生物化學(xué)第三章核酸化學(xué)PPT課件

1、第三章第三章 核酸化學(xué)核酸化學(xué)1. 核酸的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)核酸的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)及其性質(zhì) 2. 核酸的測定方法核酸的測定方法 3. 核酸的研究技術(shù)核酸的研究技術(shù)重點：重點：1. rna. dna一級結(jié)構(gòu)的測定原理與方法一級結(jié)構(gòu)的測定原理與方法 2.雙螺旋結(jié)構(gòu)要點，三葉草結(jié)構(gòu)要點雙螺旋結(jié)構(gòu)要點，三葉草結(jié)構(gòu)要點 3. 核酸研究的常用技術(shù)及應(yīng)用核酸研究的常用技術(shù)及應(yīng)用 4. 核酸含量的測定原理與方法核酸含量的測定原理與方法難點：難點：1. dna一級結(jié)構(gòu)測定的原理與方法一級結(jié)構(gòu)測定的原理與方法 2. 核苷酸的兩性離解核苷酸的兩性離解 3. 雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點教學(xué)目的教學(xué)目的186818

2、68年，年，f. miescherf. miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。and可分離可分離核酸的種類和分布核酸分為兩大類：核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid deoxyribonucleic acid （dnadna） 核糖核酸核糖核酸 ribonucleic acidribonucleic acid（rnarna） 98 98核中（染色體）核中（染色體） 真核真核 線粒體（線粒體（mtdnamtdna） 核外核外 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidpla

3、smid） 葉綠體（葉綠體（ctdnactdna）dna dna 擬核擬核 原核原核 核外：質(zhì)粒（核外：質(zhì)粒（plasmidplasmid） 病毒：病毒：dnadna病毒病毒 mrna (5%) mrna (5%) 真核真核 trna (10-15%)trna (10-15%) rrna rrna（80%80%） snrna(snrna(核內(nèi)）核內(nèi)） srna snorna(srna snorna(核仁）核仁）rna mrna scrna(rna mrna scrna(胞內(nèi)胞內(nèi)) ) 原核原核 trnatrna rrna rrna 病毒：病毒：rnarna病毒病毒核酸的功能核酸的功能1、dna

4、是遺傳信息的載體是遺傳信息的載體2、rna的功能的功能 參與遺傳與進(jìn)化參與遺傳與進(jìn)化 參與蛋白質(zhì)的生物合成參與蛋白質(zhì)的生物合成 參與參與rna轉(zhuǎn)錄后的加工修飾轉(zhuǎn)錄后的加工修飾 參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)參與基因表達(dá)調(diào)節(jié) 催化等催化等第一節(jié)第一節(jié) 核酸的組成成分核酸的組成成分一一. .元素組成元素組成c h o n p(9%-9.9%) c h o n p(9%-9.9%) 核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸堿基堿基戊糖戊糖嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶核糖核糖脫氧核糖脫氧核糖核酸酶核酸酶核苷酸酶核苷酸酶核苷酶核苷酶鳥嘌呤鳥嘌呤腺嘌呤腺嘌呤尿嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶rna:p-9%,dna:p-9.9%

5、核酸的組成單位：核苷酸核酸的組成單位：核苷酸核酸的組成成分：堿基，戊糖，磷酸核酸的組成成分：堿基，戊糖，磷酸二二. . 組成成分及組成單位組成成分及組成單位 （一）、戊糖（一）、戊糖組成核酸的戊糖有兩種。組成核酸的戊糖有兩種。dna所含的糖為所含的糖為 -d-2-脫氧核糖；脫氧核糖；rna所含的糖則為所含的糖則為-d-核糖。核糖。ohhohhohohhhoch2hoch2ohhohhhohhd-核糖d-2-脫氧核糖nnnhnnh2腺嘌腺嘌a(bǔ)deninenhnnhnonh2鳥嘌呤鳥嘌呤guanine尿嘧啶尿嘧啶uracilnhnhoo胞胞嘧啶嘧啶cytidinennhnh2onhnhooh3c胸

6、胸腺嘧啶腺嘧啶thy核苷核苷 戊糖戊糖+ +堿基堿基 糖與堿基之間的糖與堿基之間的c-nc-n鍵，稱為鍵，稱為c-nc-n糖苷鍵糖苷鍵(oh)(oh)胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鳥嘌呤核苷腺嘌呤核苷nnohhonnnh2honnohh2nnnnnnnnh2ohhohhohhhoch2hoch2ohhohhohhohhohhohhhoch2ohhohhohhhoch2胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鳥嘌呤核苷腺嘌呤核苷nnohhonnnh2honnohh2nnnnnnnnh2ohhohhohhhoch2hoch2ohhohhohhohhohhohhhoch2ohhohhohhhoch2腺嘌呤脫氧核苷腺嘌呤脫氧核苷鳥

7、嘌呤脫氧核苷鳥嘌呤脫氧核苷胸腺嘧啶脫氧核苷胸腺嘧啶脫氧核苷胞嘧啶脫氧核苷胞嘧啶脫氧核苷hhhhch3（四）、核苷酸（四）、核苷酸（nucleotide）h（五）（五）.核苷酸衍生物核苷酸衍生物1.1.繼續(xù)磷酸化繼續(xù)磷酸化o-poo-nnnnn h2ohho hho hho c h2o-poo-o-poo-三磷酸腺苷 (atp)ampadpatp核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。2.稀有堿基稀有堿基ohohohohnhnh2 2chch3 3+ +7-7-甲基鳥苷

8、甲基鳥苷 m m7 7g g取代核苷的表示方式取代核苷的表示方式oh次黃苷（肌苷）次黃苷（肌苷）i黃嘌呤核苷黃嘌呤核苷 x二氫尿嘧啶核苷二氫尿嘧啶核苷 dohohohohohohohohohohohohohohoh3.3.環(huán)化磷酸化環(huán)化磷酸化l campl cgmp4.4.肌苷酸及鳥苷酸肌苷酸及鳥苷酸( (強(qiáng)力味精強(qiáng)力味精) )imp gmp第二節(jié)、第二節(jié)、rnarna的分子的分子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)一、一、 rnarna的一級結(jié)構(gòu)的一級結(jié)構(gòu)（一）連接方式（一）連接方式55335pdapdcpdgpdtoh 3 5papcpgpuoh 或5acgtgcgt 3 5acguaugu 3 acgtgcgt a

9、cguaugut53oh u53oh l5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5-p5-p表示）；表示）；3-3-羥基端（常用羥基端（常用3-oh3-oh表表示）示）l多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時，必須多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是注明它的方向是5353或是或是3535。多聚核苷酸的表示方式多聚核苷酸的表示方式dnarna(二二)、rna的降解的降解1、rna的化學(xué)降解的化學(xué)降解n堿降解：堿降解：rna用稀堿降解產(chǎn)物為用稀堿降解產(chǎn)物為2-核苷酸和核苷酸和3-核苷酸混合物。核苷酸混合物。dna抗堿抗堿(高溫不抗堿高溫不抗堿)n酸降解：水解速度酸

10、降解：水解速度 糖苷鍵糖苷鍵脂鍵脂鍵 嘌呤糖苷鍵嘌呤糖苷鍵 嘧啶糖苷鍵嘧啶糖苷鍵 脫氧核糖糖苷鍵脫氧核糖糖苷鍵核糖糖苷鍵核糖糖苷鍵 n在低溫的酸性條件下在低溫的酸性條件下dna，rna則穩(wěn)定則穩(wěn)定2.酶法降解酶法降解核酸酶有核酸酶有:外切酶，內(nèi)切酶和磷酸酯酶外切酶，內(nèi)切酶和磷酸酯酶 牛胰牛胰rnasei 產(chǎn)物：產(chǎn)物：3-嘧啶核苷酸（結(jié)尾）嘧啶核苷酸（結(jié)尾） 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 rnase t1 產(chǎn)物：產(chǎn)物：3-鳥嘌呤核苷酸（結(jié)尾）鳥嘌呤核苷酸（結(jié)尾） rnase u2 產(chǎn)物：產(chǎn)物：3-嘌呤核苷酸（結(jié)尾）嘌呤核苷酸（結(jié)尾） spdase (牛脾牛脾) 5-端開始，產(chǎn)物：端開始，產(chǎn)物：3-核苷酸核苷酸

11、外切酶外切酶 vpdase (蛇毒蛇毒)3-端開始，產(chǎn)物：端開始，產(chǎn)物：5-核苷酸核苷酸 磷酸單酯酶（磷酸單酯酶（pnase） 5-磷酸磷酸 （一）（一）rna的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)二二.rna的高級結(jié)構(gòu)的高級結(jié)構(gòu)占占rna總量的總量的15一種氨基酸對應(yīng)最少一種一種氨基酸對應(yīng)最少一種rna分子量分子量25000左右，大約由左右，大約由7090個核苷酸組成，沉降系數(shù)為個核苷酸組成，沉降系數(shù)為4s左右。左右。l分子中含有較多的修飾成分。分子中含有較多的修飾成分。l3-末端都具有末端都具有cpcpaoh的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。1.特點特點2.三葉草結(jié)構(gòu)要點三葉草結(jié)構(gòu)要點（二）（二）trnatrna的三級結(jié)構(gòu)的

12、三級結(jié)構(gòu)第三節(jié)第三節(jié) dnadna的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)及測定一級結(jié)構(gòu)及測定1.加減法加減法atgctgatgctg33555533atgctgatgctg335555tacgactacgactacgatacgatactactacgtacgtatat tdnadna聚合酶聚合酶4 4種種dntp(dntp(一種為一種為- -3232p-p-標(biāo)記）標(biāo)記）模板模板引物引物atgctgatgctg335555tacgactacgactacgatacgatactactacgtacgtatat t+a+a-t-t-c-c-g-g-a-a+t+t+c+c+g+gtacgatacgatatatacgt

13、acgtacgactacgactactact ttacgtacgt ttactactacgatacgatata+a+a +g+g +c+c-g-g+t+t-a-a-c-c -t-t電電泳泳方方向向讀讀帶帶方方向向新合成鏈的新合成鏈的5 35 32.2.雙脫氧法雙脫氧法atgctgatgctg33555533dnadna聚合酶聚合酶4 4種種dntp(dntp(一種為一種為- -3232p-p-標(biāo)記）標(biāo)記）+ddatp+ddatp+ddttp+ddttp+ddctp+ddctp+ddgtp+ddgtptacgddatacgddatddatddatacgaddctacgaddctaddctaddc

14、tacddgtacddgddtddt33tacgactacgactacgatacgatactactacgtacgtatat t+dda+dda+ddt+ddt+ddc+ddc+ddg+ddgdntpdntpddntpddntp的比例最好為的比例最好為1 1100100 3.化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法修飾及斷裂條件修飾及斷裂條件堿基堿基修飾試劑修飾試劑 斷裂條件斷裂條件a+ga+gg gt+ct+cc c甲酸甲酸硫酸二甲酯硫酸二甲酯肼肼肼肼+ +鹽鹽哌啶哌啶加熱加熱哌啶哌啶哌啶哌啶被測定鏈的被測定鏈的5 35 3二二.dna.dna的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)2.0 nm小小溝溝大大溝溝要點：要點：1.1.多

15、核苷酸鏈的走向多核苷酸鏈的走向2.2.螺旋的角度螺旋的角度. .高度高度. .直徑直徑3.3.堿基分布及配對規(guī)律堿基分布及配對規(guī)律4.4.作用力作用力（一）雙螺旋提出的基礎(chǔ)（一）雙螺旋提出的基礎(chǔ)（二）雙螺旋結(jié)構(gòu)要點（二）雙螺旋結(jié)構(gòu)要點雙螺旋雙螺旋dnadna的結(jié)構(gòu)參數(shù)的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型類型旋轉(zhuǎn)方向旋轉(zhuǎn)方向結(jié)晶狀態(tài)結(jié)晶狀態(tài)螺旋直徑螺旋直徑（nm）螺距螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目對數(shù)目堿基對間堿基對間垂直距離垂直距離（nm）堿基旋轉(zhuǎn)角堿基旋轉(zhuǎn)角度度adnabdnac- dnazdna右右75%na+右右92%na +右右66%li +左左 人工合成人工合成2.02.31.921.82.83.43

16、.14.511109.3120.2550.340.330.2732.73638-60（三）雙螺旋的結(jié)構(gòu)類型（三）雙螺旋的結(jié)構(gòu)類型 （四）左旋（四）左旋dnadnaz-dnaz-dna要點要點1.左旋鋸齒狀左旋鋸齒狀2.堿基向外堿基向外3.只有小溝只有小溝4.12bp，4.56nm（五）（五）. .絞鏈絞鏈dnadna（hing-dna hing-dna 即即h-dnah-dna要點要點 ：1.1.三聯(lián)體堿基配對方式三聯(lián)體堿基配對方式2.2.第三鏈位于大溝中第三鏈位于大溝中3.3.兩條鏈反平行排列兩條鏈反平行排列4.4.酸性酸性phph或負(fù)超螺旋張力下或負(fù)超螺旋張力下 b-dna h-dnab-

17、dna h-dna三、三、dnadna的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)dnadna雙螺旋的進(jìn)一步扭雙螺旋的進(jìn)一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)。曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)。 正超螺旋正超螺旋 負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋雙鏈線性雙鏈線性dnadna（dsdnadsdna）如真核生物如真核生物雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀dnadna（dcdnadcdna）如細(xì)菌、質(zhì)粒如細(xì)菌、質(zhì)粒單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀dnadna（scdnascdna）如病毒、噬菌體如病毒、噬菌體單鏈線性單鏈線性dnadna（ssdnassdna）如病毒、噬菌體如病毒、噬菌體連環(huán)數(shù)（連環(huán)數(shù)（linking numberlinking number）：在雙螺旋）：在雙螺旋dnadna中，一條鏈以右

18、手螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)繞另一條鏈纏繞的次數(shù). .以以“l(fā)”l”表示。表示。超螺旋數(shù)或纏繞數(shù)（超螺旋數(shù)或纏繞數(shù)（writhing numberwrithing number）：右手超螺旋為正，）：右手超螺旋為正，左手超螺旋為負(fù)。以左手超螺旋為負(fù)。以“w”w”表示。表示。扭轉(zhuǎn)數(shù)（扭轉(zhuǎn)數(shù)（twsting numbertwsting number）：）：dnadna分子中的雙螺旋數(shù)。以分子中的雙螺旋數(shù)。以“t”t”表示。表示。l=t+wl=t+w第四節(jié)第四節(jié) 核酸及核苷酸的性質(zhì)核酸及核苷酸的性質(zhì)一、溶解性一、溶解性dna在在ph4.2時溶解度最低。時溶解度最低。rna在在ph2

19、-2.5時溶解度最低。時溶解度最低。1.水溶水溶性性微微 溶于水，不溶于有機(jī)溶劑溶于水，不溶于有機(jī)溶劑,水中水中溶解度溶解度dna達(dá)達(dá)2%，rna達(dá)達(dá)4%2.鹽溶性鹽溶性dna-蛋白，溶于蛋白，溶于1mol/l nacl ，低鹽不溶。，低鹽不溶。 rna-蛋白，溶于蛋白，溶于0.14mol/l nacl ，高鹽不溶。，高鹽不溶。3.不同不同ph的溶解性的溶解性二二. .兩性性質(zhì)兩性性質(zhì)1.1.腺嘌呤腺嘌呤2.2.鳥嘌呤鳥嘌呤: :4.4.尿嘧啶尿嘧啶 胸腺嘧啶胸腺嘧啶3.3.胞嘧啶胞嘧啶三、核酸的紫外吸收特性三、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有嘌呤堿和嘧

20、啶堿具有共軛雙鍵體系，因而共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在收光譜，一般在260nm260nm左右有最大吸收峰，左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組可以作為核酸及其組份定性和定量測定的份定性和定量測定的依據(jù)。依據(jù)。以以a a260260/a/a280280進(jìn)行定性、進(jìn)行定性、定量定量dnadna和和rnarna溶液中加入溶液中加入溴化乙錠（溴化乙錠（ebeb），在），在紫外下發(fā)出熒光紫外下發(fā)出熒光四、核酸的變性與復(fù)性四、核酸的變性與復(fù)性（一）（一）. . 變性變性變性變性: :穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過空

21、間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)( (堿基順序堿基順序) )保持不變。保持不變。變性表征變性表征: : 生物活性部分喪失、粘度下降、生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）色效應(yīng)）變性因素變性因素: : phph（11.311.3或或5.05.0）變性劑（脲、）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛），低離子強(qiáng)度甲酰胺、甲醛），低離子強(qiáng)度 加熱加熱熱變性和熱變性和t tm m : :dnadna的變性過程的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的

22、增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用t tm m表示。表示。 一般一般dnadna的的t tm m值在值在70-8570-85 c c之間。之間。dnadna的的t tm m值與分子中的值與分子中的g g和和c c的的含量有關(guān)。含量有關(guān)。g g和和c c的含量高，的含量高，t tm m值高。因而測定值高。因而測定tmtm值，可反映值，可反映dnadna分分子中子中g(shù), cg, c含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（g+c)%=(tm-69.3)g+c)%=(tm-69.3)* *2.442.44（二）（二）. .

23、核酸的復(fù)性核酸的復(fù)性變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為的過程稱為復(fù)性復(fù)性。dnadna復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的將熱變性的dnadna驟然冷卻至低溫時，驟然冷卻至低溫時，dnadna不可能復(fù)性。變性的不可能復(fù)性。變性的dnadna緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火退火”。 退火溫度退火溫度t tm m2525復(fù)性影響因素復(fù)性影響因素 片段濃度

24、片段濃度/ /片段大小片段大小/ /片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ / 純度純度/ /溶液離子強(qiáng)度溶液離子強(qiáng)度 （三）（三）. . 核酸的復(fù)性與分子雜交核酸的復(fù)性與分子雜交退火退火復(fù)性復(fù)性雜交雜交變性變性兩個不同來源兩個不同來源的的dna分子分子第五節(jié)第五節(jié) 核酸及其組分的分離純化與測定核酸及其組分的分離純化與測定一一. .分離純化的一般原則分離純化的一般原則1.1.防止核酸酶降解防止核酸酶降解2.2.防止化學(xué)因素降解防止化學(xué)因素降解3.3.防止物理因素降解防止物理因素降解二二.dna.dna的分離純化的分離純化三三.rna.rna的分離純化的分離純化四四. .核酸組分

25、的分離純化核酸組分的分離純化 破細(xì)胞（破細(xì)胞（1mol/lnacl1mol/lnacl） 離心去沉淀（含離心去沉淀（含rna-prrna-pr） 上清（含上清（含dna-prdna-pr） sdssds法法/ /酚法（去蛋白）酚法（去蛋白） 離心去沉淀（變性蛋白）離心去沉淀（變性蛋白） 上清（含上清（含dnadna） 乙醇沉淀乙醇沉淀 離心收集沉淀（離心收集沉淀（dnadna） 細(xì)胞（飽和酚處理）細(xì)胞（飽和酚處理）離心去沉淀（含離心去沉淀（含dna-prdna-pr）上清液調(diào)節(jié)上清液調(diào)節(jié)pipi（rna pirna pi） 離心去上清離心去上清收集沉淀（總收集沉淀（總rnarna）不同的不同的

26、rnarna分離時可用：分離時可用： deae-sephadexdeae-sephadex 超離心超離心 olig-dt olig-dt 親和層析親和層析1.1.離子交換法：離子交換法：四種核苷酸之間的分離采用離子交換法四種核苷酸之間的分離采用離子交換法 陽離子交換劑洗脫次序：陽離子交換劑洗脫次序：理論次序理論次序 u g a cu g a c實際次序?qū)嶋H次序 u g c au g c a陰陰離子交換劑洗脫次序：離子交換劑洗脫次序：理論次序理論次序 c a g uc a g u實際次序?qū)嶋H次序 c a u gc a u g2.凝膠過濾法凝膠過濾法: :堿基堿基, ,核苷核苷, ,核苷酸之間的分

27、離采用核苷酸之間的分離采用sephadex-g10/g25sephadex-g10/g25洗脫次序：核苷酸洗脫次序：核苷酸 核苷核苷 堿基堿基核苷一磷酸核苷一磷酸, ,核苷二磷酸核苷二磷酸, ,核苷三磷酸的分離采用柱層析和核苷三磷酸的分離采用柱層析和薄層層析法分離薄層層析法分離. . 柱層析洗脫次序柱層析洗脫次序 amp adp atpamp adp atp 薄層層析遷移次序薄層層析遷移次序 amp adp atpamp adp atp3.deae-3.deae-纖維素法纖維素法: : 五五.核酸及其組分含量的核酸及其組分含量的測定與純度測定測定與純度測定（一）（一）. .核酸含核酸含 量的測

28、定方法量的測定方法1.1.紫外吸收法紫外吸收法1ug/ml dna a1ug/ml dna a260260 = 0.02 1a = 0.02 1a260260 = 50 ug/ml dna = 50 ug/ml dna1ug/ml rna a1ug/ml rna a260260 = 0.022-0.024 1a = 0.022-0.024 1a260260 = 40 ug/ml rna = 40 ug/ml rna2.2.定糖法定糖法 (20-250ug rna,40-400ug dna)(20-250ug rna,40-400ug dna)苔黑酚法：苔黑酚苔黑酚法：苔黑酚+ +核糖核糖+ +

29、濃濃hcl+feclhcl+fecl3 3 綠色綠色 a a670-680670-680二苯胺法：二苯胺二苯胺法：二苯胺+ +脫氧核糖脫氧核糖+ +濃濃h h2 2soso4 4 藍(lán)色藍(lán)色 a a595-620595-6203.3.定磷法定磷法 (10-100ug (10-100ug 核酸核酸) )4.4.凝膠電泳凝膠電泳eb( 0.5ug/ml)eb( 0.5ug/ml)染色染色, , 最小檢出量最小檢出量1ng1ngvitcvitch h3 3popo4 4 + +鉬酸銨鉬酸銨 黃色磷鉬酸銨黃色磷鉬酸銨 磷鉬藍(lán)磷鉬藍(lán) a a650-660650-660（二）（二）. 核酸純度的核酸純度的測

30、定測定1.1.紫外吸收法紫外吸收法測定測定a260與與a280a260a280=1.8-2.01.8-2.0dna:dna:2.2.凝膠電泳凝膠電泳3.3.等密度梯度離心等密度梯度離心2.02.0rna:rna:a260a280凝膠電泳凝膠電泳等密度梯度離心等密度梯度離心第六節(jié)第六節(jié)核酸研究的常用技術(shù)核酸研究的常用技術(shù)一一.dna.dna的凝膠電泳的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳1.1.瓊脂糖凝膠濃度及選擇瓊脂糖凝膠濃度及選擇2.2.瓊脂糖凝膠電泳的分辨率瓊脂糖凝膠電泳的分辨率3.3.瓊脂糖凝膠電泳的用途瓊脂糖凝膠電泳的用途( (分離分離, ,測量測量, ,回收回收, ,印跡

31、印跡) )（二）（二）pagepage電泳電泳1. page1. page濃度及選擇濃度及選擇2. page2. page電泳的分辨率電泳的分辨率3.page3.page電泳的用途電泳的用途（三）影響凝膠電泳（三）影響凝膠電泳r rf f值的因素值的因素1.1.分子大小分子大小 2.2.分子構(gòu)象分子構(gòu)象 3.3.凝膠濃度凝膠濃度4.4.電流電壓電流電壓 5.5.溫度溫度二二. .印跡技術(shù)與分子雜交印跡技術(shù)與分子雜交（一）（一）. .印跡技術(shù)印跡技術(shù)概念概念: :核酸的雜交中，經(jīng)過凝膠電泳分離的核酸的雜交中，經(jīng)過凝膠電泳分離的dna/rnadna/rna分子，雜交分子，雜交之前通過毛細(xì)管吸附作用

32、之前通過毛細(xì)管吸附作用/ /電導(dǎo)作用將凝膠中電導(dǎo)作用將凝膠中dna/rnadna/rna分子原封分子原封不動地轉(zhuǎn)移到濾膜上。不動地轉(zhuǎn)移到濾膜上。濾膜濾膜: :硝酸纖維素濾膜，硝酸纖維素濾膜， deae-deae-纖維素濾膜纖維素濾膜印跡種類印跡種類: :southern blotting:southern blotting:（19751975）northern blotting:northern blotting:（19791979，alwine)alwine)（19791979，towbin,immunoblotting-western;1982, reihart,eastern)towbin,immunoblotting-western;1982, reihart,eastern)電轉(zhuǎn)移技術(shù)電轉(zhuǎn)移技術(shù): :(1983,aubertin)(