實驗一細胞形態(tài)

1、n坎坎坷坷細胞生物學(xué)實驗細胞生物學(xué)實驗 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 實驗一實驗一 細胞形態(tài)、細胞形態(tài)、細胞器的顯微結(jié)構(gòu)的觀察細胞器的顯微結(jié)構(gòu)的觀察一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?.1.了解普通光學(xué)顯微鏡的工作了解普通光學(xué)顯微鏡的工作原理，掌握光學(xué)顯微鏡的使原理，掌握光學(xué)顯微鏡的使用方法。用方法。2.2.熟悉光學(xué)顯微鏡下細胞的基熟悉光學(xué)顯微鏡下細胞的基本形態(tài)與結(jié)構(gòu)。本形態(tài)與結(jié)構(gòu)。二、實驗原理二、實驗原理 細胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成生細胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成生物機體的細胞是多種多樣的。要對細胞進行物機體的細胞是多種多樣的。要對細胞進行研究，首先要從其形態(tài)結(jié)構(gòu)人手。所以，要研究，首先要從其形態(tài)

2、結(jié)構(gòu)人手。所以，要借助顯微鏡的成像及放大原理，在顯微鏡下，借助顯微鏡的成像及放大原理，在顯微鏡下，才能觀察到細胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。才能觀察到細胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。n經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。n顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力分辨力有關(guān)。有關(guān)。n制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.65 1.781.78，所用介質(zhì)的折射率越，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.050.05 0

3、.950.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.51.5。n普通光線的波長為普通光線的波長為400400 700nm700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于0.2m0.2m，人眼的分辨力是，人眼的分辨力是0.2mm0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍數(shù)通常為數(shù)通常為1000x1000x。 顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率: : 也稱為分辨力，它是指能把兩個物點辨清的最小距離，也稱為分辨力，它是指能把兩個物點辨清的最小距離， 分辨距離越大，則分辨率越低。所以，分辨率是以分辨分辨距離越大，則分

4、辨率越低。所以，分辨率是以分辨 距離來表示的。距離來表示的。 其計算公式為其計算公式為: d=0.61: d=0.61/na na=nsina/2/na na=nsina/2 式中式中d d為分辨率，為分辨率，a a為光波波長，為光波波長， n=介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；=鏡口角（標(biāo)本對鏡口角（標(biāo)本對物鏡鏡口的張角），物鏡鏡口的張角）， nana為物鏡的數(shù)值孔徑為物鏡的數(shù)值孔徑( (鏡口率鏡口率) )。鏡口角總是要小鏡口角總是要小于于180，所以，所以sina/2的最大值必然小于的最大值必然小于1。 在物鏡上，有鏡口率在物鏡上，有鏡口率(n.a.)(n.a.)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其

5、數(shù)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表： 物鏡物鏡 鏡口率鏡口率(n.a.) (n.a.) 工作距離工作距離(mm) (mm) 10 10 0.25 5.40 0.25 5.40 40 40 0.65 0.39 0.65 0.39 100 100 1.30 0.11 1.30 0.11顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積， 公式為公式為: m = k1xk2: m = k1xk2焦點深度焦點深度: : 顯微鏡調(diào)焦到看清標(biāo)本某一點時，不僅是這一物點

6、，而且它的顯微鏡調(diào)焦到看清標(biāo)本某一點時，不僅是這一物點，而且它的 上下兩側(cè)也能看清楚兩側(cè)的厚度叫做焦點深度?？吹綐?biāo)本的全上下兩側(cè)也能看清楚兩側(cè)的厚度叫做焦點深度?？吹綐?biāo)本的全 厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細地從上到下進行觀察。厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細地從上到下進行觀察?；A(chǔ)知識基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識三、顯微鏡概述三、顯微鏡概述 顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子

7、束為光源。1.1.光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡 普通生物顯微鏡由普通生物顯微鏡由3 3部分構(gòu)成：部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成， 是顯微鏡的主體。是顯微鏡的主體。機械裝置：用于固定材料和觀察方便，機械裝置：用于固定材料和觀察方便， 包括鏡臺包括鏡臺( (載物臺載物臺) ) 、調(diào)節(jié)器和、調(diào)節(jié)器和、 物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器( (旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)器) )等。等。 尼康e-600顯微鏡 數(shù)碼互動顯微鏡數(shù)碼互動顯微鏡2.體視顯微鏡體視顯微鏡n可直接進行解剖及可直接進行解剖及觀察并具有正像立觀察并具有正像立體感體感3.熒光顯

8、微鏡熒光顯微鏡 尼康e800熒光dic顯微鏡 熒光顯微鏡照片（微管呈綠熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）色、微絲紅色、核藍色） 熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：n1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上。n2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。n3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。4. 4. 激光共聚激光共聚焦掃描顯微鏡焦掃描顯微鏡（具有高分辨具有高分辨率可進行顯微率可進行顯微斷層掃描）斷層掃描） lcsm照片照片藍色為細胞核，藍色為細胞核，綠色為微管綠色為微管 （能觀察活細胞）（能觀察活細胞）5

9、.暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡（暗視野顯微鏡（dark field microscopedark field microscope）的聚光鏡中央有當(dāng)）的聚光鏡中央有當(dāng)光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至種顯微鏡能見到小至 4-200nm4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高5050倍。倍。6.6.相差顯微鏡相差顯微鏡 一種介殼蟲的染色

10、體 7. 偏光顯微鏡偏光顯微鏡（對于雙折射物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)研究）對于雙折射物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)研究） 偏光顯微鏡（偏光顯微鏡（polarizing microscopepolarizing microscope）用于檢測具有雙折射性的物）用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。8.8.微分干涉差顯微鏡微分干涉差顯微鏡（圖像具有浮雕感）（圖像具有浮雕感） dicdic顯微鏡其優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微顯微鏡其優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。鏡相比，其

11、標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。 dic顯微鏡下的硅藻（偽彩色） 9. 9. 倒置顯微鏡（組織培養(yǎng)中長工作距離的）倒置顯微鏡（組織培養(yǎng)中長工作距離的）n組成和普通顯微鏡一樣，組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上（右后者在載物臺之上（右圖），用于觀察培養(yǎng)的活圖），用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。細胞，具有相差物鏡。10. 10. 顯微操作技術(shù)顯微操作技術(shù) 尼康尼康nt-88nent-88ne顯微操作顯微操作/ /注射儀注射儀 四、實驗用品四、實驗用品n各種組織切片各種組織切片五、五、

12、 實驗步驟實驗步驟 (一一)顯微鏡的使用顯微鏡的使用1. 1. 觀察前的準(zhǔn)備工作觀察前的準(zhǔn)備工作 (1)(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習(xí)慣，觀察時要雙觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習(xí)慣，觀察時要雙 眼同時睜開，一邊觀察一邊進行記錄或描繪。眼同時睜開，一邊觀察一邊進行記錄或描繪。 (2)(2)觀察時所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準(zhǔn)備好。觀察時所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準(zhǔn)備好。 (3)(3)顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個部件是否完整顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個部件是否完整 和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透 鏡進行必要的

13、清潔工作。然后進行合軸調(diào)節(jié)。鏡進行必要的清潔工作。然后進行合軸調(diào)節(jié)。 學(xué)生操作規(guī)程及注意事項學(xué)生操作規(guī)程及注意事項一、觀察前準(zhǔn)備一、觀察前準(zhǔn)備檢查：檢查：底座右側(cè)的光源亮度旋鈕是否在底座右側(cè)的光源亮度旋鈕是否在“1”1”位置，即順位置，即順時針選到最底位。時針選到最底位。開機：開機：1.1.打開后座主電源開關(guān)打開后座主電源開關(guān)綠色按鈕綠色按鈕 2.2.打開后座打開后座ccdccd電源開關(guān)電源開關(guān)紅色按鈕紅色按鈕白平衡調(diào)整：白平衡調(diào)整：不放切片，在不放切片，在1010倍物鏡下將電源調(diào)整到最倍物鏡下將電源調(diào)整到最亮，然后按底座右方的白平衡按鈕（紅色）亮，然后按底座右方的白平衡按鈕（紅色）3 35

14、5秒之后秒之后將光源亮度調(diào)回到適中狀態(tài)。將光源亮度調(diào)回到適中狀態(tài)。n二、觀察操作二、觀察操作n放上切片，將光源調(diào)到自己習(xí)慣的亮度。放上切片，將光源調(diào)到自己習(xí)慣的亮度。n視度補償視度補償：調(diào)節(jié)目鏡雙筒找到自己的瞳距，此：調(diào)節(jié)目鏡雙筒找到自己的瞳距，此時兩眼鏡下的圖時兩眼鏡下的圖象重合在一起，橫拉板上的數(shù)象重合在一起，橫拉板上的數(shù)字（例如：字（例如：6464）就是自己的瞳距，然后將兩只）就是自己的瞳距，然后將兩只目鏡外側(cè)的刻度線調(diào)到瞳距的數(shù)字的位置。目鏡外側(cè)的刻度線調(diào)到瞳距的數(shù)字的位置。n調(diào)焦調(diào)焦：將綠色光標(biāo)移至視野中央，開始觀察，：將綠色光標(biāo)移至視野中央，開始觀察，如需提問，按呼叫按鈕。如需提問，按呼叫按鈕。三、下課時的操作三、下課時的操作1.1.將光源亮度調(diào)到最低將光源亮度調(diào)到最低“1”1”刻度?？潭取?.2.關(guān)掉紅色關(guān)掉紅色ccdccd電源開關(guān)，再關(guān)綠色主電源開電源開關(guān)，再關(guān)綠色主電源開關(guān)。關(guān)。3.3.套上顯微鏡套。套上顯微鏡套。4.4.耳機及凳放整齊。耳機及凳放整齊。瞳瞳 距距 調(diào)調(diào) 節(jié)節(jié)2. 2. 顯微鏡的調(diào)節(jié)顯微鏡的調(diào)節(jié)屈屈 光光 度度 調(diào)調(diào) 節(jié)節(jié)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)孔徑光欄調(diào)節(jié)孔徑光欄調(diào)節(jié)n.a聚= =(0 0.6-06-0.8 8)n.a物100%70%30