第二代測(cè)序技術(shù)

1、第二代高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介第二代高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介1.四大高通量測(cè)序平臺(tái)四大高通量測(cè)序平臺(tái) Solexa，454 (GS-FLX)， SOLiD和和Polonator2.測(cè)序原理測(cè)序原理 合成法測(cè)序合成法測(cè)序(Sequencing by Synthesis) 連接法測(cè)序連接法測(cè)序(Sequencing by Ligation) 454 (GS-FLX) Roche：（：（2005，2007，2008） 原理：在原理：在DNA聚合酶、聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光硫酸化酶、熒光素酶素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)的作用下，將每一個(gè)dNTP的的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，聚合與一次

2、化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。序列的目的。 454 (GS-FLX)流程流程1、文庫(kù)制備：基因組、文庫(kù)制備：基因組DNA/cDNA片段化處理片段化處理至至300-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA 。454 (GS-FLX)流程流程 2、Emulsion PCR：?jiǎn)捂湥簡(jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被文庫(kù)被固定固定在在DNA捕獲磁珠上，捕獲磁珠上，乳化乳化，形成油包水的混合，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在

3、自己的微反應(yīng)器里進(jìn)物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的行獨(dú)立的擴(kuò)增，擴(kuò)增，回收純化；回收純化； 454 (GS-FLX)流程流程 3、測(cè)序反應(yīng)：攜帶、測(cè)序反應(yīng)：攜帶DNA片段的磁珠被放入片段的磁珠被放入PTP板中供測(cè)序反應(yīng)使用。板中供測(cè)序反應(yīng)使用。 454 (GS-FLX)流程流程 4、數(shù)據(jù)分析：、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得當(dāng)中可獲得100余萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)余萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)4-6億億個(gè)堿基信息個(gè)堿基信息 Solexa-Illumina Genome Analyzer 核心技術(shù)：核心技術(shù)：“DNA簇簇”和和“可逆性末端終止可逆性末端終止”

4、 。 原理：將基因組原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即玻璃表面（即Flow cell），這些），這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在和橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計(jì)上形成了數(shù)以億計(jì)Cluster，每個(gè)，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸核苷酸，通過(guò)可逆性終止的，通過(guò)可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)行測(cè)序。 SOLiD AB

5、I(Applied Biosystems)：SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 原理原理 ：用連接法測(cè)序獲得基于：用連接法測(cè)序獲得基于“雙堿基編雙堿基編碼原理碼原理”的的SOLiD顏色編碼序列，隨后的顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的編碼的reference序列，把序列，把SOLiD顏色序顏色序列定位到列定位到reference上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在現(xiàn)潛在

6、SNP位點(diǎn)。位點(diǎn)。 SOLiD流程流程 1、SOLiD基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建 SOLiD流程流程 2、油包水、油包水PCR SOLiD流程流程 3、含、含DNA模板模板P1磁珠的固定磁珠的固定 SOLiD流程流程 4、SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程雙堿基編碼原理及測(cè)序流程 SOLiD流程流程 4、SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程雙堿基編碼原理及測(cè)序流程 SOLiD流程流程5. 數(shù)據(jù)分析原理數(shù)據(jù)分析原理 Polonator 測(cè)序原理：測(cè)序原理： Polonator系統(tǒng)高質(zhì)量測(cè)序是一種以系統(tǒng)高質(zhì)量測(cè)序是一種以連接連接反應(yīng)反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)行DNA序列分析的技術(shù)，該系統(tǒng)采用序列分析的技術(shù)，該

7、系統(tǒng)采用結(jié)合在結(jié)合在磁珠磁珠上單分子上單分子DNA片段簇片段簇為測(cè)序模板，為測(cè)序模板，以以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色熒四色熒光標(biāo)記光標(biāo)記的的9堿基單鏈熒光探針混合物進(jìn)行連續(xù)堿基單鏈熒光探針混合物進(jìn)行連續(xù)的連接反應(yīng)為基礎(chǔ)，對(duì)擴(kuò)增的的連接反應(yīng)為基礎(chǔ)，對(duì)擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行片段進(jìn)行大規(guī)模高通量測(cè)序。大規(guī)模高通量測(cè)序。 Polonator流程流程單分子測(cè)序 1、 測(cè)序平臺(tái)介紹1 1 并行單分子合成測(cè)序技術(shù)1 2 單分子實(shí)時(shí)合成測(cè)序技術(shù)1 3 納米孔單分子技術(shù)1 1 并行單分子合成測(cè)序技術(shù) Helicos Biosciences 是第一個(gè)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)單分子測(cè)序方法( tSMSTM)

8、技術(shù)平臺(tái)的公司，其基礎(chǔ)主要來(lái)自于Braslavsky 等人的研究。 主要是利用合成測(cè)序理論( 圖1) ，測(cè)序時(shí)首先將待測(cè)序列打斷成小片段并在3末端加上polyA( 圖1a) ，并用末端轉(zhuǎn)移酶阻斷( 圖中標(biāo)注為F1) ，同時(shí)在玻璃芯片上隨機(jī)固定多個(gè)polyT引物( 其末端皆帶有熒光標(biāo)記) ，將小片段DNA 模板與檢測(cè)芯片上的polyT 引物進(jìn)行雜交并精確定位( 圖1b) ，通過(guò)成像來(lái)精確定位雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測(cè)序的位點(diǎn)( 圖1c) ; 逐一加入熒光標(biāo)記的單色末端終止子及聚合酶的混合液孵育，洗滌，利用全內(nèi)反射顯微鏡( total interreflection microscopy，

9、TIRM)進(jìn)行單色成像( 圖1d) ，之后切開(kāi)熒光染料和抑制基團(tuán)，洗滌，加帽，允許下一個(gè)核苷酸的摻入( 圖1e) 。通過(guò)摻入、檢測(cè)和切除的反復(fù)循環(huán)，就可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)序。 由于該技術(shù)采用了Cy5 ( 吲哚-5-菁) 熒光基團(tuán)( 具有很好的光穩(wěn)定性、高水溶性和高熒光效率，激發(fā)波長(zhǎng)在647nm 處) 和靈敏的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠直接記錄到單個(gè)堿基的熒光，從而克服了其他方法須同時(shí)測(cè)數(shù)千個(gè)相同基因片段以增加信號(hào)亮度的缺陷。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1、該平臺(tái)文庫(kù)制備簡(jiǎn)單，不需要PCR 擴(kuò)增或連接酶，特別適合RNA 直接測(cè)序的應(yīng)用。 2、該公司HeliScope 測(cè)序儀的優(yōu)勢(shì)是樣本通量非常高，2個(gè)流動(dòng)槽可同時(shí)運(yùn)行，每個(gè)流動(dòng)

10、槽有25 個(gè)獨(dú)立通道，每個(gè)通道又可以運(yùn)行最多96個(gè)標(biāo)記分子條形碼的樣本，這樣每次運(yùn)行的樣本數(shù)可高達(dá)4 800 個(gè)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 測(cè)序的平均讀長(zhǎng)相對(duì)較短，只有35 bp，準(zhǔn)確率較低，約為97%，還有待于進(jìn)一步的改進(jìn)。1 2 單分子實(shí)時(shí)合成測(cè)序技術(shù) Helicos Biosciences 公司雖然第一個(gè)成功的開(kāi)發(fā)了單分子測(cè)序技術(shù)，但是將該技術(shù)成功進(jìn)行商業(yè)化的是Pacific Biosciences 公司推出的單分子實(shí)時(shí)DNA 測(cè)序儀( SMRT) 。 SMRT 技術(shù)是基于邊合成邊測(cè)序的思想，以SMRT芯片為載體進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。SMRT 芯片是一種帶有很多零模式波導(dǎo)孔( ZMW) ( 厚度為100 n

11、m) 的金屬片，ZMW 是一種直徑只有幾十個(gè)納米的孔，由于其底部上的小孔短于激光的單個(gè)波長(zhǎng)，導(dǎo)致激光無(wú)法直接穿過(guò)小孔，而會(huì)在小孔處發(fā)生光的衍射，形成局部發(fā)光的區(qū)域，即為熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)( 圖2a中的白色區(qū)域) ，該區(qū)域內(nèi)錨定有DNA 聚合酶。測(cè)序時(shí)將基因組的DNA 打斷成許多小的片段，制成液滴后將其分散到不同的ZMW 納米孔中。當(dāng)ZMW 孔底部聚合反應(yīng)發(fā)生時(shí)，被不同熒光標(biāo)記的核苷酸會(huì)在小孔的熒光探測(cè)區(qū)域中被聚合酶滯留數(shù)十毫秒，熒光標(biāo)記會(huì)在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP 的種類，反應(yīng)完成后熒光標(biāo)記會(huì)被聚合酶切除而彌散出ZMW 小孔，其它未參與合成的dNTP 由于沒(méi)進(jìn)入熒光

12、信號(hào)檢測(cè)區(qū)而不進(jìn)入熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。 、 SMRT 測(cè)序時(shí)，樣品準(zhǔn)備過(guò)程涉及到樣品DNA 的打斷、末端補(bǔ)齊、連接接頭、測(cè)序這幾個(gè)步驟。測(cè)序中需要的樣品量很少，樣品準(zhǔn)備中所用的試 劑也很少，而且測(cè)序過(guò)程中省去掃描和洗滌的過(guò)程，所以測(cè)序所花的時(shí)間較少。 優(yōu)點(diǎn)：長(zhǎng)讀長(zhǎng)( Long reads) 可以幫助研究者對(duì)變異進(jìn)行更準(zhǔn)確的定位。另外，該平臺(tái)通量高、費(fèi)用較低、耗時(shí)短。 缺點(diǎn)：會(huì)出現(xiàn)插入和缺失錯(cuò)誤1 3 納米孔單分子技術(shù) Oxford Nanopore Technologies 公司研發(fā)的測(cè)序技術(shù)完全不同于前兩種測(cè)序技術(shù)，其核心就是將在某一面上含有一對(duì)電極的特殊的脂質(zhì)雙分子層置于一個(gè)微孔之上，該雙分子

13、層中含有很多由 溶血素蛋白組成的納米孔中結(jié)合一個(gè)核酸外切酶。當(dāng)DNA 模板進(jìn)入孔道時(shí)，孔道中的核酸外切酶會(huì)“抓住”DNA 分子，順序剪切掉穿過(guò)納米孔道的DNA堿基，每一個(gè)堿基通過(guò)納米孔時(shí)都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)阻斷，根據(jù)阻斷電流的變化就能檢測(cè)出相應(yīng)堿基的種類，最終得出DNA 分子的序列。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：儀器構(gòu)造簡(jiǎn)單使用成本低廉; 因?yàn)樗恍枰獙?duì)核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，也不需要復(fù)雜的光學(xué)探測(cè)系統(tǒng)( 如激光發(fā)射器和CCD信號(hào)采集系統(tǒng)等) ，能直接對(duì)RNA 分子進(jìn)行測(cè)序。同時(shí)由于它是直接檢測(cè)每一個(gè)堿基的特征性電流，因而能對(duì)修飾過(guò)的堿基進(jìn)行測(cè)序，這一點(diǎn)對(duì)于表觀遺傳學(xué)研究具有極高的價(jià)值。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：它采用的是水解測(cè)序法，不能進(jìn)行重

14、復(fù)測(cè)序，因而無(wú)法達(dá)到一個(gè)滿意的測(cè)序精確度。2、單分子測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用2 1 基因組測(cè)序2 2 甲基化研究2 3 突變鑒定( SNP 檢測(cè))2 4 RNA 測(cè)序2 5 重復(fù)序列和poly 結(jié)構(gòu)的測(cè)序2 1 基因組測(cè)序 由于具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)的特點(diǎn)，SMRT 測(cè)序平臺(tái)在基因組測(cè)序中能降低測(cè)序后的Contig 數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量，節(jié)省大量的時(shí)間。Christophern 等僅僅用0. 5 的PacBio RS 系統(tǒng)長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)與38 的二代測(cè)序( NGS) 的測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)馬達(dá)加斯加的一種指猴基因組進(jìn)行拼裝，大幅度提高了數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整度，同時(shí)借助Pacbio RS 的幫助將原有的Con

15、tig 數(shù)量減少了10 倍。David A. 等利用PacBioRS 平臺(tái)和C2 試劑通過(guò)全球合作幾天內(nèi)就完成了從德國(guó)大腸桿菌疫情中獲得的大腸桿菌樣品以及近似菌株的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，最終獲得了2 900bp 的平均讀長(zhǎng)以及99. 998% 的一致性準(zhǔn)確度。在對(duì)霍亂病菌的研究中，第三代測(cè)序技術(shù)已初現(xiàn)鋒芒。研究人員對(duì)5 株霍亂菌株的基因組進(jìn)行了測(cè)序研究，并與其他23 株霍亂弧菌的基因組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海地霍亂菌株與2002 年和2008 年在孟加拉國(guó)分離得到的變異霍亂弧菌El Tor O1 菌株之間關(guān)系密切，而與1991 年拉丁美洲霍亂分離株的關(guān)系較遠(yuǎn)。相對(duì)NGS 的優(yōu)勢(shì)就是能更快獲得結(jié)果，因此該

16、系統(tǒng)在鑒定新的病原體和細(xì)菌的基因組測(cè)序方面得到很廣泛的應(yīng)用。2 2 甲基化研究 SMRT 技術(shù)采用的是對(duì)DNA 聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法，聚合酶合成每一個(gè)堿基，都有一個(gè)時(shí)間段，而當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來(lái)，使帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個(gè)位置有修飾。甲基化研究中關(guān)于5-mC 和5-hmC( 5-mC 的羥基化形式) 是甲基化研究中的熱點(diǎn)。但現(xiàn)有的測(cè)序方法無(wú)法區(qū)分5-mC 和5-hmC。美國(guó)芝加哥大學(xué)利用SMRT 測(cè)序技術(shù)和5-hmC 的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來(lái)高通量檢測(cè)5-hmC。通過(guò)聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息，可直

17、接檢測(cè)到DNA 甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC 和5-hmC，為表觀遺傳學(xué)研究打開(kāi)了一條通路。2 3 突變鑒定( SNP 檢測(cè)) 單分子測(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且沒(méi)有PCR 擴(kuò)增步驟，就沒(méi)有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤，該優(yōu)勢(shì)使其在特定序列的SNP 檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定中大顯身手。例如在醫(yī)學(xué)研究中，對(duì)于FLT3 基因是否是急性髓細(xì)胞白血病( AML) 的有效治療靶標(biāo)一直存在質(zhì)疑。研究人員用單分子測(cè)序分析耐藥性患者基因，意外發(fā)現(xiàn)耐藥性與FLT3 基因下游出現(xiàn)的稀有新突變有關(guān)，重新證明了FLT3 基因是這種最常見(jiàn)白血病-急性髓細(xì)胞白血病( AML) 的有效治療靶標(biāo)，打破了一直以來(lái)對(duì)于

18、這一基因靶標(biāo)的疑惑。憑借PacBio 平均3 000bp的讀長(zhǎng)，獲得了更多基因下游的寶貴信息，而基于單核酸分子的測(cè)序能夠檢測(cè)到低頻率( 低至1%) 罕見(jiàn)突變，正是這項(xiàng)成果的關(guān)鍵所在。2.4 RNA 測(cè)序 根據(jù)三代測(cè)序技術(shù)實(shí)時(shí)測(cè)序的特點(diǎn)，可以直接對(duì)RNA 進(jìn)行測(cè)序，做到了對(duì)特定組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異的精確定位。運(yùn)用Helicos 操作平臺(tái)對(duì)酵母的聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行精確定量，用50 個(gè)通道中的6個(gè)通道，共產(chǎn)生2 4 億個(gè)Reads。利用Helicos 遺傳分析平臺(tái)可以將DNA 聚合酶換成反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA 直接測(cè)序，主要通過(guò)Poly( dT) 包被的表面捕獲聚腺苷酸化的RNA，成功完成對(duì)釀酒酵母RNA 的直接測(cè)序，免除將RNA 轉(zhuǎn)變成cDNA 的過(guò)程。同時(shí)借助PacBio 技術(shù)平臺(tái)，也可完成對(duì)RNA 的直接測(cè)序，Uemura 等就利用該技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)序觀察核糖體中mRNA 的翻譯過(guò)程。單分子測(cè)序技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)，也是最直接的應(yīng)用就是檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)基因表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)基因的結(jié)構(gòu)做出分析，如RNA 的剪接，是否有堿基突變或異常表達(dá)基因等。而且還能檢測(cè)到微量的基因表達(dá)子或罕見(jiàn)的非編碼RNA。PacBio RS 還可對(duì)連續(xù)的A 或者T 區(qū)域測(cè)序，因?yàn)镻olyA 長(zhǎng)度和RNA 的半衰期有關(guān)，所以對(duì)長(zhǎng)PolyA 的研究對(duì)