酵母工程菌表達(dá)的幾丁質(zhì)酶分離及酶學(xué)性質(zhì)研究畢業(yè)論文

1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)） 題 目：酵母工程菌表達(dá)的幾丁質(zhì)酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信聲明本人聲明：所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，論文中引用他人的文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)、圖表、資料均已作明確標(biāo)注，論文中的結(jié)論和成果為本人獨(dú)立完成，真實(shí)可靠，不包含他人成果及已獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。論文（設(shè)計(jì)）作者簽名： 日期： 年 月 日 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）版權(quán)使用授權(quán)書本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文（設(shè)計(jì)）的復(fù)印

2、件和電子版，允許論文（設(shè)計(jì)）被查閱和借閱。本人授權(quán)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）。本人離校后發(fā)表或使用該畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）或與該論文（設(shè)計(jì)）直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，單位署名為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)。論文（設(shè)計(jì)）作者簽名： 日期： 年 月 日指 導(dǎo) 教 師 簽 名： 日期： 年 月 日畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說明原創(chuàng)性聲明本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文），是我個(gè)人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已經(jīng)發(fā)表或公

3、布過的研究成果，也不包含我為獲得 及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過的材料。對(duì)本研究提供過幫助和做出過貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均已在文中作了明確的說明并表示了謝意。作 者 簽 名： 日 期： 指導(dǎo)教師簽名： 日期： 使用授權(quán)說明本人完全了解 大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)?？梢圆捎糜坝?、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉?jī)?nèi)容。作者簽名： 日 期： 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)

4、師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名： 日期： 年 月 日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán) 大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。涉密論文按學(xué)校規(guī)定處理。作者簽名：日期： 年 月

5、 日導(dǎo)師簽名： 日期： 年 月 日指導(dǎo)教師評(píng)閱書指導(dǎo)教師評(píng)價(jià)：一、撰寫（設(shè)計(jì)）過程1、學(xué)生在論文（設(shè)計(jì)）過程中的治學(xué)態(tài)度、工作精神 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、學(xué)生掌握專業(yè)知識(shí)、技能的扎實(shí)程度 優(yōu) 良 中 及格 不及格3、學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)和專業(yè)技能分析和解決問題的能力 優(yōu) 良 中 及格 不及格4、研究方法的科學(xué)性；技術(shù)線路的可行性；設(shè)計(jì)方案的合理性 優(yōu) 良 中 及格 不及格5、完成畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）期間的出勤情況 優(yōu) 良 中 及格 不及格二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？ 優(yōu) 良 中

6、 及格 不及格三、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問題的指導(dǎo)意義 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格3、論文（設(shè)計(jì)說明書）所體現(xiàn)的整體水平 優(yōu) 良 中 及格 不及格建議成績(jī)： 優(yōu) 良 中 及格 不及格（在所選等級(jí)前的內(nèi)畫“”）指導(dǎo)教師： （簽名） 單位： （蓋章）年 月 日評(píng)閱教師評(píng)閱書評(píng)閱教師評(píng)價(jià)：一、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格二、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或

7、對(duì)解決實(shí)際問題的指導(dǎo)意義 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格3、論文（設(shè)計(jì)說明書）所體現(xiàn)的整體水平 優(yōu) 良 中 及格 不及格建議成績(jī)： 優(yōu) 良 中 及格 不及格（在所選等級(jí)前的內(nèi)畫“”）評(píng)閱教師： （簽名） 單位： （蓋章）年 月 日教研室（或答辯小組）及教學(xué)系意見教研室（或答辯小組）評(píng)價(jià)：一、答辯過程1、畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的基本要點(diǎn)和見解的敘述情況 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、對(duì)答辯問題的反應(yīng)、理解、表達(dá)情況 優(yōu) 良 中 及格 不及格3、學(xué)生答辯過程中的精神狀態(tài) 優(yōu) 良 中 及格 不及格二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否

8、符合撰寫規(guī)范？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格三、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問題的指導(dǎo)意義 優(yōu) 良 中 及格 不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？ 優(yōu) 良 中 及格 不及格3、論文（設(shè)計(jì)說明書）所體現(xiàn)的整體水平 優(yōu) 良 中 及格 不及格評(píng)定成績(jī)： 優(yōu) 良 中 及格 不及格（在所選等級(jí)前的內(nèi)畫“”）教研室主任（或答辯小組組長(zhǎng)）： （簽名）年 月 日教學(xué)系意見：系主任： （簽名）年 月 日目錄摘要1Abstract.2引言31 材料與方法41.1 實(shí)驗(yàn)材料41.1.1 供試菌株41.1

9、.2 試劑41.1.3 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制51.1.4 主要儀器設(shè)備71.2 實(shí)驗(yàn)方法71.2.1 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá)71.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立71.2.3 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測(cè)定81.2.4 幾丁質(zhì)酶的分離純化81.2.5 幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE檢測(cè)81.2.6 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)92 結(jié)果與分析102.1 N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線102.2 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測(cè)定112.3 幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE檢測(cè)112.4 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度122.5 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值132.6 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性132.7 幾丁質(zhì)酶的

10、pH穩(wěn)定性132.8 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響142.9 變性劑、蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響142.10 幾丁質(zhì)酶底物特異性測(cè)定153 結(jié)論與討論153.1 結(jié)論153.2 討論163.3 展望17致謝17參考文獻(xiàn)18酵母工程菌表達(dá)的幾丁質(zhì)酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究生物科學(xué)專業(yè) 李云翔 指導(dǎo)教師 咸洪泉摘要：本文轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的酵母工程菌株GS-tachit1-K進(jìn)行誘導(dǎo)分泌表達(dá)，分離純化發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶，測(cè)定它的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ，在35 以下相對(duì)穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH 4.5-6.5之間穩(wěn)定。Cu2+、Ag+、Hg2+ 和SDS對(duì)酶活

11、性有明顯的抑制作用，該酶能特異性降解膠體幾丁質(zhì)。本研究結(jié)果為該酶的研究和開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：酵母工程菌；表達(dá)；幾丁質(zhì)酶；酶學(xué)性質(zhì)Purification and Characterization of Chitinase Secreted by Yeast Engineering StrainStudent majoring in bioscience Li Yunxiang Tutor Xian HongquanAbstract: In this work, the yeast engineering strain GS-tachit1-K transformed with ch

12、itinase gene was induced to express, purify the Chitinase of fermentation, to determine its enzymology characterization. It is proved that the optimal temperature for the chitinase was 50 and the chitinase activity was relatively stable when the temperature was under 35. The optimal pH value was 5.5

13、 and the chitinase activity was stable when the pH value was between 4.5 and 6.5. The enzymatic activity was inhibited evidently by Cu2+, Ag+, Hg2+ and SDS. The protein had a specific activity to degrade colloidal chitin. This work supplies science evidence for the research and development of the ch

14、itinase.Key words: Yeast Engineering Strains; Express; Chitinase; Enzymatic Characterization引言幾丁質(zhì)（chitin）又稱甲殼素、甲殼質(zhì)或幾丁聚糖，是N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-D-Glucosamine，簡(jiǎn)稱NAG）以-1,4糖苷鍵聚合而形成的直鏈形大分子，廣泛存在于自然界中，主要來源于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟件動(dòng)物的器官（例如烏賊的軟骨），以及真菌（如酵母、霉菌）的細(xì)胞壁中，是除蛋白質(zhì)外地球上數(shù)量最大的含氮天然有機(jī)化合物。據(jù)估計(jì)每年自然界中幾丁質(zhì)的生物合成量約100億噸，其中

15、可提取幾丁質(zhì)20億噸以上，是僅次于纖維素的自然界第二大天然生物有機(jī)資源1。國(guó)際醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)食品學(xué)會(huì)將這種物質(zhì)定義為除糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)五大生命要素后的第六大生命要素，因此越來越受到廣泛關(guān)注。然而自然界中的幾丁質(zhì)幾乎以相等的速率產(chǎn)生和消失，在這個(gè)過程中，微生物起了非常重要的作用。細(xì)菌和真菌所分泌的幾丁質(zhì)酶可將幾丁質(zhì)中的-1,4糖苷鍵水解，最終分解為N-乙酰-D-葡萄糖胺。幾丁質(zhì)也可經(jīng)脫乙酰作用形成脫乙酰幾丁質(zhì)（chitosan），脫乙酰幾丁質(zhì)又可進(jìn)一步被脫乙酰幾丁質(zhì)酶（chitosanase）分解成氨基葡萄糖2。目前幾丁質(zhì)生產(chǎn)一般是采用化學(xué)方法降解，這也是工業(yè)化生產(chǎn)中最早、最常用的方法

16、。但由于化學(xué)方法降解幾丁質(zhì)條件苛刻、穩(wěn)定性差、處理繁瑣、污染嚴(yán)重，使得無法對(duì)它的進(jìn)行大規(guī)模開發(fā)利用。溫和、高效、無污染的生物酶法已成為研究的熱點(diǎn)3。 幾丁質(zhì)酶（chitinase）是一類生物代謝的具有廣泛用途的水解酶，它能催化水解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，從而抑制真菌生長(zhǎng)與繁殖4。早在1905年Benecke就首次分離到了能利用幾丁質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的微生物，并定名為Bacillus chitinovirous （溶幾丁質(zhì)芽孢桿菌），但當(dāng)時(shí)并沒有關(guān)于幾丁質(zhì)酶活性方面的直接證據(jù)。1921年Folpmers發(fā)現(xiàn)分解幾丁質(zhì)的細(xì)菌和放線菌在含幾丁質(zhì)的瓊脂上形成透明圈，從而證明這些培養(yǎng)物內(nèi)有水溶性的幾丁質(zhì)酶存在

17、5。此后，人們又相繼從多種微生物（包括細(xì)菌、放線菌、真菌）、植物及動(dòng)物中分離到幾丁質(zhì)酶，并對(duì)幾丁質(zhì)酶的理化特性及生物學(xué)活性進(jìn)行了大量的研究。隨著幾丁低聚糖、幾丁寡糖在抗菌、抗腫瘤作用方面的研究不斷深入，作為制備幾丁低聚糖、幾丁寡糖的重要工具幾丁質(zhì)酶受到廣泛關(guān)注，同時(shí)幾丁質(zhì)酶還能抑制真菌生長(zhǎng)、防治作物病蟲害。因此幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究日益受到重視，前景廣闊。幾丁質(zhì)酶可以根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。根據(jù)作用方式和酶解產(chǎn)物，幾丁質(zhì)酶可以分為：內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（endochitinase）、外切幾丁質(zhì)酶（exochitinase）和幾丁二糖酶（chitbiosidase）。根據(jù)反應(yīng)的最適pH不同，可將其分

18、為酸性、中性與堿性幾丁質(zhì)酶。而根據(jù)幾丁質(zhì)酶分泌性質(zhì)的不同，又可以將其分為胞外酶與胞內(nèi)酶。 幾丁質(zhì)酶應(yīng)用范圍非常廣，具有巨大的開發(fā)潛力，對(duì)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、自然資源的利用、生物防治、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥衛(wèi)生等都具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，微生物幾丁質(zhì)酶的研究備受關(guān)注，但天然酶在生物體內(nèi)的含量一般較低且容易受到底物和環(huán)境的影響，這對(duì)幾丁質(zhì)酶大量提取和制備造成了困難。隨著DNA重組技術(shù)不斷發(fā)展，通過構(gòu)建遺傳工程菌株，克隆各種天然酶的基因，使其在微生物系統(tǒng)中得以高效表達(dá)，從而克服上述困難。早期研究人員利用大腸桿菌來表達(dá)幾丁質(zhì)酶，但其表達(dá)率低且產(chǎn)生的酶多數(shù)不能分泌到胞外。酵母表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)槠渚哂斜容^完備的基

19、因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，而受到越來越多的重視、利用。畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，它克服了釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多不足，成為國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大量生產(chǎn)外源真核蛋白的較為理想的表達(dá)系統(tǒng)。本文對(duì)轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的酵母工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)分泌表達(dá)，分離純化發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶，測(cè)定它的酶學(xué)性質(zhì)，為以后該酶的大規(guī)模開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 供試菌株 酵母工程菌GS-tachit1-K、轉(zhuǎn)pPIC9K空載體的畢赤酵母GS115菌株（未導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因）由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2 試劑酵母基本氮源（YNB）、D-生物素、甘氨酸購(gòu)自BBI公司；蛋白

20、質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）購(gòu)自TaKaRa公司；幾丁質(zhì)、殼聚糖（Chitosan）、N-乙酰氨基葡萄糖購(gòu)自上海生工；甘油，甲醇，HCl，95 % 乙醇，冰醋酸，無水乙醇，NaOH溶液，苯酚，-巰基乙醇，甲醇，乙醇，異丙醇，丙三醇；檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、巴比妥，硫酸銨，酵母提取物，胰蛋白胨，丙烯酰胺（Acr），雙丙烯酰胺（Bis）， 三羥甲基氨基甲烷（Tris），十二烷基硫酸鈉（SDS），過硫酸銨（AP），TEMED，瓊脂，溴酚藍(lán)，考馬斯亮藍(lán)R-250，3,5-二硝基水楊酸（DNS），酒石酸鉀鈉，無水亞硫酸鈉，L-半胱氨酸，K3PO4，GuSO45H2O，CaCl2，MnCl2，F(xiàn)eSO47H2O，

21、ZnSO4，BaCl2，KCl，NaCl，AgNO3，MgSO4，NH4NO3，HgCl2，EDTA，Na2SO4等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制（1）培養(yǎng)基貯存液配制10YNB（13.4 % 酵母基本氮源，無氨基酸含硫酸銨）：將53.6 g YNB溶于400 mL 的蒸餾水中，過濾除菌后4 保存?zhèn)溆谩?00B（0.02 % Biotin，生物素）：將2 mg生物素溶于10 mL蒸餾水中，過濾除菌后4 保存?zhèn)溆谩?0GY（10 % Glycerol，甘油）：將10 mL甘油與90 mL蒸餾水混合，高壓滅菌20 min后4 保存?zhèn)溆谩?mol/L K3PO4：將84.

22、8 g K3PO4溶于400 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至6.0，高壓滅菌20 min。10M（5 % Methanol，甲醇）：將15 mL甲醇與285 mL蒸餾水混合，過濾除菌后4 保存?zhèn)溆?。?）常用培養(yǎng)基的制備BMGY培養(yǎng)基：稱取5 g酵母提取物，10 g 胰蛋白胨，溶于350 mL蒸餾水中，高壓滅菌20 min，然后冷卻至室溫，再加入50 mL 10YNB、1 mL 500B、50 mL 10GY、50 mL 1 mol/L K3PO4（pH 6.0），最后4 保存?zhèn)溆?。BMMY培養(yǎng)基：稱取5 g酵母提取物，10 g蛋白胨，溶于350 mL蒸餾水中，高壓滅菌20 min，然后冷卻至室溫，

23、再加入50 mL 10YNB、1 mL 500B、50 mL 10M、50 mL 1 mol/L K3PO4（pH 6.0），最后4 保存?zhèn)溆?。?）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制30 % 凝膠儲(chǔ)液：稱取29.1 g Acr，0.9 g Bis，加100 mL蒸餾水溶解。分離膠緩沖液：稱取36.3 g Tris，48 mL 1 mol/L HCl，加100 mL蒸餾水溶解。濃縮膠緩沖液：稱取5.98 g Tris，48 mL 1 mol/L HCl，加100 mL蒸餾水溶解。電極緩沖液：稱取1.5 g SDS，9 g Tris，43.2 g甘氨酸，加1500 mL蒸餾水溶解。1 mol/

24、L、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液：稱取121.1 g Tris，加800 mL蒸餾水溶解，再加70 mL 1 mol/L HCl，混勻后調(diào)節(jié)pH至6.8，最后加蒸餾水定容至1000 mL。樣品緩沖液：取1 mL Tris-HCl緩沖液，0.4 g SDS，0.02 g溴酚藍(lán)，2 mL甘油，0.2 mL -巰基乙醇，加10 mL 蒸餾水溶解。10 % 過硫酸銨：稱取1 g過硫酸銨，加10 mL 蒸餾水溶解（現(xiàn)用現(xiàn)配）。固定液：取45 mL 95%乙醇，10 mL 冰醋酸，加100 mL 蒸餾水。染色液：稱取0.75 g考馬斯亮藍(lán)R-250，加入135 mL 95%乙醇，30 mL冰醋酸，

25、加300 mL 蒸餾水，混勻，用濾紙過濾。脫色液：取70 mL 冰醋酸，200 mL 乙醇，加1000 mL 蒸餾水。（4）膠體幾丁質(zhì)的制備稱取10 g片狀幾丁質(zhì)（剪碎）置于500 mL三角瓶中，加100 mL濃鹽酸浸泡，然后放入37 搖床中至幾丁質(zhì)完全溶解，4 過夜。向溶液中加入500 mL 50 % 乙醇，不斷攪拌至析出膠體，然后5000 r/min離心5 min，棄掉上清液。在膠體中再加蒸餾水，攪拌后5000 r/min離心5 min，重復(fù)上述過程至pH約為7.0。（5）DNS的制備取3.15 g DNS，加500 mL水，45 水浴溶解。逐步加入NaOH溶液（20 g 溶于水），不斷攪

26、拌至溶液清澈透明。然后加入91 g酒石酸鉀鈉，2.5 g苯酚和2.5 g無水亞硫酸鈉。45 水浴，同時(shí)加水不斷攪拌至全溶。停止加熱，冷卻至室溫，用水定容至1000 mL 。將液體儲(chǔ)存于棕色瓶，避光保存7 d， 備用。（6）廣泛pH緩沖液稱取6.008 g檸檬酸 、3.893 g磷酸二氫鉀 、1.769 g硼酸 、5.266 g巴比妥，加1 L 蒸餾水溶解。1.1.4 主要儀器設(shè)備Anke DL-5-B低速大容量離心機(jī)，Anke TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋，雙層全溫?fù)u床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），UV-2000紫外可見分光光度計(jì)，DYY-12型電腦三恒多用電泳儀、WD-9412A

27、型恒溫循環(huán)器、WD-9405A型脫色搖床（北京市六一儀器廠），夾心式垂直板電泳槽。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá)（1）挑取GS-tachit1-K單菌落，接種到含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，用紗布封口，放到搖床中，28 、130 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600為2-6）。（2）將BMGY培養(yǎng)物以5000 r/min離心10-15 min，回收酵母細(xì)胞，棄掉上清液，將細(xì)胞重懸于BMMY培養(yǎng)基中，至OD600值為1.0-2.0（約100200 ml）。（3）將培養(yǎng)液置于500 mL搖瓶中，用雙層紗布封口，在搖床中28-3

28、0 繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)表達(dá)（注意溫度不要超過30 ）。（4）誘導(dǎo)開始后，每天補(bǔ)加100 % 甲醇使終濃度維持在0.5 %。（5）誘導(dǎo)開始后，每天取樣一次，直至第7天。每次取樣3 mL于1.5 mL離心管中-20 保存。樣品用于制作產(chǎn)酶曲線和蛋白電泳。1.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立表1 NAG濃度的配制Tab. 1 Standard curve of NAG項(xiàng)目01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAG標(biāo)準(zhǔn)液（mL）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 NAG的量（mg）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.

29、5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 蒸餾水（mL）1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 DNS（mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 配制1 g/mL N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）溶液。取11支25 mL按(表1)加入試劑，將各管混勻，沸水浴煮沸10 min。取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每試管加入3 mL蒸餾水，混勻。測(cè)540 nm處的吸光值，以蒸餾水為空白調(diào)零，每組3個(gè)重復(fù)。以NAG濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測(cè)

30、定將保存的粗酶液樣品取出，幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定參照Antoni和Masarus方法6,7，并加以改進(jìn)。1 mL膠體幾丁質(zhì)與稀釋的0.5 mL 酶液放于50 水浴保溫1 h，上清液中的還原糖采用DNS法測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出還原糖的含量，然后計(jì)算酶活。酶活性單位（U）定義為：每分鐘水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 mg還原糖所需的酶蛋白量8。1.2.4 幾丁質(zhì)酶的分離純化1.2.4.1 粗酶液的制備根據(jù)分析最佳收獲時(shí)間為7 d。第7天終止發(fā)酵收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液5000 r/min離心10-15 min，收集上清液即為粗酶液。 1.2.4.2 硫酸銨沉淀向提取的粗酶液中加入固體硫酸銨至80%飽和度，冰浴后過夜。以5

31、000 r/min離心15 min，收集沉淀。用適量50 mmol/mL pH 8.0 Tris-HCl緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析2-3 d，取少量溶液加BaCl2檢測(cè)是否透析完全。透析完全后，將透析液以5000 r/min離心15 min，取上清液，-80保存。1.2.5 幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE檢測(cè)對(duì)純化酶液和1-7 d的粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE，測(cè)定表觀幾丁質(zhì)酶的分子量。（1）分離膠凝膠液與濃縮膠凝膠液的配制12 %分離膠凝膠液：取6.0 mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液，3.8 mL分離膠緩沖液，0.15 mL 10 % SDS，5.0 mL ddH2O，30 l 10 % 過硫酸銨

32、，30 l TEMED，混勻。3 % 濃縮膠凝膠液：取0.5 mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液，0.7 mL濃縮膠緩沖液，0.15 l 10 % SDS，3.75 mL ddH2O，15 L 10 % 過硫酸銨，10 L TEMED，混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。（2）電泳操作9按照順序安裝玻璃板，然后沿兩板縫隙加入15 % 融化的瓊脂，待瓊脂凝固后加入現(xiàn)配的12 % 分離膠凝膠液，至膠面距低板邊緣3 cm左右，然后用滴管在膠面上輕輕鋪?zhàn)? cm水層，垂直放置膠板，室溫下放置30 min待膠凝聚。凝聚后用濾紙吸出膠面上的水。將3 % 濃縮膠凝膠液迅速注入分離膠上層，使液面與低板邊緣齊平，插入梳子。室溫下放置2 h

33、，待其完全凝聚。凝聚后小心拔出梳子，在玻璃板兩側(cè)倒入電極緩沖液。將1-7 d的粗酶液離心，取50 L上清再加入50 L上樣緩沖液，對(duì)照組用提純的酶液?；靹蚝笤诜兴兄?0 min，冷卻后用微量加樣器將25 L樣品和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分別注入加樣孔中。將電泳槽與電泳儀相連，電壓保持100 V進(jìn)行電泳，至樣品遷移至玻璃板下端1 cm時(shí)停止電泳。（3）染色及脫色將電泳完畢的凝膠取出，用去離子水沖洗，然后放到考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色，過夜。棄去染色液，凝膠沖洗后置于固定液中固定。將凝膠置于500 mL脫色液中脫色，至膠脫色完全。脫色后，將膠板置于去離子水中室溫下保存。（4） 分子量測(cè)定已知標(biāo)準(zhǔn)

34、分子量蛋白質(zhì)（低）各電泳條帶的分子量，通過電泳圖估計(jì)幾丁質(zhì)酶的分子量10。1.2.6 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)1.2.6.1 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度將酶反應(yīng)體系分別置于30 、35 、40 、45 、50 、55 、60 、65 、70 、75 和80 下反應(yīng)1 h，DNS法檢測(cè)幾丁質(zhì)酶的活性，確定酶反應(yīng)的最適溫度。最高的酶活力定義為100，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（即在不同溫度下的酶活性占最高酶活性的百分比）。 1.2.6.2 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值用廣泛pH緩沖液將酶反應(yīng)體系pH值調(diào)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.

35、5、9.0、9.5、10.0測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性。將最高的酶活力定義為100 ，分別計(jì)算不同pH值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（方法同上）。1.2.6.3 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性先將酶液分別置于30 、35 、40 、45 、50 和55 下保溫不同的時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min）后，立即在0 冰浴中冷卻，然后加入幾丁質(zhì)在50 反應(yīng)1 h ，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性，以剩余的酶活性作為酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。將最高的酶活力定義為100，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。1.2.6.4 幾丁質(zhì)酶的pH值穩(wěn)定性將酶液分別在pH 3.0、3.5、4.0、

36、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的緩沖液中處理1 h后，然后再將反應(yīng)體系的pH值調(diào)至5.5，測(cè)定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為100，分別計(jì)算不同pH值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。1.2.6.5 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子（Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+、K+、Na+、Ag+、Mg2+、NH4+ 、Hg+）并使其最終濃度為0.05 mol/L，在50 下反應(yīng)1 h后，以反應(yīng)體系中不加金屬離子的酶活性為100，分別測(cè)定加入不同金屬離子后反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。1.2.6.6 變性劑

37、、蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的變性劑、蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑，使SDS終濃度分別為0.1 % 和1.0 %(w/v)，尿素終濃度分別為0.5 mol/L和3.0 mol/L，EDTA、-巰基乙醇終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L，Na2SO4、L-半胱氨酸終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，而甲醇、乙醇、異丙醇、丙三醇終濃度為1 %和5 %，在50 下反應(yīng)1 h后，以反應(yīng)體系中不加任何試劑的酶活性為100 %，分別測(cè)定加入不同變性劑、蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑后反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。1.2.6.7 幾丁質(zhì)酶底物特異性測(cè)定用幾丁質(zhì)酶液分別水

38、解2 %的不同底物（膠體幾丁質(zhì)、粉狀幾丁質(zhì)、殼聚糖），每組做三個(gè)重復(fù)，DNS法測(cè)定幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的水解活性。2 結(jié)果與分析2.1 N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以N-乙酰氨基葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD540值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），回歸方程為y = 2.1174x 0.0859。 圖1 NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of NAG 2.2 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測(cè)定根據(jù)酵母工程菌株1-7 天的產(chǎn)酶結(jié)果繪制產(chǎn)酶曲線。結(jié)果如圖2-2，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，單位體積（mL）的幾丁質(zhì)酶活性不斷增加，5-7 天趨于穩(wěn)定。因此，選取第7天的發(fā)酵液進(jìn)行酶

39、學(xué)性質(zhì)研究。圖2酵母工程菌GS-tachit1-K的產(chǎn)酶曲線Fig. 2 The curve of activities to times for GS-tachit1-K 2.3 幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE檢測(cè)對(duì)純化酶液11、酵母工程菌1-7 天的粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，以轉(zhuǎn)pPIC9K空載體的畢赤酵母GS115菌株的表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白（低）分子量分別為97.4、66.2、43.0、31.0、20.1和14.4 KDa，純化后酶液有1條清晰地電泳條帶，分子量約為41KDa，說明GS-tachit1-K經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶且分離純化的方法有效。隨著時(shí)間的

40、延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增加，5-7天趨于穩(wěn)定，與測(cè)定的產(chǎn)酶曲線相一致。 圖3酵母工程菌表達(dá)幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE分析純：純化后幾丁質(zhì)酶酶液；M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白（低）；1-7：1-7天的粗酶液；CK：轉(zhuǎn)pPIC9K空載體的畢赤酵母GS115菌株的表達(dá)產(chǎn)物Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression chitinase from GS-tachit1-KPure: enzyme solution of purified chitinase; M: standard molecular weight proteins (low); 1-7: the crude extr

41、act from 1 to 7 day; CK: the expression products of Pichia pastoris GS115 strain with pPIC9K vector2.4 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度從圖4中看出，GS-tachit1-K菌株表達(dá)的幾丁質(zhì)酶在30-55 條件下，都具有較高的活性，其最適反應(yīng)溫度為50 。當(dāng)溫度超過60 時(shí)，酶活性降低，在80 時(shí)，酶活性降低至30 %。圖4幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度Fig. 4 The optimum temperature of chitinase reaction2.5 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值幾丁質(zhì)酶的最適pH試驗(yàn)結(jié)

42、果如圖5，GS-tachit1-K菌株幾丁質(zhì)酶在pH 4.5-6.5之間都具有較高的活性，其中最適反應(yīng)pH為5.5，當(dāng)pH大于7.0時(shí)，酶活性迅速降低。在pH 10.0時(shí)酶活性小于20 %。圖5幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pHFig. 5 The optimum pH value of chitinase reaction2.6 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見圖6，幾丁質(zhì)酶在35 以下是比較穩(wěn)定的，50 下處理1 h，殘余酶活為12 %，55 處理10 min后幾丁質(zhì)酶沒有活性。圖6幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性Fig. 6 The thermostability of chitinase2.7 幾丁質(zhì)酶的p

43、H穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖7，在pH 4.5-6.5之間酶穩(wěn)定，最適pH值為5.5。當(dāng)pH超過7.0時(shí)酶活性迅速降低，在pH為8.5時(shí)，幾丁質(zhì)酶基本沒有活性。說明幾丁質(zhì)酶在酸性條件下穩(wěn)定。圖7幾丁質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性Fig. 7 The pH stability of chitinase2.8 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響金屬離子對(duì)酶活性影響如圖8所示，F(xiàn)e2+、 Ba2+、K+、Na+對(duì)酶活性無明顯作用，而Cu2+、Ca2、Mn2+、Zn2+、Ag+、Mg2+、NH4+、Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑制作用。其中，Cu2+、Ag+、Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制作用明顯。 圖8不同金

44、屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig. 8 Effects of different metallicions on chitinase activity2.9 變性劑、蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響在酶的反應(yīng)體系中加入不同濃度的變性劑、蛋白酶抑制劑和有機(jī)溶劑后，對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的作用如下表2，SDS的終濃度為0.1 %、1 % (w/v)都對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用，說明SDS能使幾丁質(zhì)酶蛋白分子間的氫鍵斷裂，使分子去折疊，破壞蛋白分子結(jié)構(gòu)，使酶失活。此外，終濃度為3 mol/L的尿素和10 mmol/L的-巰基乙醇也對(duì)酶有抑制作用。其中，尿素破壞氫鍵使酶蛋白分子結(jié)構(gòu)松散，而-巰基乙醇能使二硫

45、鍵還原，破壞蛋白質(zhì)三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，這些都使酶失活。表2各種試劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響Tab. 2 Effects of different regents on chitinase activity 試劑濃度相對(duì)酶活（%）試劑濃度相對(duì)酶活（%）SDS0.1%w/v24.26 L-半胱氨酸1mmol/L100.35 1%w/v17.61 5mmol/L96.17 尿素0.5mol/L94.32 甲醇1%99.91 3mol/L36.54 5%92.21 EDTA1mmol/L97.05 乙醇1%99.47 10mmol/L95.11 5%90.80 -巰基乙醇1mmol/L91.19 異丙醇1%9

46、8.68 10mmol/L22.81 5%82.65 Na2SO41mmol/L100.00 丙三醇1%99.38 5mmol/L95.33 5%88.37 2.10 幾丁質(zhì)酶底物特異性測(cè)定幾丁質(zhì)酶底物特異性試驗(yàn)結(jié)果如下表3，幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)有水解活性，而對(duì)粉末狀幾丁質(zhì)和殼聚糖無水解活性,說明該幾丁質(zhì)酶特異性降解膠體幾丁質(zhì)。表3幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的酶活Tab. 3 Activities of chitinase on different matter底物酶活（U/mL）膠體幾丁質(zhì)5.32 粉末幾丁質(zhì)0.00 殼聚糖0.00 3 結(jié)論與討論3.1 結(jié)論酵母工程菌GS-tachit1-K表達(dá)的

47、幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE檢測(cè)證明，經(jīng)幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)表達(dá)和有效地分離純化，獲得了單一蛋白質(zhì)，其分子量約為41KDa。 該幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為50 ，最適pH值為5.5。在 溫度35 以下、pH 4.5-6.5之間，幾丁質(zhì)酶具有較高的穩(wěn)定性。底物特異性試驗(yàn)證明該幾丁質(zhì)酶特異性降解膠體幾丁質(zhì)。Fe2+、Ba2+、K+、Na+對(duì)酶活性無明顯作用，而Cu2+、Ca2、Mn2+、Zn2+、Ag+、Mg2+、NH4+、Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑制作用。 此外，SDS、尿素、-巰基乙醇也對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用。因此，在應(yīng)用過程中應(yīng)避免上述金屬離子和試劑的干擾。3.2 討論（1）幾丁質(zhì)酶的分子量 微

48、生物幾丁質(zhì)酶的分子量一般為10-100 KD。據(jù)報(bào)道，粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）表達(dá)五種幾丁質(zhì)酶，其分子量分別為21、36、48、52 和57KDa，而紅色鏈霉菌（S. erythraeus）則僅產(chǎn)生一種12,13，分子量為30KDa。本試驗(yàn)研究的酵母工程菌GS-tachit1-K產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)證明為單一蛋白質(zhì)，分子量約為41KDa，與報(bào)道的幾丁質(zhì)酶的分子量不同。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是因?yàn)槲⑸飵锥≠|(zhì)酶的來源不同，其酶的性質(zhì)有很大差異。（2）幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)微生物幾丁質(zhì)酶最適溫度一般在40-50 ，pH一般認(rèn)為在3-11之間，但絕大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶適于4

49、-6的偏酸性環(huán)境 14。而本試驗(yàn)研究的酵母工程菌GS-tachit1-K產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度為50 ，最適pH值為5.5，說明它與大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶反應(yīng)所需條件相近。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中幾丁質(zhì)酶在35 以下是穩(wěn)定的，證明該酶不具有較高的熱穩(wěn)定性。pH穩(wěn)定性表明在pH 4.5-6.5之間幾丁質(zhì)酶有較高活性，說明幾丁質(zhì)酶在酸性條件下穩(wěn)定。因此，在應(yīng)用過程中應(yīng)給予幾丁質(zhì)酶35 以下、偏酸性環(huán)境，這有利于提高酶的水解能力。相關(guān)資料顯示，Hg2+、Pb2+、Cu2+等重金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用，而Mg2+、Ca2+ 、Na+、K+對(duì)幾丁質(zhì)酶有激活作用15。而本試驗(yàn)結(jié)果與上述資料有較大差異，F(xiàn)e2

50、+、 Ba2+、K+、Na+對(duì)酶活性無明顯作用，而Cu2+、Ca2、Mn2+、Zn2+、Ag+、Mg2+、NH4+、Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑制作用。這可能是因?yàn)榻饘匐x子對(duì)幾丁質(zhì)酶的影響因酶的來源不同而有差異16，不同的酶發(fā)揮其活性所需的金屬離子不同。 理論上，變性劑、抑制劑可以使酶的結(jié)構(gòu)改變從而使酶變性失活或者與酶的活性中心結(jié)合降低酶的活性。試驗(yàn)表明，SDS、尿素、-巰基乙醇均對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用。幾丁質(zhì)酶對(duì)底物具有一定專一性，一般只可水解粉狀幾丁質(zhì)、膠狀幾丁質(zhì)、可溶性幾丁質(zhì)衍生物及可溶性的幾丁質(zhì)寡糖，而不能水解由幾丁二糖經(jīng)糖苷鍵連接而成的糖類，如麥芽糖、淀粉和纖維素等。本試驗(yàn)所研

51、究的GS-tachit1-K表達(dá)的幾丁質(zhì)酶特異性降解膠體幾丁質(zhì)。綜上所述，不同來源的幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)明顯不同，微生物幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)具有豐富的多樣性。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)微生物幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)研究，為幾丁質(zhì)酶研究及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。3.3 展望 近20年來，隨著幾丁質(zhì)及其衍生物多種生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)，其研究引起全球科技界和產(chǎn)業(yè)界的高度重視，全世界對(duì)幾丁質(zhì)類產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用日益深入，應(yīng)用范圍不斷拓展，現(xiàn)已在醫(yī)學(xué)、化工、食品、日用品、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用17。而幾丁質(zhì)酶由于能降解幾丁質(zhì)，轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生菌體蛋白、氨基寡糖素等產(chǎn)物，在人類食品、醫(yī)藥、化妝及動(dòng)物飼料等行業(yè)具有廣泛的開發(fā)前景18。 隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胛⑸锘蛑参飿?gòu)建工程菌，大量獲得幾丁質(zhì)酶已成為可能。某種微生物表達(dá)的幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)如何，在何種情況下該幾丁質(zhì)酶能發(fā)揮更大的水解活性，這需要我們加強(qiáng)幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，為幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。致謝在我進(jìn)行畢業(yè)論文試驗(yàn)的過程中，我的導(dǎo)師咸洪泉老師給予了我悉心的指導(dǎo)和親切的關(guān)懷。從課題的選擇直到試驗(yàn)的最終完成和論文的寫作，咸老師都始終給予我不懈的支持，在咸老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹笇?dǎo)下我的實(shí)驗(yàn)操作能力有了顯著提高，對(duì)科學(xué)研究有了更深的認(rèn)識(shí)和感悟，在此謹(jǐn)向咸老師致以深深的