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)道（下行傳導(dǎo)通路）：從大腦皮 皮質(zhì)到效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈。皮質(zhì)到效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈。 那么，傳導(dǎo)

2、速度這樣快，科學(xué)家們是那么，傳導(dǎo)速度這樣快，科學(xué)家們是通過(guò)什么技術(shù)來(lái)研究的呢？通過(guò)什么技術(shù)來(lái)研究的呢？研究一般思路研究一般思路 給與神經(jīng)元以某種物質(zhì)，追蹤它的輸送及其輸送后在神經(jīng)元其它部分的定位。 應(yīng)用一些組織化學(xué)方法來(lái)顯示中樞神經(jīng)通路-如熒光法。神經(jīng)通路追蹤技術(shù)神經(jīng)通路追蹤技術(shù) 凡是用于研究神經(jīng)系統(tǒng)各結(jié)構(gòu)間的纖維聯(lián)系凡是用于研究神經(jīng)系統(tǒng)各結(jié)構(gòu)間的纖維聯(lián)系方法統(tǒng)稱為神經(jīng)通路追蹤技術(shù)。例如：方法統(tǒng)稱為神經(jīng)通路追蹤技術(shù)。例如：GolgiGolgi染色法染色法辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法熒光色素逆行標(biāo)志法熒光色素逆行標(biāo)志法放射性核素示蹤法放射性核素示蹤法 細(xì)胞毒植物凝集素

3、追蹤法細(xì)胞毒植物凝集素追蹤法.GolgiGolgi染色法染色法 方法方法: :將動(dòng)物灌注固定后取將動(dòng)物灌注固定后取腦并將全腦浸于腦并將全腦浸于GolgiGolgi染液中染液中2 2周周, ,然后浸于然后浸于30%30%蔗糖中蔗糖中; ;經(jīng)經(jīng)過(guò)蒸餾水洗滌、氨化、酸性過(guò)蒸餾水洗滌、氨化、酸性堅(jiān)膜定影液反應(yīng)、蒸餾水再堅(jiān)膜定影液反應(yīng)、蒸餾水再洗滌洗滌, ,然后切片，采用然后切片，采用100100微微米厚的震動(dòng)切片。經(jīng)上升梯米厚的震動(dòng)切片。經(jīng)上升梯度酒精脫水、透明度酒精脫水、透明, ,裱片后觀裱片后觀察。察。 目的目的：研究神經(jīng)元之間的：研究神經(jīng)元之間的鄰近關(guān)系以及樹突、軸突的鄰近關(guān)系以及樹突、軸突的配

4、布。配布。辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法(Horseradish (Horseradish peroxidease-HRP)peroxidease-HRP) 辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法是利用辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法是利用軸漿運(yùn)輸軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象追蹤現(xiàn)象追蹤神經(jīng)元間聯(lián)系的一種方法。神經(jīng)元間聯(lián)系的一種方法。 軸漿運(yùn)輸是神經(jīng)元的一項(xiàng)基本活動(dòng)，即沿其軸突從胞體向軸漿運(yùn)輸是神經(jīng)元的一項(xiàng)基本活動(dòng)，即沿其軸突從胞體向末梢（順向）及從末梢向胞體（逆向）的物質(zhì)運(yùn)輸。末梢（順向）及從末梢向胞體（逆向）的物質(zhì)運(yùn)輸。 到達(dá)胞體或末梢的到達(dá)胞體或末梢的HRPHRP，最后通過(guò)呈色反應(yīng)，形成有色

5、反應(yīng)，最后通過(guò)呈色反應(yīng)，形成有色反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)物 HRP HRP方法的主要方法的主要步驟：步驟：HRPHRP的引入的引入 存活期存活期 神經(jīng)材神經(jīng)材料的固定、取材料的固定、取材 切片及組織化學(xué)反應(yīng)切片及組織化學(xué)反應(yīng) 切片的觀察切片的觀察HRPHRP法的基本用法：法的基本用法：識(shí)別突觸傳入沖動(dòng)的來(lái)源識(shí)別突觸傳入沖動(dòng)的來(lái)源 將HRP注入軸突終末某區(qū)，它即被攝取，并經(jīng)軸突逆行送到神經(jīng)胞體，從而追蹤突觸傳入沖動(dòng)的來(lái)源和去處。確定傳出投射確定傳出投射 注射HRP到灰質(zhì)區(qū)，可使注射區(qū)的神經(jīng)元胞體攝取示蹤劑并經(jīng)軸索順行輸送到突觸終末。神經(jīng)元的神經(jīng)元的GolgiGolgi樣染色樣染色。Methods rely o

6、n a substances incorporation into the neuron, its transport, and its subsequent localization in other part of the neuron;Histochemical methods.注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 給藥給藥 加壓注射、離子投入和軸索損傷后標(biāo)記。 動(dòng)物存活時(shí)間動(dòng)物存活時(shí)間 逆行輸送速度：50-120mm/天，胞體內(nèi)活性：2-4天。 順行輸送速度：100-300mm/天。 固定和切片固定和切片 1%多聚甲醛于1.5戊二醛，一般為冰凍切片。 HRPHRP的選擇的選擇 游離HRP; 結(jié)合HRP(氨

7、基酸、凝集素、某些細(xì)菌毒素等可提高其靈敏度數(shù)十倍）。常用的成色方法及成色劑常用的成色方法及成色劑 成色劑顯示成色劑顯示HRP-HRP-組織化學(xué)反應(yīng)步驟組織化學(xué)反應(yīng)步驟 成色方法成色方法： 是將組織培育于是將組織培育于H H2 2O O2 2和成色劑（聯(lián)苯胺或其衍生物）和成色劑（聯(lián)苯胺或其衍生物）溶液內(nèi)，由過(guò)氧化物溶液內(nèi)，由過(guò)氧化物-過(guò)氧化物酶系統(tǒng)氧化成有色產(chǎn)物。過(guò)氧化物酶系統(tǒng)氧化成有色產(chǎn)物。 成色劑成色劑： 二鹽酸聯(lián)苯胺四鹽酸（二鹽酸聯(lián)苯胺四鹽酸（DABDAB）；）； 聯(lián)苯胺二鹽酸（聯(lián)苯胺二鹽酸（BDHABDHA）；）； 四甲基聯(lián)苯胺（四甲基聯(lián)苯胺（TMBTMB）；）； 鄰聯(lián)茴香胺（鄰聯(lián)茴香胺

8、（o-Do-D）；）；常見(jiàn)神經(jīng)元被常見(jiàn)神經(jīng)元被HRPHRP標(biāo)記程度標(biāo)記程度 1977 1977年年KuypersKuypers等利用軸漿流逆向輸送，將熒光素作等利用軸漿流逆向輸送，將熒光素作為示蹤劑，用不同的熒光素分別注入兩個(gè)不同部位為示蹤劑，用不同的熒光素分別注入兩個(gè)不同部位雙標(biāo)記神經(jīng)元，可在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，使雙標(biāo)記神經(jīng)元，可在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，使神經(jīng)元胞體顯示出兩種不同顏色的熒光神經(jīng)元胞體顯示出兩種不同顏色的熒光。常用的熒光素有常用的熒光素有：FITC(FITC(綠色綠色) ), TRITC(TRITC(紅色紅色) )熒光素逆行標(biāo)記法熒光素逆行標(biāo)記法熒光素逆行標(biāo)記神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)

9、步驟：熒光素逆行標(biāo)記神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)步驟： 熒光化合物溶液的配制熒光化合物溶液的配制 熒光化合物的注射（肌熒光化合物的注射（肌肉等）肉等） 動(dòng)物存活期動(dòng)物存活期 灌注固定液灌注固定液 取材（腦或脊髓）取材（腦或脊髓） 切片（冰凍切片）、貼片、切片（冰凍切片）、貼片、蓋片蓋片 熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡觀察 熒光逆行標(biāo)記法簡(jiǎn)單、靈敏，可研究神經(jīng)熒光逆行標(biāo)記法簡(jiǎn)單、靈敏，可研究神經(jīng)元的側(cè)枝投射。但切片易褪色，不易控制元的側(cè)枝投射。但切片易褪色，不易控制注射范圍和避免過(guò)路纖維的攝取。注射范圍和避免過(guò)路纖維的攝取。放射性核素示蹤法放射性核素示蹤法 放射性核素示蹤法是一種利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)放射性核素示蹤法是

10、一種利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象進(jìn)行放射性示蹤劑標(biāo)記，用自顯影方法顯示神經(jīng)元象進(jìn)行放射性示蹤劑標(biāo)記，用自顯影方法顯示神經(jīng)元與終末或神經(jīng)元間聯(lián)系的方法。與終末或神經(jīng)元間聯(lián)系的方法。 它的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是它的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是過(guò)路神經(jīng)纖維幾乎無(wú)標(biāo)記過(guò)路神經(jīng)纖維幾乎無(wú)標(biāo)記，而過(guò)路纖維問(wèn)題正是辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法而過(guò)路纖維問(wèn)題正是辣根過(guò)氧化物酶軸突逆行追蹤法所難以避免的。所難以避免的。放射性核素示蹤法的主要步驟放射性核素示蹤法的主要步驟 放射性示蹤溶液的配置（放射性示蹤溶液的配置（3 3H-H-氨基酸）氨基酸） 放射性示蹤劑引入（注射法、電泳法）放射性示蹤劑引入（注射法、電泳法） 存活期、固定（存活期、固定（10%10%甲醛溶液）、切片、貼片甲醛溶液）、切片、貼片 涂布原子核乳膠或感光材料涂布原子核乳膠或感光材料 曝光（密閉的暗盒中進(jìn)行）曝光（密閉的暗盒中進(jìn)行） 顯影、定影、染色（顯影、定影、