細胞增殖與分化

1、細胞增殖與分化細胞增殖與分化 魏亞明魏亞明 博士后，研究員。 廣州醫(yī)學院附屬市一人民醫(yī)院，廣州市臨床醫(yī)學研究所，廣州市第一人民醫(yī)院中心實驗室主任。 廣東省生化與分子生物學會理事。廣東省醫(yī)療器械評審專家，廣州市政府采購與科研成果評審專家。 國內外刊物發(fā)表中英文論文100余篇(含sci收錄10篇)，主要從事干細胞發(fā)育與分化、血液免疫研究。細胞增殖和分化是生物個體生長發(fā)育的重要過程。細胞增殖是個體生命活動的基礎。細胞增殖受多種途徑的調控. 細胞增殖包含三方面內容 細胞體積增大 細胞間質增加 細胞數(shù)目增多-狹義 細胞周期cell cycle 分裂間期interphase 復制前期（g1) 復制期（s期

2、） 復制后期（g2) 分裂期divisionphase 核分裂karyokinesis 胞質分裂 cytokinesis細胞周期調控 細胞周期蛋白-隨細胞分裂其含量周期性變化 細胞周期蛋白與細胞周期依賴性激酶構成異二聚體,前者為調節(jié)亞單位,后者為催化亞單位. 細胞周期蛋白隨細胞周期進行會降解和新合成主要細胞周期蛋白和周期蛋白依賴激酶細胞周期蛋白 激酶 功能cyclin d cdk2,cdk4,cdk6 g1-scyclin e cdk2,cdk3 g1-scyclin a cdk2 早sdna起始cyclin a1 cdk2 早sdna起始cyclin b cdk1 g2-m 細胞生長因子 細

3、胞分泌的具有調節(jié)細胞生長與分化的肽類物質，功能類似于激素。 生長因子：神經、表皮、轉化、胰島素樣、血小板衍生、成纖維細胞生長等 介素類，干擾素，腫瘤壞死因子。 生長因子受體 -調節(jié)細胞生長，臨床已有用于疾病治療 細胞分化： 來自同源細胞 出現(xiàn)差異：形態(tài)結構、生化組成、功能 差異穩(wěn)定 細胞分化特點 一、早期:細胞內特異轉錄因子分布差異,導致細胞不對稱分裂,子代出現(xiàn)差異. 二、受信號分子調控: 1.旁分泌作用:跨膜傳遞調節(jié)信號,激活或抑制 2.近分泌作用:相鄰細胞之間膜蛋白作用 3.內分泌作用:激素與其特定受體結合 三、分化是漸進過程，貫穿于整個生命活動中 四、跨過某一分化點，只能繼續(xù)分化成熟。細

4、胞分化的分子基礎 個體發(fā)育：基因表達是按一定時空順序發(fā)生差異表達-選擇性表達。 細胞決定：見到分化特征之前，已確定未來分化的特定方向。胚胎內、中、外胚層發(fā)育 主導基因作用：某一基因激活或打開決定了某一特定分化的發(fā)生。細胞的轉分化與去分化 轉分化(transdifferentiation)：從一種分化狀態(tài)轉化成另一種分化狀態(tài) 去分化(dedifferentiation)：已分化細胞在特定條件下失去分化特性，重新進入到未分化狀態(tài)。-腫瘤細胞（部分去分化） 問題：動物克隆技術是去分化嗎？體細胞全能性totipotency 每個細胞都含有生物體全部的遺傳信息 植物-很早就在進行動物-1997，rosl

5、in研究所wilmut克隆羊dolly體細胞核+去核卵細胞=“受精卵”植入子宮-長成個體stem cells definition 能產生多種不同種類的特殊細胞群體。能產生多種不同種類的特殊細胞群體。 干性：干性： 增殖特性增殖特性 自我更新自我更新 不均一性不均一性 多向分化多向分化stem cells embryonic stem cellsadult stem cellscancerstem cells雌原核和雄原核靠近雌原核和雄原核靠近 二核融合開始分裂（卵裂二核融合開始分裂（卵裂) 2細胞期細胞期 受精卵受精卵 4細胞期細胞期 桑椹胚（第桑椹胚（第3天）天） 胚泡（第胚泡（第4天天)

6、 embryonic stem cells 囊胚（8-16 cells）-全能-完整個體 胚泡-內細胞群-亞全能-任何組織 esc 的主要特征: 1) 具有多向分化潛能和受精卵的某些特性,可以分化為胎兒和成體內各種類型的組織細胞; 2) 可在體外培養(yǎng)條件下建立穩(wěn)定的的細胞系,可長期增殖培養(yǎng)并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性; 3) 將es 細胞與816 細胞階段的胚胎共培養(yǎng)后,植入假妊母體子宮,可發(fā)育為嵌合體動物,其遺傳特性可進入胚系,遺傳給下一代。體外esc 具有培養(yǎng)細胞的特性,最大特色是可對它進行遺傳改造、核轉移和凍存而不失去潛能性。embryonic stem cells 胚胚 胎胎 全全

7、 能能 干干 細細 胞胞 （esc） 造造 血血 干干 細細 胞胞 骨髓骨髓 基基 質細質細 胞胞 成纖維細胞 脂肪細胞 巨噬細胞 內皮細胞 網狀細胞 外外 胚胚 層層 干干 細細 胞胞內內 胚胚 層層 干干 細細 胞胞 中中 胚胚 層層 干干 細細 胞胞 間間 充充 質質 干干 細細 胞胞 mesenchymal stem cell ( m s c ) 間間 充充 質質(祖祖) 細細 胞胞 mesenchymal cells (mc) sh 2 / 3 / 4 (+) cd 13, 29, 44, 50, 54, 73, 90, 105, 106, 166 (+) cd 34, 133, 4

8、5, 33, 2, 3, 4, 8, 14, 15, 16, 19, 20, 24 ( - ) adult stem cells 構成構成1個人的細胞個人的細胞 100,000,000,000,000，絕大，絕大多數(shù)只分裂幾次多數(shù)只分裂幾次 只有特異的干細胞（只有特異的干細胞（specialized stem cells）才能連續(xù)產生一定的組織（才能連續(xù)產生一定的組織（tissues）. 有一種組織就幾乎對應有一種干細胞，包括有一種組織就幾乎對應有一種干細胞，包括 skin, bone marrow, liver, muscle, etc. 他們是成體干細胞他們是成體干細胞-adult ste

9、m cells.已證實的組織干細胞 造血干細胞 間充質干細胞 神經干細胞 表皮干細胞 肝臟干細胞 胰腺干細胞 腸上皮干細胞 肌肉干細胞 血管內皮干細胞 造血祖細胞造血祖細胞 造血干細胞造血干細胞 某些腫瘤干細胞，如乳腺癌干細胞，某些腫瘤干細胞，如乳腺癌干細胞，白血病干細胞等。白血病干細胞等。 其它？其它？ 體外集落形成實驗體外集落形成實驗 脾集落生成細胞脾集落生成細胞cfu-s 長期培養(yǎng)再生能力長期培養(yǎng)再生能力ltra 胎羊宮內移植實驗胎羊宮內移植實驗 競爭性再植實驗競爭性再植實驗 體內可見光成像技術體內可見光成像技術 骨髓基質細 胞 成纖維細胞 脂肪細胞 巨噬細胞 內皮細胞 網狀細胞 間間

10、充充 質質 干干 細細 胞胞 mesenchymal stem cell ( m s c ) 成骨細胞 血管平滑肌細胞 軟骨細胞 血管外層細胞 肌腱細胞 血管內皮細胞 間間 充充 質質 細細 胞胞 mesenchymal cells ( m c ) sh 2 / 3 / 4 (+) cd 13, 29, 44, 50, 54, 73, 90, 105, 106, 166 (+) cd 34, 133, 45, 33, 2, 3, 4, 8, 14, 15, 16, 19, 20, 24 ( - ) 培養(yǎng)培養(yǎng)48-72小時后出現(xiàn)的紡錘形的貼壁細胞小時后出現(xiàn)的紡錘形的貼壁細胞 msc/mc 的第一

11、步分離 培養(yǎng)培養(yǎng)14天后出現(xiàn)致密貼壁的細胞匯合單層天后出現(xiàn)致密貼壁的細胞匯合單層臨床應用 造血系統(tǒng) 大劑量放化療后的支持治療 免疫治療 基因治療 其它疾病的治療現(xiàn)階段干細胞移植可治療疾病 血色素疾病與血液異常血色素疾病與血液異常 (hemoglobinopathies and blood disorders)巨細胞球缺乏性血小板減少癥 (amegakaryocyte thrombocytopenia, amt) 再生不良性貧血 (aplastic anemia)先天性血球細胞缺乏癥 (congenital cytopenia)鎌形細胞貧血 (sickle-cell anemia)地中海性貧血

12、(thalassemia)blackfan-diamond氏貧血 (blackfan-diamond anemia)evan氏癥候群 (evan syndrome)fanconi氏貧血 (fanconi anemia)kostmann氏癥候群 (kostmann syndrome) 惡性病類惡性病類(malignancies, cancers)急性淋巴細胞性血癌 (acute lymphocytic leukemia, all)急性骨髓性白血癌 (acute myelogenous leukemia, aml)急性非淋巴細胞性白血癌 (acute nonlymphocytic leukemia

13、, anl)慢性淋巴細胞性白血癌 (chronic lymphocytic leukemia, cll)慢性骨髓細胞性白血癌 (chronic myelocytic leukemia, cml)年輕型骨髓單核細胞性白血癌 (juvenile myelomonocytic leukemia, jml)骨髓發(fā)育不良癥候群 (myelodysplastic syndrome, mds)多發(fā)性骨髓瘤 (multiple myeloma)固體性腫瘤 (solid tumor)腦瘤 (brain tumors)何杰金氏病 (hodgkins disease)非-何杰金氏淋巴瘤 (non- hodgkins

14、 lymphoma)ewing氏肉瘤 (ewing sarcoma)生殖細胞腫瘤 (germ cell tumors)神經母細胞瘤 (neuroblastoma)卵巢癌 (ovarian cancer)小細胞性肺癌 (small-cell lung cancer)睪丸癌(testicular cancer) 先天性代謝性缺陷先天性代謝性缺陷(inborn errors of metabolism)腦白質腎上腺營養(yǎng)不良癥 (adrenoleukodystrophy)淀粉樣變性 (amyloidosis)巴爾淋巴球癥候群 (bare-lymphocyte syndrome)先天性角化不良 (dys

15、keratosis congenita)家族性噬紅血球性淋巴組織細胞增生癥 (familial erythrophagocytic lymphohististiocytosis)gaucher氏疾病 (gaucher disease)gunter氏疾病 (gunter disease)hunter氏癥候群 (hunter syndrome)hurler氏癥候群 (hurler syndrome)遺傳性神經元蠟樣脂褐質沉著癥 (inherited neuronal ceroid lipofuscinosis)krabbe氏疾?。▼雰哼z傳性腦白質萎縮）(krabbe disease)langerh

16、an氏細胞組織細胞增生癥 (langerhans cell histiocytosis)lesch-nyhan氏疾病 (lesch-nyhan disease)骨硬化?。ü琴|石化?。?osteopetrosis)白血球粘著缺乏癥 (leukocyte adhesion deficiency) 免疫缺乏病變（免疫缺乏病變（immunodeficiencies) 腺嘌呤去氨酵素缺損 (adenosine deaminase deficiency, ada)慢性肉芽腫疾病 (chronic granulomatous disease, cgd)嚴重性聯(lián)合免疫缺陷疾病 (severe combined

17、 immunodeficiency diseases, scids)x-性聯(lián)性淋巴組織增生疾病 (x-linked lymphoproliferative disease, klp)wiskott-aldrich癥候群 自體免疫疾病自體免疫疾病(autoimmune diseases)多發(fā)性硬化癥 (multiple sclerosis)風濕性關節(jié)炎 (rheumatoid arthritis)紅斑性狼瘡 (systemic lupus erythematosus) 未來干細胞之臨床應用 糖尿病 (diabetes)帕金森氏病 (parkinsons disease)阿爾罕默氏?。òV呆?。?(

18、alzheimers disease)脊髓傷害 (spinal cord injury)中風 (stroke)心臟病 (heart disease)肝病 (liver disease)皮膚移殖 (skin transplantation)肌肉營養(yǎng)不良癥 (muscular dystrophy 抽出自身骨髓血，分離，成體干細胞注射在缺血的下肢肌肉中，誘導血管再生，再生新鮮微小血管并逐漸發(fā)育形成微小動脈，向缺血肢體供應血液，改善缺血部位的血液循環(huán)，達到治療下肢缺血的目的。足痛消失，皮膚顏色恢復正常。 自體外周血干細胞移植治療糖尿病足500例臨床研究-解放軍463醫(yī)院楊曉風主任 軍事醫(yī)學科學院軍事醫(yī)

19、學科學院放射醫(yī)學研究所吳祖澤院士放射醫(yī)學研究所吳祖澤院士輸血研究所裴雪濤教授輸血研究所裴雪濤教授正在申報新藥：正在申報新藥： 即將干細胞生產標準化，生產過程規(guī)范化，即將干細胞生產標準化，生產過程規(guī)范化，建立相應的產品質控標準和質控體系，向建立相應的產品質控標準和質控體系，向藥品一樣推向市場，應用于下肢靜脈栓塞藥品一樣推向市場，應用于下肢靜脈栓塞治療，目前處于一期臨床階段。治療，目前處于一期臨床階段。干細胞移植治療心肌梗死 收集干細胞（自體來源）-爬片-間充干細胞-10um/l 5-aza誘導24小時，pbs清洗-imdm培養(yǎng)2-3周，檢測肌節(jié)性肌動蛋白，結蛋白，細胞1107，標記后移植。 動物

20、模型制作：結扎冠狀動脈前降支，結扎點遠端穿刺注入。 移植2，4，6周后病檢，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定植入和存活證據(jù)，分泌igf-1和vegf，產生新血管，改善功能。 直接取骨髓基質細胞，分離單個核細胞或干細胞直接輸注，體內誘導，也有效果。 人，大鼠，狗等動物均取得成功，已臨床應用。干細胞誘導為胰島素分泌細胞移植治療型糖尿病 mscs誘導分化isc分為3個階段: （1）mscs被誘導分化為nestin(+)細胞(胰島前體細胞標志) （05h）; （2）nestin(+)細胞增殖后誘導（ 3磷酸肌醇激酶抑制劑和煙酰胺等）成為胰島前體細胞（6h7d）； （3）isc成熟階段（8d28d）。形態(tài)上類似正常胰島，可表達

21、胰島素、胰高血糖素、胰多肽和生長抑素等蛋白，以及葡萄糖轉運體2、葡萄糖激酶、胰十二指腸同源異型盒基因、hnf3等多種胰島相關基因的mrna，而且誘導后細胞對多種藥物刺激反應敏感，其胰島素的分泌調節(jié)機制與正常細胞相近。dm病人有望利用自身mscs體外誘導分化為isc來治療dm。 胰島細胞移植治愈七名糖尿病患者-京軍區(qū)福州總醫(yī)院 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院副院長兼泌尿外科主任、全軍 器官移植中心主任譚建明教授與 上海市第一人民醫(yī)院合作完成的。 成人胰島細胞移植，是從成人胰腺中分離、純化出胰島細胞，通 過短期培養(yǎng)，經門靜脈行肝內移植。譚建明教授2002年 在亞洲率先建立起大鼠糖尿病模型，建立了經門靜脈肝內移

22、植胰島細胞和無激素免疫抑制劑治療方案。應用該方法治愈的7名患者中，年齡最大的45歲，最小的13歲。 福建福清患者周某，糖尿病病史10年，多次出現(xiàn)酮癥酸中毒，接受胰 島細胞移植后，完全撤離胰島素已超過3年。 干細胞移植治療帕金森病 干細胞移植對 模型動物研究 干細胞移植對 模型動物基礎研究的主要供體細胞是， 以及 經誘導分化而制備的神經干前體細胞。 移植前的預先誘導可能提高了供體細胞對局部微環(huán)境的適應性， 更易于功能恢復， 從而取得療效。 動物實驗：大樹，食蟹猴，獼猴。 機理：1.替代作用；2.神經元營養(yǎng)保護作用 腦癱，腦缺血，腦外傷等神經損傷國內已有報道。 1999年12月,新密市第一人民醫(yī)院

23、神經外科專家王武、張美嶺、付振峰等與國家自然科學基金會及鄭州大學聯(lián)合成立“神經干細胞移植的基礎和臨床研究”攻關小組,先后完成了一系例動物試驗和臨床觀察,反復進行了人胚神經干細胞移植的論證工作,并將動物試驗成果應用于癱瘓病人的臨床治療。 一男子因車禍致重型顱腦損傷,成為植物人。實施了人胚神經干細胞移植術,將320萬個純化神經干細胞移植到患者體內。術后第四天,患者肢體肌力開始恢復,可自主進食。目前患者運動障礙逐漸消失,僵硬攣縮的肢體變得柔軟靈活,基本達到正常人狀態(tài) 。臍血造血干細胞移植到山羊胎中，生出小羊的血液、組織和器官含人的細胞和基因 上海交通大學醫(yī)學遺傳研究所黃淑幀教授（曾溢滔院士夫人）領銜

24、的課題組，將人臍血內的造血干細胞移植到50頭山羊胚胎中，生出的39頭小羊，發(fā)現(xiàn)羊寶寶的血液、骨髓、脾、肝、腎、骨骼肌、肺、心臟等器官里，都有人的基因，最高的檢出率達37%。以肝臟和血液為例，除了外表看上去是羊的肝外，內核都是人的細胞，血液中也表達了人血清的白蛋白。相關研究成果刊登在2006年6月的美國科學院院報（pnas） 。 曾溢滔院士曾在1999年春培育了我國第一頭克隆?！疤咸稀币约叭橹泻腥四蜃拥目寺⊙?。 如果該干細胞打到卵巢或睪丸組織中，并定植下來，后代會怎樣呢？ 2002年月自然醫(yī)學雜志; 人和鼠的骨髓中都包含著“內皮祖細胞”，這類干細胞能形成紅血球和血管。美國加州斯克里普斯研

25、究所的弗里德蘭德等人在研究中發(fā)現(xiàn)，取自實驗鼠骨髓的“內皮祖細胞”被注入鼠眼后，會附著在視網膜內的星形細胞上，與鼠眼內部已有的血管結構相結合形成新血管，這對鼠眼內已退化的血管結構起到了改善作用。 糖尿病性視網膜病主要由視網膜內的血管受損而引起，在糖尿病患者中比較常見，嚴重的話有可能使人失明。類似的技術有望為治療糖尿病性視網膜病等疾病開辟一條全新的途徑。干細胞組織工程 干細胞-骨組織工程 干細胞-軟骨組織工程 干細胞-皮膚組織工程 干細胞-肌腱組織工程 干細胞-心肌組織工程 干細胞-血管組織工程 干細胞-肝組織工程 干細胞-膀胱組織工程 韋克福雷斯特大學再生醫(yī)學研究所所長安東尼艾塔拉包皮環(huán)割手術者

26、的皮膚樣本中，分別提取了單個干細胞。聯(lián)合使用激素和生長因子，誘導分化成脂肪、肌肉和骨骼細胞。這些分化而成的組織細胞經過三維空間培養(yǎng)后，被植入實驗鼠體內進行驗證。研究人員設想，將來可以用患者自身的皮膚樣本提取干細胞，再培育出各種組織細胞注射回患者體內，修復他們受損的組織。膀胱組織工程 柳葉刀雜志的報告，接受膀胱組織工程移植手術的7名患有先天性疾病脊柱裂患者移植手術后，小便失禁狀況得到明顯改善。 培育原理培育原理 “新膀胱”由三層物質構成：外層為肌肉、內層為膀胱上皮，中間是起連接作用的組織蛋白膠原質。 從患者的膀胱上取下活細胞樣本，提取細胞、剝下膠原質，將肌肉細胞和膀胱上皮細胞分別置于不同的培養(yǎng)器皿中。一個星期后，將細胞放在一些海綿形狀的、由膠原質制成的可生物降解“支架”上。 7個星期，原先的數(shù)萬個細胞已經繁殖到15億個左右，布滿“支架”，膀胱上皮在內，肌肉在