【生物】土壤微生物綜合實驗報告

1、廣州高校綜合設計性試驗報告課程：微生物試驗試驗課題：土壤中產淀粉酶芽孢桿菌的選擇及淀粉酶 活力的測定學院：生命科學學院姓名：徐嘉寬學號： 1414300030班級：生技 142小組成員：一 試驗摘要本次試驗通過采納5 點采樣方法在校內中實行2 處土壤樣品，運用梯度稀釋的方法分別培育出不同生長形狀的細菌，鏡檢后選擇幾個菌落進行純培育，用淀粉培育基鑒定其是否產淀粉酶，通過單染色、芽孢染色、革蘭氏染色確定菌株的形狀及革蘭氏陰陽性，再通過各 種生化試驗鑒定菌株的特性，確定了我們所分別的2 株菌株其中一株為蠟狀芽孢桿菌；23 / 22二 試驗目的1. 把握從土壤等復雜的微生物環(huán)境中分別純化技術2. 把握

2、培育基的配置方法及常用的微生物培育方法3. 把握常用的微生物形狀學鑒定方法、生理生化鑒定方法4. 明白微生物的 16srrna序列鑒定方法、免疫學鑒定方法5. 把握淀粉酶活力測定的原理及方法6. 把握菌種保藏技術7. 培育數據統(tǒng)計、分析才能8. 培育團隊協(xié)作精神，增強溝通合作才能9. 與其他小組溝通合作、數據共享，進行更深化的探討10. 學會查找、收集、整理資料三 試驗原理芽孢桿菌 baciuus 是一類好氧或兼性厭氧、產生抗逆性內生孢子的桿狀細菌；這類細菌多數為腐生菌 , 主要分布于土壤、植物體表面及水體中, 由于它們能夠產生對熱、紫外線、電磁轄射和某些化學藥品有很強抗性的芽孢, 因此能忍耐

3、多種不良環(huán)境；土壤中包蘊著豐富的微生物資源, 芽孢桿菌是其中具有重要應用價值的微生物類群；有些菌種可以分泌多種酶, 可應用于工業(yè)生產 ; 有些菌種能產生對昆蟲毒性較強的蛋白 , 可生產微生物農藥 ; 有些菌種可作為多種分泌蛋白基因表達受體, 在基因工程領域中有較高的應用價值；土壤具有微生物進行生長繁衍和生命活動中所需的各種條件，是微生物生活最相宜的環(huán)境；其中的微生物的數量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異；一般地說，在土壤表面，由于日光照耀及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm30cm的土層中菌數最多，隨土層加深，菌的數量削減；淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱 , 是用于釀

4、酒、食品、醫(yī)藥、紡織、飼料等具有商業(yè)價值的重要酶類；廣州高校城四周環(huán)江，地處南亞熱帶 , 其氣候屬南亞熱帶典型的季風海洋氣候；芽孢桿菌資源特別豐富；本方案在廣州高校城預定區(qū)域釆集土壤樣品, 采納純培育的方法 , 分別獲得芽孢桿菌；對菌株進行形狀學觀看及生理生化分析, 以選擇出可產淀粉酶的菌株；四 試驗材料1.試劑與配方試劑： 牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、葡萄糖；可溶性淀粉、k2hpo、4kno、3mgso.47h2o、feso4.7h2o、95%乙醇、 0.5%番紅色液、蒸餾水等工具: 取樣：鐵鍬、尺子、塑料袋等培育：接種環(huán)（針）、培育皿、試管、試管架、錐形瓶、塞子、標簽紙、 打火機

5、、酒精燈、報紙、橡皮筋、無菌棉簽、載玻片、香柏油、二 甲苯、擦鏡紙、精密 ph 試紙、吸水紙、培育基平板，無菌水，試管架，酒精燈，酒精瓶，記號筆，廢物缸，牙簽等；其他工具：無菌操作臺、恒溫振蕩培育箱、恒溫培育箱配方：1) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 養(yǎng) 基 ： 養(yǎng)分瓊脂 3.3%、蒸餾水 100ml、ph7.2-7.4 ；2) 營養(yǎng)肉湯: 牛肉膏 0.3%、蛋白胨 1.0%、nacl 0.5%、蒸餾水 100ml、ph（5.7 、7.2 對比）；3) 半 固 體 培 養(yǎng) 基 運 動 性 試 驗 ） :瓊脂 0.5%、牛肉膏 0.3%、蛋白胨 1.0%、nacl 0.5% 、蒸餾水 100ml、

6、ph7.2-7.4 ；4) 酪 素 水 解 培 養(yǎng) 基 （ 酪 素 水 解 試 驗 :取 5g 脫脂奶粉與一號三角瓶中，加入 50ml 蒸餾水， 110滅菌；另稱 1.5g 瓊脂置于含 50ml 蒸餾水的二號三角瓶中 ,120 滅菌, 待冷至 45-50 c 時, 將兩液混勻倒成平板 , 即為牛奶平板；將平板倒置過夜 , 使表面水分干燥；5) 淀 粉 水 解 培 養(yǎng) 基 :養(yǎng)分瓊脂 3.3%、可溶性淀粉 2%、蒸餾水 100ml、ph7.2-7.46) 卵黃反應培育基：無菌條件下去卵黃加等量的生理鹽水，搖勻后，取 5ml 加入到融解的約50-55 的 100ml 的養(yǎng)分瓊脂中（內含 1g 葡萄

7、糖 ，混勻后倒入培育皿內；制成的卵黃平板過夜后即可使用；7) 硝 酸 鹽 仍 原 實 驗 培 養(yǎng) 基 :胰蛋白胨 1.0%, 酵母浸粉 0.5%,nacl 1.0%, kn03 0.1%,蒸餾水 1ooml,調劑ph7.0；8) 發(fā)酵培育基 :玉米粉 2%、黃豆餅粉 1.5%、cacl2 0.02% 、mgso4 0.02%、nacl 0.25% 、 k2hpo40.2%、 檸檬 酸鈉 0.2%、 硫酸 氨 0.075% 溶解 后加 、na2hpo4 0.2%,ph 值 7.0 ；9) 明膠培育基：nacl 0.5% 、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、明膠 12%、蒸餾 100ml，調 ph

8、7.2-7.4 ；10) 西蒙斯氏檸檬酸鈉鹽培育液：檸檬酸鈉 0.2%、nacl 0.5% 、mgso40.02%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫氨 0.1%、 溴麝香草酚藍水溶液 1ml、瓊脂 2%、蒸餾水 100ml、ph7.2-7.4 ；11 耐鹽試驗培育基（ 2%、5%、7%、10%）：養(yǎng)分瓊脂3.3%、nacl（ 0.2%、 0.5%、 0.7%、1.0%）、蒸餾水100ml、ph7.2-7.4 ；12) 糖發(fā)酵培育基（ 110滅菌） 12-1 葡萄糖發(fā)酵培育基：葡萄糖 1.0%、蛋白胨 0.2%、nacl 0.5%、磷酸氫二鉀 0.02%、溴鉀分子 0.2%（最終加入）、 ph7.2-

9、7.4 ；12-2 乳糖發(fā)酵培育基：乳糖 1.5%、蛋白胨 0.2%、nacl 0.5%、磷酸氫二鉀0.02%、溴鉀分子0.2%（最終加入）、 ph7.2-7.4 ；12-3 木糖發(fā)酵培育基：木糖 1.0%、蛋白胨 0.2%、nacl 0.5%、磷酸氫二鉀0.02%、溴鉀分子0.2%（最終加入）、 ph7.2-7.4 ；12-4 阿拉伯糖培育基：阿拉伯糖 1.0%、蛋白胨 0.2%、nacl 0.5%、磷酸氫二鉀 0.02%、溴鉀分子 0.2%（最終加入）、 ph7.2-7.4 ；12-5 甘露醇發(fā)酵培育基：甘露醇 1.0%、蛋白胨 0.2%、nacl 0.5%、磷酸氫二鉀 0.02%、溴鉀分

10、子 0.2%（最終加入）、 ph7.2-7.4 ；13) 葡萄糖蛋白胨培育基 vp、mr試驗）（ 110滅菌）： 葡萄糖 0.5%、蛋白胨 0.5%、nacl 0.5%、ph7.2-7.4 ；14) 蛋白胨水培育基（吲哚試驗）：蛋白胨 1.0%、nacl 0.5%、ph7.2-7.4 ；15) 酪氨酸培育基（酪氨酸水解試驗）：l- 酪氨酸 0.5g 懸浮于 10ml 蒸餾水中， 20min 110 滅菌，與 100ml 無菌養(yǎng)分瓊脂混合，即成酪氨酸水解平板；16) 1% 麥芽糖溶液取 0.1g 麥芽糖, 加入蒸餾水定容至 100ml；17) 0.85%無菌生理鹽水稱取 0.85g nacl 于

11、 100ml 蒸餾水中，搖勻， 120滅菌；18) 1% 3,5-二 硝 基 水 楊 酸 試 劑稱取 1 g 3,5- 二硝基水楊酸 , 溶于 20 ml 濃度 2 mol/l 氫氧化鈉溶液中 , 加入 50 ml 蒸餾水, 再加入 30 g 四水酒石酸鉀鈉 c4h4knao6 4h2o,待溶解后用蒸餾水定容至 100 ml, 蓋緊瓶塞 , 勿使 co2進入；19) 2%淀粉溶液: 稱取 2 g 可溶性淀粉溶于 100 ml 濃度 0.1 mol/ml ph 值 5.6 檸檬酸緩沖液中；20) 生化鑒定：草酸銨結晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、 0.5%番紅染液、香柏油、二甲苯、乙醚、碘液

12、、吲哚試劑、40%koh 、5%-萘酚溶液、甲基紅試劑等五 試驗步驟1. 土壤取樣分別在網球場旁的草地和體育館后面的草地采集5-20 深度的土壤，五點采樣，依次編號“ 1、2、3”樣品裝在無菌紙袋中；分別標記為樣品一和樣品二；記錄采樣時間、地點、環(huán)境、土壤類型、ph等；樣品 4儲存?zhèn)溆茫?. 分別純化稱取 5 g 土樣加入 45 ml 無菌生理鹽水中 , 混勻， 80 c 水浴 30min, 以殺死無芽孢細菌； 10 倍梯度稀釋 10-2-10-5 倍；用一支新的無菌槍頭從各濃度土壤稀釋液中分別吸取 0.2 ml 涂布于已標記好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培育基上 , 每個濃度梯梯度取兩個重復 , 標

13、記日期、時間、組別，置于 37培育箱中培育 24h；觀看已培育的細菌，將形狀不同的菌落在皿底用記號筆編號“ a01、a02、a03”后，進行劃線純化；先在已經平板培育基的一邊作第 1 次平行劃線 34 條，再轉動培育皿約 60角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第 1 次劃線部分作第 2 次平行劃線，再用同法通過第 2 平行劃線部分作第 3 次平行劃線和通過第 3 次平行劃線部分作第 4 次平行劃線；劃線完畢，在培育皿底部和頂部寫上菌落編號和對應的純化次數“ a01-1 、a02-1、a03-1”；標記日期、時間、組別后，將培育皿倒置于2829恒溫培育箱中培育約20h；再連續(xù)分區(qū)劃線 2

14、次，以獲得較純的菌種；每次劃線完畢，在培育皿底部和頂部寫上菌落編號和對應的劃線次數，標記日期、時間、組別；留意觀看記錄菌落形狀、表面及邊緣特點等，為“4.3 、初步鑒定”供應基礎；純化三、四次后鏡檢，挑取純化的菌種進行單染色，觀看細菌是否為桿狀，以及細菌的大小、兩端形狀、粗細、著色深淺等是否一樣；如不全為桿 狀，就棄用，如個體形狀不一樣，且形狀不一樣的兩種或多種細菌數量相當， 就再次純化，直至個體形狀一樣；3. 產淀粉酶芽孢桿菌的選擇用接種沾取純化的菌落分別點種到含淀粉培育基的無菌平板上，并標記菌落編號、日期、時間、組別，放置在37恒溫培育箱中培育48h；取出平板滴加路哥氏碘液，緩慢搖動至碘液

15、將平板掩蓋勻稱，靜置，產生透亮圈的菌株初步定為淀粉酶產生菌株 . 同時，測定產生透亮圈的寬度，選擇比較大的且菌落形狀不同的兩株菌株進行芽孢染色和革蘭氏染色；從試管中沾取備份菌株接種于牛肉膏蛋白胨培育基，37培育 12h 進行革蘭氏染色，培育 24h 進行芽孢染色；如未觀看到芽孢，挑取與之前挑取位置不同位置的菌落再次染色觀看；如仍未觀看到芽孢，從試管中挑取形狀與選取的菌株不同的菌株進行活化、染色；4. 單染色方法：1、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中心滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜；2、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥；3、固定：涂面朝上

16、，通過微火 2-3 次；4、染色：待玻片冷卻后加結晶紫（或者石炭酸復紅）1-2 滴于涂片上，覆蓋涂面染色 1-2 分鐘；5、水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無色為止（注：勿沖去菌體）；6、干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干；7、鏡檢：油鏡觀看并繪圖；將純化得到的單菌落分為兩份，其中一部分接種于試管斜面培育基37培育 24h 后，于 4儲存?zhèn)溆茫總€菌株做兩個重復備份，將菌株的原有編號中的 a 替換為 b，添加重復序號后編號，如“ b01-3-1 、b01-3-2 、b02-3- 1”；另一部分用來做產淀粉酶的芽孢桿菌選擇；5. 芽孢染色方法：1、 涂片、干燥及固定2、加溫染色：

17、加5%孔雀綠染色液于玻片上，微火加熱至冒蒸汽維護5 分鐘；3、水洗將玻片冷卻，水洗直到流出的水中無綠色為止；4、常溫復染：加番紅染色 2 分鐘后，傾去染色液，水洗，直接用吸水紙吸去余水；5、鏡檢：用油鏡觀看；記錄結果；6. 革蘭氏染色方法：1. 涂片、干燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1-2分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色；3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其掩蓋涂面1 分鐘，后水洗；4. 脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約 25 秒，后立刻用流水沖洗；5. 復染：滴加番紅染色液，染 2 分鐘，水洗后用吸水紙吸干；6. 鏡檢：觀看記錄染色結果；7

18、. 再次測定產淀粉酶性能用接種沾取已初步鑒定的菌株分別點種到含淀粉培育基的無菌平板上，并標記菌落編號、日期、時間、組別，放置在37恒溫培育箱中培育 48h；取出平板滴加路哥氏碘液，緩慢搖動至碘液將平板掩蓋勻稱，靜置，產生透亮圈的菌株初步定為淀粉酶產生菌株 . 同時，測定產生透亮圈的寬度，選擇比較大的且菌落；7. 菌種的長期儲存從試管中取產淀粉酶性能較優(yōu)的如干菌株用以下方法長期儲存；改進的甘油菌種儲存法：取上述典型菌落接種肉湯管,37 恒溫振蕩培育箱培育 46 h 亦可置于一般溫箱培育 68 h然后按 5 份培育液加入 2 份儲存液的比例加入已滅菌的儲存液 , 分裝于滅菌的微量離心管或細胞凍存管

19、中, 標記每株細菌儲存 2 支, 置-20 冰箱儲存；8. 初步鑒定前面的試驗選擇出了可產淀粉酶的芽孢桿菌，分別出陰性菌和陽性菌并分別培育；9. 生理生化鑒定（1）接觸酶試驗： 用接種環(huán)挑取適量菌苔插入裝有h2o2 的試管中，觀看是否有大量氣泡產生，將接種環(huán)灼燒、冷卻后插入 h2o2中作空白對比；（2）糖發(fā)酵試驗： 用接種環(huán)將兩種桿菌分別接種于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇的發(fā)酵管內，每種發(fā)酵管做兩個平行，標記，并設置不接種菌的相同發(fā)酵管做空白對照37培養(yǎng)24h；觀看記錄，與對比管比較，如接種培育液保持原有顏色，其反應結果為陰性，說明該菌不能利用該種糖，記錄用“- ”表示，如培育液呈黃色，反應

20、結果為陽性，說明該菌能分解該種糖產酸，記錄用“+”表示；培育液的杜氏小管內氣泡明顯增大為陽性反應，說明該菌分解糖能產酸產氣，記錄用“ +”表示，如杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應，記錄用“- ”表示；（3）v.p試驗： 取葡萄糖蛋白胨培育液的試管，編號，以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對比管不接菌，置37恒溫箱中，培育 24h，培育完后，取出上述試管充分震蕩 2min 每管分別加入 40%naoh溶液 1020 滴，并加萘酚，振蕩試管，置 37溫箱中保溫 15-30min 后，如培育基呈紅色，記錄為 v.p 試驗陽性反應（ +）表示，如不呈紅色，記錄為v.p 試驗陰性反應（用“ -

21、 ”）表示；（4） mr試驗：取葡萄糖蛋白胨培育液的試管，編號，以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對比管不接菌，置 37恒溫箱中，培育 24h，培育完后，取出上述試管，加入甲基紅試劑 2 滴，變紅色就呈陽性（ +），黃色為陰性（ - ）；（ 5） 吲 哚 試 驗 ： 取裝有蛋白胨水培育液的試管編號，以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中，并做空白對比，置 37培育箱中 24h，在培育液中加入乙醚 1-2ml ，經充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培育液的上面，此時沿管壁緩慢加入5-10 滴吲哚試劑，如有吲哚存在， 乙醚層呈玫瑰紅色，說明吲哚試驗為陽性反應，否就為

22、陰性反應；（6）耐鹽試驗： 將分別獲得的菌種分別接種在含鹽2%、5%、7%、10%的培育基中，設置一組對比，一組平行試驗組，并置于37下培育，觀看生長狀況，并做記錄；記錄方式如下：不生長：- ，生長差： +，生長一般： +，生長良好： +；（7）檸檬酸鹽利用試驗: 取如干裝有西蒙斯檸檬酸鹽培育基的試管，將菌種接入試管，置于37 恒溫箱中培育2448h；如培育基為藍色，就說明能利用檸檬酸鹽作為碳 源生長，以“ +”表示；如培育基為綠色就為陰性，以“”表示；(8) 明膠試 驗:挑取菌種，以較大量穿刺接種于明膠高層約 2/3深度或點種于平板培育基；于 2022培育 714 天；每天觀看結果，如因培育

23、溫度高而使明膠 本身液化時，應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀看其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽性，以“+”表示；平板試驗結果的觀看為在培育基平板點種的菌落上滴加試劑，如為陽性，10-20min 后，菌落四周應顯現(xiàn)清楚帶環(huán)；否就為陰性；(9) 硝酸鹽仍原試驗:接種于硝酸鹽培育基中，于35培育 1-4d. 將甲、乙液等量混合后（約0.1 ml ）加入培育基內，立刻觀看結果；結果：顯現(xiàn)紅色為陽性；如加入試劑后無顏色反應，可能是：硝酸鹽沒有被仍原，試驗陰性；硝酸 鹽被仍原為氨和氮等其他產物而導致假陰性結果，這時應在試管內加入少 許鋅粉，如顯現(xiàn)紅色就說明試驗的確為陰性；如仍不產生紅色，表示

24、試驗 為假陰性；如要檢查是否有氮氣產生，可在培育基管內加一杜氏小管， 如有氣泡產生，表示有氮氣生成；10）酪素水解試驗： 取牛奶平板，將菌種劃線接在平板上，每皿1 株菌；設置一組對比，一組平行試驗組，并置于37恒溫箱培育，如菌落四周和下面酪素已被分解 而呈透亮就為陽性；（11）酪氨酸水解試驗： 取酪氨酸平板，將測試菌接種于劃線接于培育基上，設置一組對比，一組平行試驗組，并置于37恒溫箱培育，如酪氨酸結晶被水解而變透亮就為陽性；（12）運動性試驗： 使用半固體養(yǎng)分瓊脂試管, 將接種針從培育基中心自上而下直刺到試管底1-1.5cm 處，沿穿刺線拔出接種針，置于37培育箱中培育 24 小時觀看；觀看

25、是否為樹根狀生長，如有，就菌株有鞭毛，如直立生長，就菌株無鞭毛；（13）溫度試驗：使用牛肉膏蛋白胨培育基，將菌株接種到平板上，分別在5、 15、20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60條件下培育24 小時，觀看細菌是否生長；14ph 試驗：將菌株分別接種到不同 ph為 5.7 和 7.2 的養(yǎng)分肉湯中，置于 37培育 24小時，觀看是否長菌，比較生長情形；（15）卵黃反應試驗：取 18-24 小時的斜面或培育液中的菌體，點種在卵黃反應培育基中，點的直徑約為 2-3mm，置于 37培育箱中培育 18-24 小時，觀看，如菌落四周形成乳白色的渾濁環(huán)，表示卵磷脂分解生成脂

26、肪，說明有卵磷脂酶；（16）0.001%溶菌酶試驗：將菌種制成菌懸液，涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂培育基上，將潔凈的小濾紙片充分浸在溶菌酶試劑中，貼在平板上，置于37培育箱中培育 24 小時后觀看，如顯現(xiàn)抑菌圈，就為陽性反應，無就為為陰性反應；10. 結果鑒定依據以上測定結果， .查閱伯杰氏手冊，判定分別的菌種；六 留意事項1、稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應準時蓋緊瓶蓋；調ph 時要當心操作，防止回調；不同培育基各有配制特點，要留意具體操作；2、革蘭氏染色時留意脫色的時間的掌握，過長或過短都會影響試驗結果；3、現(xiàn)有一株細菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗大桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應；你應如何確保你

27、的染色結果的正確性；4、進行染色鑒定時，都應有已知的對比菌種在同等條件下染色，然后進行對比記錄結果；5、在芽孢染色中，應留意溫度的掌握，防止染料在玻片上蒸騰，否就影響試驗結果；6、配制檸檬酸鹽培育基時要掌握好ph ，不要過堿，配出的培育基以淺綠色為準；7、在測驗 mr 試驗的結果時，甲基紅指示劑不行加太多，以免顯現(xiàn)假陽性反應；8、試驗中用到的試管、培育皿等儀器要貼明標簽，在接種或者使用時必需認真核對菌名和培育基，以免弄錯；9、配制吲哚試驗用的蛋白胨水培育基，宜選用色氨酸含量高的蛋白胨（用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨，色氨酸含量較高），否就將影響產吲哚的陽性率；10、菌株較多，務必留意標記的精確

28、性；11、務必保證原始記錄精確、具體；12、全程拍照記錄，務必精確記錄照片信息，防止顯現(xiàn)“有照片，卻遺忘照片記錄的是什么內容”這種尷尬；13、留意記錄菌株所對應的土壤樣品編號；14、如芽孢桿菌菌齡較小，可能會顯現(xiàn)革蘭氏陰性反應；15、為保證最終獲得的菌株是從土壤中分別出來的，從取樣開頭就要留意無菌操作；七 試驗結果與分析1. 土壤樣品多菌落，有5色光滑的菌一大片白色一個白色光滑的種不同的菌落仍有 4 個連在一起的光滑菌落菌落白色半透亮菌落一個放射狀土壤序號采集時間1采集地點 廣大體育場后草地 廣大網球場附近天氣溫度土壤顏色土壤氣味土壤濕度2021-12-210:34a.m.27偏紅褐色土腥味干

29、燥22021-12-2210:52a.m.27黃色土腥味干燥2.稀釋涂布生長情形土壤序號稀釋梯度10-210-3 （1）有一片白色致密的菌苔，一個黃10-3 （ 2）10-412較多菌落，絨毛白色菌落和一個較小白色菌落無菌兩個白色光滑菌落經過爭論，我們選取了兩個10-3 梯度進行稀釋；經過24h 后，我們挑取生長出的各菌進行培育，劃線分別2 次后，進行鏡檢；3. 鏡檢a. 單染色觀看：菌種 a ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下進行觀看，可以觀看到紅色的鏈狀排列的桿菌，同時仍有其他不同粗細的桿菌，不純；菌種 b ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅色的粗桿狀細菌；菌

30、種 c ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅色的粗桿狀細菌，且細菌中部有著色淺或無色的部位，估計應為芽孢；菌種 d ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅色的桿狀細菌，細菌相對其他較小和短，視野中個別有芽孢；菌種 e ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅色的粗桿狀細菌，視野中顯現(xiàn)較多芽孢，且菌體較大較粗；菌種 f ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅色的桿狀細菌；菌種 g ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，觀看到被染成紅色的鏈狀桿菌；菌種 h ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅

31、色的桿狀細菌，視野中顯現(xiàn)芽孢，一般在桿狀菌中部；菌種 i ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，有染成紅色的桿狀細菌，視野中有個別芽孢；菌種 j ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，觀看到被染成紅色的鏈狀桿菌；菌種 k ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，觀看到被染成紅色的球狀菌；菌種 l ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，視野中觀看到紅色的球狀菌和紅色的桿狀菌；菌種 m ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下進行觀看，可以觀看到紅色的鏈狀排列的桿菌，同時仍有其他不同粗細的桿菌，不純；菌種 n ：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下進行觀看，視

32、野中觀看到紅色的球狀菌；經過單染色的鏡檢，我們打算使用e、g、h、j 這四個菌；再次分別劃線后，進行產淀粉酶檢測和革蘭氏染色以及芽孢染色；b. 革蘭氏染色觀看：菌種 e：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紫色，證明該菌為革蘭氏陽性菌；菌種 h ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紫色，證明該菌為革蘭氏陽性菌；菌種 j：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紅色，證明該菌為革蘭氏陰性菌；菌種 g：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紅花色，證明該菌為革蘭氏陰性菌；c. 芽孢染色觀看：菌種 e：用顯微鏡在 10

33、*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紫紅色，細菌中部被染成綠色，為該菌芽孢，芽孢較多；菌種 h ：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紫紅色，細菌中部被染成綠色，為該菌芽孢，芽孢較多；菌種 j：用顯微鏡在10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紫紅色，細菌中部被染成綠色，為該菌芽孢，芽孢較少；菌種 g：用顯微鏡在 10*100 的放大倍數下觀看，桿狀細菌被染成紫紅色，細菌中部被染成綠色，為該菌芽孢，芽孢較少；4. 選擇能產淀粉酶的菌種菌種編號e h jg淀粉圈大小+ 0注：由于接種淀粉培育基時采納了劃線的方法，不好測量淀粉水解圈的半徑，所以用“+”號來表示淀粉

34、水解圈的大??；“+”越多表示淀粉水解圈越大；綜合菌落四周的淀粉圈大小以及菌落的生長情形，舍去不產淀粉圈的g 菌和芽孢較少的j 菌，我們選用了e和 h 菌進行試驗；為便利記錄，我們把e 菌標為 2， h 菌標為 4.5生理生化鑒定a.vp 試驗：菌種 e1、e2 現(xiàn)象大致相同，均呈淺紅色，為陽性（菌種 h1、h2 現(xiàn)象大致相同，均呈淺紅色，為陽性（ 空白 : 呈黃色；+）；+）；b.糖發(fā)酵試驗：在葡萄糖 發(fā)酵中： e1 、e2 均呈黃色，無氣泡，顯陽性（+）；h1 ，h2 均呈黃色，無氣泡，呈陽性（+）；空白 :呈深紫色，無氣泡；在阿拉伯糖 發(fā)酵中： e1 、e2 呈紫色，無氣泡，呈陰性（）；菌

35、落長在液體表面，較少；h1 、h2 均呈紫色，無氣泡，呈陰性（）；菌落長在液體表面，較少，但比 e 多；空白：呈深紫色，無氣泡；在木糖 發(fā)酵中： e1、e2 呈紫色，無氣泡，呈陰性（）；菌體長在液體的表面，菌苔厚；h1 、h2 均呈紫色，無氣泡，呈陰性（）；菌落長在液體表面，菌苔厚；空白：均呈紫色，無氣泡；在甘露醇 發(fā)酵中： e1、 e2 均呈紫色，無氣泡，呈陰性（）；菌落長在液體表面，菌苔厚；h1 、h2 均呈紫色，無氣泡，呈陰性（）；菌落長在液體表面，菌苔厚；空白 :呈深紫色，無氣泡；c. 接觸酶試驗：菌種 e1、e2 試驗現(xiàn)象大致相同；在裝有h2o2 的試管中分別接入菌種e1、e2，都沒

36、有氣泡產生，說明該菌的接觸酶試驗為陰性（）；菌種 h1、h2 試驗現(xiàn)象大致相同，在裝有h2o2 的試管中分別接入菌種h1 、h2，都沒有氣泡產生，說明該菌的接觸酶試驗為陰性（）；空白組，沒明顯現(xiàn)象；d. mr 試驗：菌種 e:菌種 e1 與菌種 e2 試驗現(xiàn)象大致相同；在滴加甲基紅后的培育基溶液，顏色由紫色變成紅色，說明菌種e 在 mr 試驗中表現(xiàn)為陽性；菌種 h:菌種 h1 與 h2 試驗現(xiàn)象大致相同；在滴加甲基紅后的培育基溶液，顏色由紫色變成紅色，說明菌種h 在 mr 試驗中表現(xiàn)為陽性；空白組：無明顯現(xiàn)象；e. 吲哚試驗：菌種 e: 菌種 e1 與菌種 e2 試驗現(xiàn)象大致相同；在進行吲哚試

37、驗后，培育基液體變渾濁，在液體層面形成透亮無色環(huán)帶，說明菌種e 在吲哚試驗中變現(xiàn)為陰性；菌種 h; 菌種 h1 與菌種 h2 試驗現(xiàn)象大致相同；在進行吲哚試驗后，培育基中液體未變渾濁；在液體層面形成透亮無色環(huán)帶，說明菌種h 在吲哚試驗中變現(xiàn)為陰性；空白組 ;無明顯變化；f. 耐鹽試驗：菌種 e鹽濃度培育基編號菌落大小2%1+2+5%1+2+7%1+2幾乎不長菌101幾乎不長菌2幾乎不長菌菌種 h鹽濃度培育基編號菌落大小2%1+2+5%1+2+7%1+2幾乎不長菌101幾乎不長菌2幾乎不長菌分析：縱向對比， e 菌種能在含鹽量為2%5% 的培育基中生長，在7%幾乎不生長，且在含鹽量為2%生長最旺

38、盛；而h 菌種也能在含鹽量為2%5%的培育基中生長，在 7% 幾乎不生長，且在含鹽量為2%生長最旺盛；g. 檸檬酸鹽利用試驗：菌種 e:菌種 e1 、e2 試驗現(xiàn)象大致相同；檸檬酸鹽培育基（試管）從一開頭的綠色在第二天開頭漸漸變?yōu)樗{色，到第四天完全變?yōu)樗{色，說明菌種e 在檸檬酸鹽利用試驗中變現(xiàn)為陽性（+）；菌種 h1 、h2 試驗現(xiàn)象大致相同；檸檬酸鹽培育基試管 在培育七天后顏色一樣時綠色，說明菌種 h 在檸檬酸鹽利用中變現(xiàn)為陰性（）；空白組：檸檬酸鹽培育基無明顯變色現(xiàn)象；h. 明膠試驗 ;在 37培育箱中培育2 天后，并在冰箱報存1 天；從冰箱拿出來沒有顯現(xiàn)融解的現(xiàn)象；證明兩種菌明膠試驗均呈

39、陰性，明膠不被菌液化；本試驗證明兩種菌都不產生明膠酶，一種胞外酶，不能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力；試驗需要在37培育 2 日，冰箱冷藏 1 天，每天觀看，且不能震驚試管；i. 硝酸鹽仍原試驗：菌種 e:e1 和 e2 試驗現(xiàn)象大致相同；試驗反應中，培育基溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色；說明菌種能利用硝酸鹽，其在硝酸鹽仍原試驗中變現(xiàn)為陽性；菌種 h: 菌種 h1 、h2 試驗現(xiàn)象大致相同；試驗反應中，培育基溶液顏色由黃色變成紅色；說明菌種能利用硝酸鹽，其在硝酸鹽仍原試驗中表現(xiàn)為陽性；空白組：培育基顏色始終為黃色，無明顯試驗現(xiàn)象；j. 酪素水解試驗：菌種 e;菌種 e1 和 e2 的試驗現(xiàn)象大致相

40、同，都產生透亮圈，說明菌種e 能產生可以水解酪素的物質，在酪素水解試驗中變現(xiàn)為陽性；菌種 h；菌種 h1 和 h2 的試驗現(xiàn)象大致相同，都產生透亮圈，說明菌種h 能產生可以水解酪素的物質，在酪素水解試驗中變現(xiàn)為陽性；空白組：勻稱乳白色平布培育基，無明顯現(xiàn)象；本小組采納的是點解的方法接種，每個培育基點接4 次，透亮圈大小如下；菌種透亮圈半徑（cm）平均值（ cm）e0.30.26250.40.50.10.20.20.10.3h0.30.350.30.30.40.40.40.30.4k. 酪氨酸水解試驗：菌種 e 和 h 都無菌生長，培育基無明顯變化；空白組 ;無菌生長，無明顯變化；兩種菌都不能利

41、用酪氨酸；l. 運動性試驗菌種 e:菌種 e1 和 e2 的試驗現(xiàn)象大致相同，沿著穿刺的路徑有白色菌生長，邊緣呈云霧狀生長柱；菌種 h:菌種 h1 和 h2 的試驗現(xiàn)象大致相同，沿著穿刺的路徑有白色菌生長，邊緣呈云霧狀生長柱；空白：試管澄清，無菌生長；m.溫度試驗：分析：菌種 e 和 h 中能觀看到邊緣呈絨毛狀的云霧狀生長柱，說明e 菌種和 h 菌種都具有運動才能，說明e 菌種和 h菌種都具有鞭毛；菌種e5010+15+20+25+35+40+45+50很少55+600h0+很少00空白組：空白組在個個梯度上都無菌落產生，說明培育基無雜菌污染；分析：菌種 e 在 5 55都有菌種長出，但在60

42、條件下幾乎沒長菌株；說明菌種e大致的耐熱范疇為：555；但是50時，培育基卻沒菌，應當是我們接種時技術不過關，沒能接上菌；菌種 h 在在 5 50都有菌種長出，但在50條件下所長菌株很少，而55和60下菌幾乎部長，說明菌種h大致的耐熱范疇為： 550；n. 養(yǎng)分肉湯 ph 試驗：菌種 e; 菌種 e1 和菌種 e2 試驗現(xiàn)象大致相同；菌種e 在 ph為 5.7 時，皆長菌，但長的菌比 h 菌種少；在 ph為 7.2 時，也長菌，且菌都長在培育液表面，說明菌種e 為好氧菌；菌種 h：菌種 h1 和 h2 試驗現(xiàn)象大致相同；菌種h 在 ph為 5.7 和 ph 為 7.2 時皆長菌，且菌長在肉湯的

43、底部；說明其為厭氧菌；空白組：空白組在各個酸堿度的培育條件下均無菌落產生，說明培育基無雜菌污染；o. 卵黃反應試驗：菌種e： e1 和 e2 均能生長，菌落四周形成乳白色的渾濁環(huán)，不透亮圈半徑為0.4875 ，比 h 的生長情形略微旺盛，表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶，呈陽性（+） .菌種 h： h1 和 h2 均能生長，菌落四周形成乳白色的渾濁環(huán)，不透亮圈半徑為0.4cm；表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶，呈陽性（+）；空白組：無菌生長，菌落四周沒有形成乳白色的渾濁環(huán)；分析 ：雞蛋的卵黃由于有卵黃膜包裹，不與外界相通，因此為無菌狀態(tài)，無需滅菌；在吸取卵黃液前，先把蛋殼敲碎一小塊，再把蛋清除去，不行弄壞亂卵黃膜，防止雜菌污染；由于我們采納