提取RNA及用DEPC去除RNase的個(gè)人總結(jié)[精華]

1、快速的操作， 低溫環(huán)境， 少量取上清 主要是抽提之后吸取上清時(shí)要特別小心， 只要不把蛋白 層吸出來就不會(huì)有 RNase污染。 分子克隆第二版343頁,上關(guān)于提取RNA所用的玻璃容器的 處理方法，是用前180度干烤8小時(shí)或更長時(shí)間；另一種方法是0.1%的depc水浸泡（37度2 小時(shí) ）, 然后滅菌水淋快速的操作，低溫環(huán)境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清時(shí)要特別小心，只要不把蛋白層吸出來就不會(huì)有RNase污染。分子克隆第二版343頁,上關(guān)于提取RNA所用的玻璃容器的處理方法 ，是用前180度干烤8小 時(shí)或更長時(shí)間 ；另一種方法是 0.1%的 depc 水浸泡（37 度 2 小時(shí)）， 然后滅菌水

2、淋洗數(shù)次 ，100 度干烤15分鐘,然后高壓滅菌除去 depc.我們實(shí)驗(yàn)室一直是用 170度考4小時(shí)，且不準(zhǔn)離人， 不準(zhǔn)過夜 , 可能是怕烤箱長時(shí)間高溫 , 線路老化會(huì)發(fā)生危險(xiǎn)吧提取RNA所用的槍頭，EP管。直接高壓烘干即可。如果用 0.1 % DEPC處理，要在DEPC配置 后振搖1小時(shí)后再浸泡槍頭，EP管方有效。我做的都是將槍頭泡在配制好的depc中，搖振過夜，然后倒掉 depc 注意要到干凈，再高壓，為了防止仍殘留液體可 120度干烤一會(huì)A. 對(duì)于提取 RNA來說，我認(rèn)為關(guān)鍵的一點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備.包括從最初的標(biāo)本的制備，保存,以及之后的試劑的準(zhǔn)備，勻漿器，鑷子,tip頭的去除RNas

3、e處理，尤其是去除RNase的DEPC 處理步驟B. 您在處死大鼠前，先準(zhǔn)備好干凈的凍存管（用1.5ml的Ep管也可以，就是后面您在從液氮中 取出的時(shí)候容易爆 ， 您的注意安全 ）， 然后將去除的骨骼肌立即用干凈的剪刀分成半顆到一顆 黃豆大小 ， 裝入凍存管后立即投入液氮保存 . 個(gè)人認(rèn)為在這里使用裝標(biāo)本的管子沒必要用DEPC處理C. 在提取RNA之前，將試劑（TRIzol）和器械（tip頭，鑷子，勻漿器）都準(zhǔn)備好D. 從液氮取出標(biāo)本后，立即轉(zhuǎn)移進(jìn)入事先加入TRIzol的勻漿器內(nèi)（最好置冰上操作）,立即勻漿， 一直到標(biāo)本完全碾磨碎 ， 這個(gè)時(shí)候 TRIzol 液體成渾濁狀 ， 而且勻漿器的壁上

4、沒有太多的黏 附組織 ， 然后將 TRIzol 轉(zhuǎn)出 ， 繼續(xù)后續(xù)的步驟 .1 Rnase 是一種蛋白酶，能夠降解RNA。2我們的手上皮膚上有很多，應(yīng)該是對(duì)我們的身體起保護(hù)作用。保護(hù)不被RNA病毒感染？或者什么的。3這個(gè)酶高效穩(wěn)定。要么在DEPC水中處理n小時(shí)，要么在160度高溫烘烤6小時(shí)。此酶才會(huì) 失效。4所謂DEPC是一種叫做焦碳酸二乙酯的東西。有毒啊。所謂DEPC水, 一般指兩種狀態(tài)，a,配制 好未消毒；b,配制好已消毒。通過高壓消毒，該物質(zhì)會(huì)降解，從而無毒。1無菌蒸餾水中加入 0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC,室溫?cái)嚢?小時(shí)以上至完全溶解，高 壓滅菌20分鐘，冷卻備用。這個(gè)是D

5、EPC水的b狀態(tài)。2如果你要用DEPC水處理Tips等等東東，那么就要用高壓前的水，即DEPC水的a狀態(tài)。把槍頭管子等完全浸泡至少 8 小時(shí),我一般都是過夜的,或者平時(shí)就泡在里面?zhèn)溆?。RNA提取必須創(chuàng)造無 RNase的環(huán)境，所有儀器與試劑均按照以下方法進(jìn)行處理：研缽、研棒、藥匙、玻璃器皿等需在 180 C烘干4h以上； 電泳槽、膠板、梳子、用 0.1 %0.2%DEPC水 處理過夜或者用洗滌靈清洗干凈后用 0.5%的SDS （Sodium dodecyl sulfate ，抑制RNase的 活性）浸泡過夜，然后用 ddH2O沖洗干凈，晾干備用；離心管，槍頭等塑料器皿要用0.1%0.2%DEPC

6、水處理之后（DEPC有致癌之嫌，須小心操作）。37C保溫12h以上，然后高壓滅菌，滅活DEPC （ Diethypyrocarbonate ）;溶液都需用經(jīng) DEPC處理過的水配置，RNA提取的所有操作應(yīng)盡可能在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。我們研究所里提 RNA用的槍頭和EP管都是高壓兩遍的，沒有用DEPC水處理。1、有滅菌過的DEPC水，這一般是用來配 75%乙醇用，因?yàn)橐掖既舾邏簻缇鷷?huì)揮發(fā)，所以 乙醇是新開封專用的。2、沒有經(jīng)高壓滅菌的 DEPC水，這主要是用于配你提 RNA所用的其他試劑（所說的試劑是可以經(jīng)高壓滅菌的），總的來說，都得經(jīng)過高壓滅菌，目的就是要去除DEPC以防止它以隨后實(shí)驗(yàn)的干擾。3

7、、 DEPC處理水：無菌蒸餾水中加入0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC，室溫?cái)嚢?小時(shí)以 上， 121 度高壓滅菌 20 分鐘，冷卻備用。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。DEPC是 RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而 抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物，因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用 DEPC處理，加入DEPC至 0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘 存的DEPC否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞 mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng)

8、，因而 含Tris和DTT的試劑不能用 DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。 配制的溶液如不能高壓滅菌 ，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑 .為啥在 28s 之后還是有影影約約的片斷？和模糊的smear？這都與非變性電泳方式有關(guān)。 RNA 的電泳，嚴(yán)格講是要使用變性電泳的，我們平時(shí)所知道的 RNA 電泳的知識(shí)， 實(shí)際上都是由變性電泳獲得的。 但因?yàn)榉亲冃噪娪緦?shí)在是太方便了， 同時(shí)， 就一般檢測(cè)而言，完全可以替代變性電泳，所以我們?nèi)粘z測(cè)就都使用非變性電泳了。電泳時(shí)間太長了容易產(chǎn)生降解。最好是在120V左右。操作的時(shí)候有沒有注意戴口罩和手套，注意，手套

9、要經(jīng)常換，不要太節(jié)約了。那樣也會(huì)影響RNA的質(zhì)量。無論你是提什么 RNA只要是用異丙醇沉淀的，都得用 75的酒精洗滌一次。1 樣品不要太多，抽提務(wù)必充分，室溫放置 5min;2 200ul氯仿 劇烈振蕩20s，室溫放置 2- 15min;3 13000g 離心 15min;4 取上層水相 ， 一般 400-450ul 就足夠了，千萬不要貪多！ *5 加入 500ul 異丙醇 搖勻，室溫放置 10min；6 12000g 離心 10min ；7 75 乙醇 1000ul 洗滌沉淀；8 7500g 離心 5min ；（12000轉(zhuǎn)速太高了吧，沉淀不容易溶解的）9 棄乙醇，吸干凈殘余的微量乙醇， 室

10、溫干燥 3- 5min； （時(shí)間太久沉淀不易溶解）10適量DEPC水溶解沉淀。電泳的上樣量1ug,電泳buffer用DEPC處理的水配制，電泳時(shí)間不要太久，95V, 10- 15min 足夠了。建議跑RNA電泳。先用2%瓊脂糖膠，若分離效果不好，可用甲醛變性膠。在上樣緩沖液中 注意加入RNA酶抑制劑。注意觀察帶形，質(zhì)量較好的RNA亮度。28S:18S應(yīng)為2:1。還要注意觀察，在加樣孔或剛出加樣孔附近，有沒有帶，若有，可能為基因組 DNA污染。OD值只有1.5，可能為基因組 DNA虧染。參考一下分子克隆 3。上面有0D值與污染DNA的關(guān)系。建 議，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA羊品可用無RNA酶的DNA酶消化一下。注意該酶的 buffer 中有一種物質(zhì)在 0D260 有吸光度， 應(yīng)嚴(yán)格按照其 protocol 操作， 減少誤 差。只要用DEPC處理過的水，打開一瓶新的無水乙醇（或者專用于RNA的,即只用處理過的槍頭 取過乙醇的）配就可以了。DEPC高溫高壓時(shí)變成 C02和水，再加上乙醇也很容易氣化，可能是因?yàn)橛袣怏w產(chǎn)生吧， 如果蓋子太緊容易發(fā)生瓶子破掉的事情。 （我還從來沒有聽說過把乙醇 高溫滅菌過）而且，濕熱滅菌本身不足以去除RNA酶，所以我覺得有時(shí)候，滅菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦75%的乙醇用于提取 R