免疫組化染色操作順序

1、免疫組化染色操作順序文件編碼(GHTUUITID-GGBKT-POIU-WUUI8968)免疫組織化學(xué)染色原理和操作步驟一、免疫組織化學(xué)原理免疫組織化學(xué)（IHC）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是根據(jù)抗原一抗體特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用 帶有可見標(biāo)記的特異性抗體作為探針，檢測(cè)組織和細(xì)胞中抗原性物質(zhì)的一種技術(shù)。免疫組 化技術(shù)主要有直接法和間接法：直接法是以標(biāo)記的一抗卿育標(biāo)本以檢測(cè)其中的抗原成分； 間接法則先后加入一抗和二抗，形成抗原一一抗一二抗復(fù)合體以達(dá)到檢測(cè)該抗原的目的， 該法因二抗的放大作用而具有較高的敏感性。間接法常用的有過氧化物酶一抗過氧化物酶（PAP）法、親和素一生物素一過氧化物酶（ABC）法和鏈零親和

2、素一過氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不標(biāo)記，避免了標(biāo)記過程對(duì)抗體活性的影響，但需要制備過氧化 物酶的抗體，與適量過氧化物酶混合形成PAP復(fù)合物（含3個(gè)酶分子和2個(gè)抗體分子）， 染色時(shí)依次加入一抗、二抗、PAP復(fù)合物孵育標(biāo)本，最后用H：0：和二氨基聯(lián)苯（DAB）為底 物顯示過氧化物酶，即可檢測(cè)標(biāo)本中的抗原成分。生物素為含硫的雜環(huán)單竣酸，可通過其竣基與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，從而標(biāo)記抗體和 酶。親合素又稱抗生物素蛋白，與生物素有很高的親合力，1分子親合素可結(jié)合4分子生 物素，ABC法即在此基礎(chǔ)上建立。ABC法與PAP法相似，一抗不標(biāo)記，二抗用生物素標(biāo) 記，染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記

3、的過氧化物酶混合，制成ABC復(fù)合物，并使 親合素分子上至少空出一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。在標(biāo)本孵育過一抗和二抗后，再加入ABC復(fù) 合物使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入DAB進(jìn)行顯色。ABC法的敏感性較PAP法更 高。圖1.免疫組織化學(xué)基本原理示意圖（引自八年制組織學(xué)與胚胎學(xué)）SP法與ABC法相似，其不同于ABC法之處在 性與親和素相似的鏈親和素標(biāo)記過氧化物酶。在標(biāo) 和二抗后，加入鏈親和素標(biāo)記的過氧化物酶使其結(jié) 物素上，最后加入DAB進(jìn)行顯色。與親和素相比， 結(jié)合力與親和素相似而非特異性結(jié)合較親和素低。作步驟，同時(shí)也減少了非特異性背景，是目前應(yīng)用 疫綏化染色技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1.標(biāo)本準(zhǔn)備1石蠟包埋

4、組織切片：由病理室常規(guī)處理2冰凍組織切片：由病理室常規(guī)處理3細(xì)胞爬片：將無(wú)菌蓋玻片置于六孔板中，接種細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%以上后取出玻 片，4%多聚甲醛固定2h。2.試劑準(zhǔn)備1抗體選擇單克隆抗體針對(duì)單一表位，具有較高的特異性，但在該表位破壞后將得不到陽(yáng)性結(jié)果；多克隆抗體表位針對(duì)多個(gè)表位，可避免單克隆抗體的缺點(diǎn)，但是可能出現(xiàn)非特異性雜 交。因此，不論選擇單克隆還是多克隆抗體，最好同時(shí)購(gòu)買兩個(gè)貨號(hào)的抗體，購(gòu)買抗體時(shí) 一定要明確是能夠做IHC的抗體，抗體說(shuō)明書上必須有IHC測(cè)試結(jié)果。如果該分子文獻(xiàn)報(bào) 道較多，可選擇文獻(xiàn)上常用的經(jīng)典抗體。2二抗試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用二抗試劑盒為L(zhǎng)ifeTechno

5、logiesHistostain-PlusKit (HRP, BroadSpectrum),貨號(hào)85-9043,一抗反應(yīng)性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。于用生物學(xué)特本孵育過一抗合到二抗的生鏈酶親和素的SP法簡(jiǎn)化了操最為廣泛的免cI.亠I片3DAB試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用為加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒，貨號(hào)DAB-2032。4其他試劑二甲苯、無(wú)水乙醇、蘇木素、中性封片樹脂、檸檬酸鈉、APES膠3.抗體特異性驗(yàn)證所有免疫組化抗體均須Westernblot驗(yàn)證抗體特異性，并需免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗原定 位。4.耗材準(zhǔn)備免疫組化筆或者蠟筆、蓋玻片、載玻片5.溶液配制1磷酸鹽緩沖液（PBS）10XPBS母液配制NaCl7

6、2gNa2HP0, 12H2037. 3gKH2PO54.3g加烝鐳水金1000ml充分混勻貯存。使用時(shí)用蒸僻水10倍稀釋，調(diào)整pH值至7. 37. 4。2檸檬酸抗原修復(fù)液抗原修復(fù)使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，配方如下：稱取檸檬酸10. 5g,溶于500ml蒸館水;稱取Na2HPO5- 12H.057. 3g,溶于800ml蒸館 水。分別量取358ml檸檬酸溶液和642mlNa2HP01溶液，充分混勻后調(diào)整pH值至6. 0,即得2X母液，貯存?zhèn)溆谩?1%鹽酸酒精濃鹽酸與75%酒精按照1:99比例混合，充分混勻。三、免疫組化操作步驟1.組織片脫蠟水化1將組織片依次放入3個(gè)裝有二甲苯溶液的玻璃缸中

7、浸泡，每缸15mino2依次放入2個(gè)裝有無(wú)水乙醇的玻璃缸，每缸5mino3依次放入2個(gè)裝有95%乙醇的玻璃缸，每缸5mino4依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2min,取出。5放入自來(lái)水、蒸懈水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次。2.抗原修復(fù)將切片浸入IX檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱2min,然后停止 加熱讓切片自然冷卻。注意：抗原修復(fù)過度或不足，均會(huì)影響最終染色結(jié)果。切片驟冷可致脫片，必須自然 冷卻！3.封閉內(nèi)源性過氧化氫酶1放入3%比0：溶液的玻璃缸中，浸泡15mino2放入蒸館水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次。3放入PBS緩沖液的玻璃缸中，浸泡5min。4.抗體

8、雜交1甩去PBS余液，將組織片平輔在濕盒中，加正常山羊血清1滴20 P1（試劑盒中的A液，根據(jù)組織大小調(diào)整用量）,28C放置20min,甩干。2加稀釋好的一抗1滴（20、50ul,根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整）,置于濕盒4C過 夜。3置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min,更換PBS緩沖液，同法操作4次， 甩干。4加入生物素偶聯(lián)的二抗2050 u 1（試劑盒中的B液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），放置濕盒，37C放置20mino5置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min,更換PBS緩沖液，同法操作3次， 甩干。5.顯色1加鏈親和素-辣根過氧化物酶20、50卩1（試劑盒中的C液，根據(jù)組織塊大

9、小進(jìn)行調(diào)整），濕盒內(nèi)28C放置520min,甩干。2置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min,更換PBS緩沖液，同法操作3次， 甩干。3滴加新鮮配制的DAB工作液100P1（以覆蓋組織為宜），放置觀察反應(yīng)部位呈現(xiàn)黃 褐色時(shí)（35min）,置裝有自來(lái)水玻璃缸中涮洗3次；6.復(fù)染浸入蘇木精溶液中復(fù)染，放置5min后，用自來(lái)水反復(fù)涮洗至水不變色，再用1%鹽酸酒精分化12s后，自來(lái)水沖洗后，反藍(lán)水洗2min。7.脫水、透明和封片1依次放入95%、95%乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min,取出；2依次放入2個(gè)無(wú)水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min,取出。3依次放入2個(gè)裝有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5min,取出。4滴加適量中性樹膠，封片，晾干。8.注意事項(xiàng)整個(gè)染色過程中組織塊要保持濕潤(rùn)，不能干片，否則會(huì)導(dǎo)致非特異性染色。組織切片邊緣易干，因此抗體、封閉液、顯色液等試劑要充分覆蓋組織塊，避免干 片。四、結(jié)果判定1.陽(yáng)性細(xì)胞判斷DAB顯色呈黃色。每批染色都要有特異性陽(yáng)性和陰性對(duì)照為基礎(chǔ)，才能對(duì)染色結(jié)果作 出判斷?？乖磉_(dá)必須在特定部位，對(duì)于臨床診斷來(lái)說(shuō)，不在抗原所在部位的陽(yáng)性著色， 一概不能視為陽(yáng)性。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的著色多系內(nèi)源干擾 或人為因素所致，不能視為陽(yáng)性。2.抗原表達(dá)評(píng)價(jià)免疫顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，實(shí)際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)