病毒感染的微生物學(xué)檢查方法課件

1、病毒感染的微生物學(xué)檢查方法病毒感染的檢查方法病毒感染的檢查方法電鏡技術(shù)電鏡技術(shù)血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定標(biāo)本采集與送檢標(biāo)本采集與送檢病毒感染的微生物學(xué)檢查方法一、標(biāo)本采集與送檢一、標(biāo)本采集與送檢原則：原則： 1.1.盡早采?。喊l(fā)病初期盡早采取：發(fā)病初期 2.2.部位適宜：由感染部位采取部位適宜：由感染部位采取 3.3.冷藏速送：裝有冰塊或干冰的容器內(nèi)冷藏速送：裝有冰塊或干冰的容器內(nèi)（一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本（一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本（二）檢測(cè)特異性抗體（二）檢測(cè)特異性抗體 的標(biāo)本的標(biāo)本 采集雙份血清，采集雙份血清，4-2

2、04-20保存保存病毒感染的微生物學(xué)檢查方法病毒材料采集與檢驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系病毒材料采集與檢驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系采取標(biāo)本的時(shí)期采取標(biāo)本的時(shí)期檢查病毒及其成分檢查病毒及其成分測(cè)定抗體測(cè)定抗體潛伏期及前驅(qū)期潛伏期及前驅(qū)期剛發(fā)病或急性期剛發(fā)病或急性期恢復(fù)期及康復(fù)期恢復(fù)期及康復(fù)期較難查見較難查見最多查見最多查見很難查見很難查見未增多未增多未增多或增未增多或增多不明顯多不明顯明顯增多明顯增多（常超過(guò)（常超過(guò)4 4倍）倍）病毒感染的微生物學(xué)檢查方法l病毒分離是診斷病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，一旦陽(yáng)性，即病毒分離是診斷病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，一旦陽(yáng)性，即可確診?？纱_診。l不適用于快速診斷，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本高，陽(yáng)性不適用于快速診斷，操

3、作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本高，陽(yáng)性檢出率低等檢出率低等l有時(shí)不得不分離病毒，例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病，有時(shí)不得不分離病毒，例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病，必須分離病毒進(jìn)行研究，或者分離株的鑒定對(duì)流行必須分離病毒進(jìn)行研究，或者分離株的鑒定對(duì)流行病學(xué)有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫病學(xué)有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望獲得天然弱毒株等。苗，或者希望獲得天然弱毒株等。二、常規(guī)分離與鑒定二、常規(guī)分離與鑒定病毒感染的微生物學(xué)檢查方法（一）病毒分離（一）病毒分離標(biāo)本采集標(biāo)本采集殺滅雜菌殺滅雜菌（青鏈霉素青鏈霉素）接種接種鑒定病毒種型鑒定病毒種型易感動(dòng)物易感動(dòng)物出現(xiàn)病狀出現(xiàn)病狀雞胚雞胚病變或死亡病

4、變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變細(xì)胞病變?nèi)蠓椒ㄈ蠓椒ú《靖腥镜奈⑸飳W(xué)檢查方法（二）病毒鑒定（二）病毒鑒定1. 1. 形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)鑒定觀察觀察CPECPE。常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、。常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。正常細(xì)胞正常細(xì)胞病變細(xì)胞病變細(xì)胞病毒感染的微生物學(xué)檢查方法l感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的能力感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的能力l感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細(xì)胞感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細(xì)胞的作用的作用2. 2. 血吸附和血凝作用血吸

5、附和血凝作用多見于以出芽方式釋放的病毒。多見于以出芽方式釋放的病毒。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法紅細(xì)胞吸附紅細(xì)胞吸附正常細(xì)胞正常細(xì)胞（1 1）血吸附作用）血吸附作用吸附試驗(yàn)可通過(guò)特異抗血清抑制來(lái)達(dá)到鑒定吸附試驗(yàn)可通過(guò)特異抗血清抑制來(lái)達(dá)到鑒定具有吸附特性的病毒具有吸附特性的病毒病毒感染的微生物學(xué)檢查方法（2 2）血凝作用）血凝作用血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)病毒感染的微生物學(xué)檢查方法（3 3）病毒成分的直接檢測(cè)）病毒成分的直接檢測(cè)用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)直接檢查感染用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)直接檢查感染細(xì)胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。細(xì)胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。病毒感染的微生

6、物學(xué)檢查方法三、三、 電子顯微鏡檢查電子顯微鏡檢查 病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 病毒感染的微生物學(xué)檢查方法1. 1. 正染法：超薄切片法正染法：超薄切片法取材取材固定固

7、定戊二醛戊二醛四氧化鋨四氧化鋨清洗與清洗與脫水脫水浸透浸透包埋包埋聚合聚合切片切片染色染色鈾染鈾染鉛染鉛染病毒感染的微生物學(xué)檢查方法雞痘病毒（超薄切片）雞痘病毒（超薄切片）病毒感染的微生物學(xué)檢查方法超薄切片法的優(yōu)缺點(diǎn)：超薄切片法的優(yōu)缺點(diǎn)：l優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過(guò)程可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過(guò)程l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長(zhǎng)時(shí)間保存操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長(zhǎng)時(shí)間保存病毒感染的微生物學(xué)檢查方法2.2.負(fù)染技術(shù)負(fù)染技術(shù)負(fù)染是指通過(guò)重金屬鹽在樣品四周的堆積而負(fù)染是指通過(guò)重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯

8、托出樣品的形態(tài)和大小。反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法口蹄疫病毒的電鏡負(fù)染口蹄疫病毒的電鏡負(fù)染病毒感染的微生物學(xué)檢查方法負(fù)染法的優(yōu)缺點(diǎn)：負(fù)染法的優(yōu)缺點(diǎn)：l優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)易（快速簡(jiǎn)易（10-20min10-20min）；分辨率高；圖象清晰）；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)地病毒結(jié)構(gòu)l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在敏感性低，要求病毒量在10107 7以上；所有樣品應(yīng)處以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)于懸浮狀態(tài)病毒感染的微生物學(xué)檢查方法免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微子顯微鏡的高分辨力相

9、結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。度精確、靈敏的方法。 3.3.免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)( (Immune electron microscopyImmune electron microscopy，IEMIEM) )病毒感染的微生物學(xué)檢查方法（1 1）免疫凝集電鏡技術(shù)）免疫凝集電鏡技術(shù)抗原與抗體凝集反應(yīng)后，可使標(biāo)本中病毒顆粒聚抗原與抗體凝集反應(yīng)后，可使標(biāo)本中病毒顆粒聚集成團(tuán)，再經(jīng)負(fù)染直接在電鏡下觀察，提高了敏集成團(tuán)，再經(jīng)負(fù)染直接在電鏡下觀察，提高了敏感性，確定病毒的血清學(xué)性質(zhì)。感性，確定病毒的血清學(xué)性質(zhì)。病

10、毒感染的微生物學(xué)檢查方法（2 2）免疫電鏡定位技術(shù)）免疫電鏡定位技術(shù)特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、過(guò)氧化物酶等標(biāo)特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、過(guò)氧化物酶等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。 酶標(biāo)記染色酶標(biāo)記染色 病毒感染的微生物學(xué)檢查方法四、四、 血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn) 是一種常用的診斷病毒病的方法?？墒且环N常用的診斷病毒病的方法?？刹捎貌捎肊LISAELISA、瓊脂擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、標(biāo)記抗體、瓊脂擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清

11、學(xué)方法檢查病畜的抗體消長(zhǎng)情技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長(zhǎng)情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。況和發(fā)病組織中的病毒抗原。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法viruvirus s1.1.中和反應(yīng)中和反應(yīng)觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。去感染力的抗體又稱中和抗體。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法2.2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) AgAb紅細(xì)胞紅細(xì)胞溶血素溶血素補(bǔ)體補(bǔ)體AbAg紅細(xì)胞紅細(xì)胞補(bǔ)體補(bǔ)體溶血素溶血素溶血溶血 （- -）不溶血不溶

12、血 （+ +）病毒感染的微生物學(xué)檢查方法3.3.免疫擴(kuò)散免疫擴(kuò)散 病毒感染的微生物學(xué)檢查方法4.4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISAELISA）將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。然后加入酶的作用底物催化顯或抗原發(fā)生反應(yīng)。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法（1 1）間接）間接ELISAE

13、LISA病毒感染的微生物學(xué)檢查方法（2 2）夾心）夾心ELISAELISA病毒感染的微生物學(xué)檢查方法335533333355555533553355模板模板DNADNA雙鏈雙鏈形成新的雙鏈形成新的雙鏈DNADNA退火退火變性變性五、分子生物學(xué)技術(shù)五、分子生物學(xué)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) （PCRPCR）病毒感染的微生物學(xué)檢查方法2. 2. 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)核酸探針（核酸探針（probeprobe）是指能與特定核酸序列）是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段，可檢測(cè)發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段，可檢測(cè)待檢樣品中特定的基因順序。待檢樣品中特定的基因順序。病毒感染的微生物學(xué)檢查方法六、六、 感染組織的組織學(xué)檢查感染組織的組織學(xué)檢查 病毒在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看到，但是在病毒在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看到，但是在某些病毒感染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)某些病毒感染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體包涵體，或者細(xì)