口服二苯基二硒對(duì)鎘致大鼠肝損傷的保護(hù)作用外文翻譯

1、外文資料譯文口服二苯基二硒對(duì)鎘致大鼠肝損傷的保護(hù)作用摘 要鎘是環(huán)境中一種與人類疾病有關(guān)的有毒金屬。本實(shí)驗(yàn)旨在探討二苯基二硒，(phse)2，對(duì)長(zhǎng)期暴露于氯化鎘（cdcl2）中的大鼠的影響。用cdcl2（10mol/kg，口服）和(phse)2（5mol/kg，口服）對(duì)成年雄性swiss大白鼠進(jìn)行30天的處理。許多參數(shù)被作為毒性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括肝腎損傷、血糖和糖原濃度以及氧化應(yīng)激標(biāo)志物。鎘含量、肝臟結(jié)構(gòu)、-氨基乙酰丙酸脫水酶（-丙氨酸-d）活性以及金屬硫蛋白（mt）也要進(jìn)行評(píng)價(jià)。染鎘大鼠組織中的鎘水平表明肝臟是鎘的主要靶器官，(phse)2也在其中發(fā)揮作用。肝臟中鎘濃度大概為腎臟的3倍，(ph

2、se)2使鎘暴露大鼠肝臟中這種金屬的含量降低了約60%。(phse)2能減輕鎘致大鼠發(fā)生的組織學(xué)損傷。鎘暴露使血液中丙二醛（mda）含量以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（ast）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alt）、堿性磷酸酶（alp）、乳酸脫氫酶（ldh）和-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ggt）活性升高，而(phse)2可使這種升高降低。(phse)2也可以降低鎘暴露增加的尿素和膽紅素水平?？傊?，本研究表明，(phse)2能減輕長(zhǎng)期鎘暴露所致的肝毒性和細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中(phse)2的作用機(jī)制是它的抗氧化性質(zhì)以及與鎘形成復(fù)合物的特性。關(guān)鍵詞：鎘，硒，二苯基二硒，肝損傷，氧化應(yīng)激1 前言由于煙草、工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，環(huán)境中鎘的含量不斷增加，已

3、成為主要的毒性化學(xué)物之一。它在人體內(nèi)的生物半衰期很長(zhǎng)（1030年），其毒性取決于接觸途徑、劑量及時(shí)間長(zhǎng)短。急性鎘中毒主要引起肝臟和睪丸損害，而慢性鎘中毒引起腎損傷。大鼠鎘中毒造成嚴(yán)重的肝損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死。鎘毒性作用的分子機(jī)制可能是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的紊亂和活性氧的產(chǎn)生。實(shí)際上，鎘是一種非氧化還原金屬，它總是采用一個(gè)單一的氧化狀態(tài)，而不是活性氧的誘導(dǎo)劑。鎘毒性作用主要因?yàn)殡娮觽鬟f鏈的破壞以及線粒體中活性氧物質(zhì)的蓄積。因此，有研究者認(rèn)為，抗氧化劑對(duì)有效治療鎘中毒有重要意義。有機(jī)硒化合物特別是二苯基二硒(phse)2的藥理研究發(fā)現(xiàn)，它的抗氧化性質(zhì)及金屬?gòu)?fù)合物的形成激發(fā)了它的作用機(jī)制，這也是

4、本實(shí)驗(yàn)討論的主要內(nèi)容。(phse)2的抗氧化性質(zhì)使其對(duì)不同組織的氧化損傷具有保護(hù)作用。鎘與(phse)2形成復(fù)合物的研究已經(jīng)見到報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)主要探討(phse)2對(duì)長(zhǎng)期鎘暴露下的大鼠的影響。2 材料與方法2.1 化學(xué)試劑氯化鎘（cdcl2）購(gòu)自默克公司（darmstadt，德國(guó)）；-氨基乙酰丙酸（-丙氨酸）和p-二甲基氨基苯甲醛購(gòu)自sigma（st.louis，mo，美國(guó)）；二苯基二硒，(phse)2，根據(jù)paulmier合成，hnmr和cnmr分析及光譜數(shù)據(jù)顯示其結(jié)構(gòu)正確。對(duì)(phse)2（99.9%）是由氣相色譜/高效液相色譜法測(cè)定其化學(xué)純度。所有其他試劑均為分析純，從標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)供應(yīng)商獲得

5、。2.2 動(dòng)物使用我們自己繁殖的成年雄性wistar大鼠（200-250g）。在一個(gè)單獨(dú)的動(dòng)物房飼養(yǎng)這些動(dòng)物，12h光/暗周期，222室溫，自由采食和飲水。這些動(dòng)物的使用是根據(jù)巴西圣瑪麗亞聯(lián)邦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源的護(hù)理和使用委員會(huì)所制定的準(zhǔn)則。2.3 實(shí)驗(yàn)方法大鼠每?jī)扇湛诜o藥cdcl2和(phse)2，使用強(qiáng)飼法，為期30天。每一實(shí)驗(yàn)組的6只大鼠要經(jīng)常測(cè)試。cdcl2（10mol/kg，溶解于生理鹽水，1ml/kg）進(jìn)行處理，30min后，用(phse)2（5mol/kg，溶解于菜籽油，1ml/kg）處理。(phse)2的劑量是根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)小組之前的研究。大鼠處理如下：第1組：生理鹽水+菜籽油；

6、第2組：cdcl2 10mol/kg+菜籽油；第3組：生理鹽水+(phse)2 5mol/kg；第4組：cdcl2 10mol/kg+(phse)2 5mol/kg。最后一次cdcl2注射24h后，直接從麻醉動(dòng)物的心室采集血液樣本。隨后，斷頭處死老鼠，摘除肝臟，迅速在ph值為7.5的50mm tris-hcl（1/10，w/v）中進(jìn)行組織勻漿，2400g離心15min。2.4 肝細(xì)胞損傷指標(biāo)用試劑盒測(cè)定血漿酶谷草轉(zhuǎn)氨酶（ast），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alt），堿性磷酸酶（alp），-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ggt），乳酸脫氫酶（ldh）水平。根據(jù)reitman和frankel使用的試劑盒（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，diagn

7、ostica s.a.，minas gerais，巴西），ifcc（國(guó)際臨床化學(xué)家聯(lián)合會(huì)）。2.4.1 膽紅素含量血漿總估計(jì)，根據(jù)malloy and evelyn對(duì)直接和間接膽紅素含量測(cè)定所用的試劑盒（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，diagnostica s.a.，minas gerais，巴西），通過分光光度計(jì)測(cè)定。2.5 腎損害的指標(biāo)使用試劑盒（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，diagnostica s.a.，minas gerais，巴西），通過測(cè)定血液中尿素和肌酐水平分析腎功能。2.6 血糖水平根據(jù)malloy and evelyn，對(duì)血糖含量用試劑盒（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，diagnostica s.a.，minas gerai

8、s，巴西），通過分光光度計(jì)測(cè)定。2.7 糖原測(cè)定肝糖原的含量測(cè)定使用krisman的方法。簡(jiǎn)單地說，一個(gè)已知量的肝臟在2ml 30%的koh溶液中溶解。再在試管中加2ml乙醇，沸水水浴10min。經(jīng)過沉淀，糖原懸浮于0.2ml 5n hcl和0.8ml蒸餾水中。用碘試劑460nm處測(cè)定肝糖原的含量，用克糖原/100克肝表示。2.8 丙二醛（mda）分別量取各組血液樣本200l用于mda測(cè)定。用于分析的方法是自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-免疫檢測(cè)。2.9 -氨基乙酰丙酸脫水酶（-丙氨酸-d）活性通過sassa的方法，用1m鉀磷酸鹽緩沖液和ph值6.8的12mm的氨基乙酰丙酸（ala）測(cè)定產(chǎn)物生成量，分析

9、肝臟-丙氨酸-d活性。39下反應(yīng)30min，555nm條件下測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物。2.10 過氧化氫酶的活性根據(jù)aebi法，測(cè)定過氧化氫分解來分析肝過氧化氫酶的活性2.11 超氧化物歧化酶活性根據(jù)misra和fridovich的方法，用分光光度計(jì)測(cè)定超氧化物歧化酶（sod）的活性。這種方法是基于sod能夠抑制腎上腺素自氧化的能力。顯色反應(yīng)在480nm處測(cè)定。一個(gè)酶單位定義為在26抑制50%腎上腺素自氧化率所需的酶量。2.12 谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活性根據(jù)habig等人的方法，通過谷胱甘肽和1-氯-2，4-二硝基苯（cdnb）的反應(yīng)，340nm測(cè)定肝谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（gst）活性。2.13 抗壞血酸

10、水平通過jacques-silva等人的方法，進(jìn)行測(cè)定肝臟抗壞血酸水平。蛋白質(zhì)（肝）是在10倍的50%三氯乙酸溶液制備。300ml均質(zhì)樣品，分裝，38靜置3h，加1ml 65%濃硫酸。測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物使用的顯色劑由4.5mg/ml的二硝基苯肼和0.075mg/ml的硫酸銅溶液組成。2.14 非蛋白巰基化合物（npsh）含量肝臟npsh水平根據(jù)ellman的方法測(cè)定。上清樣本（500l）和10%三氯乙酸（500l）1:1混合，離心后，蛋白質(zhì)顆粒被丟棄，自由巰基在上清液中。100l上清液加到850l磷酸氫二鉀緩沖液（ph為7.4）和50l 10mm的2-硝基苯甲酸（dtnb）中，顯色反應(yīng)在412nm處

11、測(cè)定。2.15 金屬硫蛋白（mt）含量肝臟金屬硫蛋白含量的測(cè)定根據(jù)petrovic改進(jìn)的viarengo等人的方法。1ml上清液中加入1.05ml無水乙醇（-20）和80l氯仿，然后6000g離心10min。收集的上清液上清液中加入冷乙醇（-20），保持在-201小時(shí)，6000g離心10min。用87%酒精和1%氯仿漂洗含顆粒的金屬硫蛋白，6000g離心10min。金屬硫蛋白沉淀含量的測(cè)定使用ellman的比色法。再在樣品中加入150l 0.25m nacl和150l 1n hcl-4mm edta 混合溶液。然后室溫下向樣品中加入0.2m 磷酸鹽緩沖液（ph8.0）和402ml 2m nac

12、l-0.43mm dtnb 混合溶液。最后樣品3000g離心5min，412處測(cè)定吸光度。2.16 蛋白測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定采用lowry等人的方法，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。2.17 鎘含量用原子吸收光譜法對(duì)血漿，腎臟和肝臟的鎘含量進(jìn)行分析。樣本（腎臟和肝臟）在硝酸（65%）溶解。一個(gè)樣本庫（含200l樣品）用來評(píng)價(jià)鎘含量。三個(gè)樣品庫測(cè)量結(jié)果由每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組組成。2.18 病理學(xué)組織麻醉大鼠，進(jìn)行徹底的尸檢評(píng)價(jià)。記錄肝臟重量，組織保存和固定在10%福爾馬林中。光學(xué)顯微鏡檢查，組織石蠟包埋，切片5m，蘇木精和伊紅染色。所有處理組進(jìn)行病理檢查（3個(gè)一組）。2.19 統(tǒng)計(jì)分析采用雙向方差分析（anova

13、）和duncan多重極差檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較處理組和各自的對(duì)照組，p0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 肝細(xì)胞損傷指標(biāo)cdcl2暴露引起肝臟和肝細(xì)胞損傷，(phse)2可以改變這種損傷。3.1.1 ast及alt活性cdcl2和(phse)2的交互作用在ast活性中差異極其顯著（f1，12=44.38，p0.001）（圖1a）。結(jié)果顯示，大鼠暴露于cdcl2中ast活性增加了31%，而(phse)2有效改善鎘致ast活性的這種增加。雙向方差分析cdcl2和(phse)2的交互作用，其對(duì)alt活性的影響差異極其顯著（f1，15=29.14，p0.001）（圖1b）。暴露于

14、cdcl2中的大鼠alt活性增加69%，而(phse)2抑制了cdcl2的這種影響。單獨(dú)給藥(phse)2使alt活性降低了16%。3.1.2 ldh，alp和ggt活性雙向方差分析顯示，cdcl2和(phse)2對(duì)血漿ldh的活性均呈顯著性影響（p0.05）（圖2a略）。結(jié)果可見，暴露于cdcl2中的大鼠ldh活性增加47%，而給藥(phse)2抑制了cdcl2引起的ldh活性增加現(xiàn)象。大鼠給藥(phse)2其ldh活性降低了39%。可見，cdcl2和(phse)2對(duì)血漿alp的活性均呈顯著性影響（p0.05）（圖2b略）。結(jié)果顯示，cdcl2暴露使alp的活性升高45%，而給藥(phse)

15、2抑制了cdcl2引起的alp活性的增加，使alp活性降低了37%。雙向方差分析顯示，cdcl2和(phse)2的交互作用在ggt活性中差異極其顯著（f1，15=34.83，p0.001）（圖2c略）。結(jié)果可見，暴露于cdcl2中的大鼠ast活性與對(duì)照組相比增加了2.5倍，而給藥(phse)2抑制了cdcl2引起的ggt活性的增加（圖2c略）。圖1 (phse)2對(duì)cdcl2暴露的大鼠血漿中ast（a）和alt（b）活性的影響。數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。（a）與對(duì)照組比較p0.05（雙向方差分析/duncan），（b）與氯化鎘組比較p0.05（雙向方差分析/duncan）。3.2 膽紅素含量雙向

16、方差分析顯示，cdcl2和(phse)2的交互作用在總膽紅素水平中差異極其顯著（f1，15=39.55，p0.001）（圖3a略）。結(jié)果可見，暴露于cdcl2中的大鼠總膽紅素水平與對(duì)照組相比增加了2.7倍（圖3a略），而給藥(phse)2有效抑制了cdcl2引起的總膽紅素水平的增加（圖3a略）。cdcl2和(phse)2的交互作用在直接膽紅素水平中差異極其顯著（f1，15=53.15，p0.001）（圖3b略）。暴露于cdcl2中的大鼠直接膽紅素水平與對(duì)照組相比增加了3.0倍，而給藥(phse)2抑制了cdcl2引起的直接膽紅素含量的增加（圖3b略）。雙向方差分析可見，cdcl2和(phse)

17、2的交互作用在間接膽紅素水平中差異極其顯著（f1，14=52.02，p0.001）（圖3c略）。結(jié)果顯示，暴露于cdcl2中的大鼠的間接膽紅素水平與對(duì)照組相比增加了2.4倍，而給藥(phse)2有效抑制了cdcl2引起的間接膽紅素含量的增加（圖3c略）。3.3 腎損傷指標(biāo)目的是為了確定cdcl2和(phse)2暴露是否能引起腎損傷指標(biāo)的變化，對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。雙向方差分析顯示，cdcl2和(phse)2的交互作用在血尿素水平中差異顯著（f1，32=39.55，p0.039）（圖4a略）。暴露于cdcl2中的大鼠血尿素水平增加了23%，而給藥(phse)2有效抑制了它的增加（圖4a略）。雙向

18、方差分析可見大鼠血漿肌酐濃度沒有顯著變化（圖4b略）。3.4 糖原和血糖濃度為了確定cdcl2和(phse)2暴露是否影響血糖的代謝，對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。雙向方差分析顯示，cdcl2對(duì)肝糖原水平有顯著影響（p0.05）（圖5a略）。因此可見，暴露于cdcl2中的大鼠肝糖原水平增加了64%，而給藥(phse)2對(duì)cdcl2所致的肝糖原水平增加沒有改善作用。雙向方差分析顯示血糖濃度沒有顯著性變化（圖5b略）。3.5 氧化應(yīng)激為了確定氧化應(yīng)激是否受cdcl2和(phse)2暴露的代謝，對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。3.5.1 cat，sod，-丙氨酸-d和gst活性雙向方差分析顯示肝臟cat，sod，-丙

19、氨酸-d和gst活性沒有顯著性變化（表1略）。3.5.2 mda，抗壞血酸，npsh和mt水平雙向方差分析顯示mt水平?jīng)]有顯著性變化（表2略）。(phse)2對(duì)肝臟npsh水平有顯著影響（表2略）。因此可見，暴露于(phse)2中的大鼠npsh水平增加了33%。cdcl2和(phse)2的交互作用在mda水平中差異極其顯著（f1，8=383.46，p0.001）（表2略）。暴露于cdcl2中的大鼠血漿mda水平與對(duì)照組相比增加了約9倍，而給藥(phse)2降低了cdcl2引起的mda水平的增加（表2略）。結(jié)果顯示，(phse)2對(duì)肝臟抗壞血酸水平有顯著作用（p0.05）（表2）。實(shí)際上，大鼠給

20、藥(phse)2使肝臟抗壞血酸水平增加了33%。3.6 鎘含量與對(duì)照組相比，cdcl2組大鼠血漿中的鎘含量呈增加趨勢(shì)。給藥(phse)2使cdcl2暴露所致的鎘含量增加降低了約40%（表3略）。給藥(phse)2使cdcl2暴露所致的肝臟鎘含量增加降低了約60%（表3略）。同樣，(phse)2使大鼠腎臟鎘水平的增加降低了約20%（表3略）。3.7 病理組織學(xué)與對(duì)照組的肝細(xì)胞相比（圖6a略），cdcl2暴露引起肝細(xì)胞變性（腫脹）和個(gè)別細(xì)胞壞死（圖6b略）。聯(lián)合暴露于cdcl2和(phse)2的大鼠肝臟與對(duì)照組相比，沒有發(fā)生組織病理學(xué)改變（圖6d略）。4 討論二苯基二硒已經(jīng)被證明能夠保護(hù)機(jī)體免受各

21、種化學(xué)物質(zhì)的毒性作用，包括致癌物質(zhì)和氧化損傷的誘導(dǎo)物。(phse)2作用的主要機(jī)制是它能夠抑制這些化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。有研究報(bào)道，(phse)2另一可能作用機(jī)制是它與鎘形成復(fù)合物。目前的研究表明，長(zhǎng)期cdcl2暴露下用(phse)2聯(lián)合處理可以降低大鼠肝細(xì)胞毒性和細(xì)胞損傷。結(jié)果表明：(phse)2有效改善cdcl2誘導(dǎo)的毒性作用，這是因?yàn)樗目寡趸再|(zhì)和與鎘形成復(fù)合物。鎘含量的數(shù)據(jù)驗(yàn)證了鎘和(phse)2的可復(fù)合假說。根據(jù)數(shù)據(jù)我們可以看出，(phse)2的存在可以使鎘更容易排泄。但是它們的復(fù)合物能否被吸收，這個(gè)問題還有待解決。本研究中，鎘暴露增加了mda含量，但機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)（抗壞血酸

22、水平，cat和sod）沒有任何改變。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞崾狙趸瘧?yīng)激可能是cdcl2誘導(dǎo)的肝損傷的原因之一。用(phse)2聯(lián)合處理抑制了cdcl2暴露所致的mda水平的增加。(phse)2是一種有機(jī)硒化合物，其抗氧化活性已被報(bào)道。另外，(phse)2能夠減輕cdcl2誘導(dǎo)的小鼠睪丸的氧化損傷。相反的是，一些以往的研究報(bào)告對(duì)鎘等有毒物質(zhì)引起的細(xì)胞損傷，氧化應(yīng)激在其中的主要作用提出了異議。本研究中抗氧化防御系統(tǒng)沒有發(fā)生改變，對(duì)此的一個(gè)合理的解釋是：鎘暴露只有在剛開始接觸時(shí)對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)有影響，但是30天之后恢復(fù)到正常狀態(tài)并維持之前的氧化損傷。因此，細(xì)胞和氧化損傷可能反映生物化學(xué)和病理組織學(xué)參數(shù)的改

23、變。除了氧化應(yīng)激，鎘誘發(fā)肝毒性的可能涉及到其他三個(gè)不同的途徑：第一個(gè)是由金屬和/或局部缺血引起的急性直接毒性作用，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷。第二個(gè)是kupffer細(xì)胞激活的炎性損傷，中性粒細(xì)胞在其中發(fā)揮了主要作用。第三個(gè)是鎘的轉(zhuǎn)移途徑，它的存在形式也與生物學(xué)本質(zhì)上的金屬（如鈣、銅、鋅）一樣。一旦進(jìn)入細(xì)胞，鎘離子干擾細(xì)胞的代謝主要是通過代替其他二價(jià)陽離子的作用（尤其是鈣），從而激活或抑制各種酶的作用。本研究組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期cdcl2暴露會(huì)引起肝細(xì)胞損傷。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，鎘暴露導(dǎo)致細(xì)胞變性（腫脹）和個(gè)別壞死（圖6b略）。用(phse)2聯(lián)合處理抑制了cdcl2所致的病理學(xué)改變（圖6d略）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，(phse)2使alt，ast，ggt，alp活性和膽紅素水平降低，而它們是評(píng)價(jià)肝損傷的指標(biāo)。另外，鎘暴露使細(xì)胞損傷指標(biāo)ldh水平升高，而(phse)2使這種升高降低。(phse)2對(duì)生化參數(shù)（alt，ast，ggt，alp和膽紅素）具有促進(jìn)作用，著是因?yàn)樗目寡趸再|(zhì)，能夠清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞破裂。事實(shí)上，已有研究證明，(phse