實驗四酵母菌形態(tài)觀察及計數(shù)

1、實驗中心網(wǎng)站：實驗中心網(wǎng)站：http:/ 2010.12氧化還原和電極電勢氧化還原和電極電勢自定義內(nèi)容自定義內(nèi)容酵母菌形態(tài)觀察及微生物直接計數(shù)法細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察3一、目的要求一、目的要求: : 1 1、觀察酵母菌的形態(tài)特征及出芽方式。、觀察酵母菌的形態(tài)特征及出芽方式。2 2、了解血球計數(shù)板計數(shù)原理，掌握顯微、了解血球計數(shù)板計數(shù)原理，掌握顯微 計數(shù)的原理及方法計數(shù)的原理及方法 。細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察4二、實驗原理二、實驗原理: : 1. 1.酵母菌酵母菌 酵母菌是單細(xì)胞真核生物，菌體比細(xì)酵母菌是單細(xì)胞真核生物，菌體比細(xì)菌大且不運動。繁殖方式以無性為菌大且不運動。繁殖方式以無性為（芽殖

2、或裂殖）有性繁殖產(chǎn)生子囊和（芽殖或裂殖）有性繁殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子。子囊孢子。 細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察52.2.酵母死活細(xì)胞鑒別的理論依據(jù)：酵母死活細(xì)胞鑒別的理論依據(jù)： 本實驗通過美藍(lán)染液水浸片觀察酵母的形本實驗通過美藍(lán)染液水浸片觀察酵母的形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性的態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)檫€原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變

3、為無色的還原型。因此具有還原能力的酵母無色的還原型。因此具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的活細(xì)胞是無色的、而、而死細(xì)胞死細(xì)胞或代謝作用微或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞弱的衰老細(xì)胞 則則呈藍(lán)色呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即或淡藍(lán)色，借此即可對酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別?？蓪湍妇乃兰?xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。 細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察6 直接計數(shù)法是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直直接計數(shù)法是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。 顯微計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培顯微計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。養(yǎng)懸浮液，如有

4、雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般數(shù)板，一般細(xì)菌細(xì)菌則采用彼得羅夫則采用彼得羅夫霍澤霍澤（petrof hausserpetrof hausser）細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)）細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。能使用油鏡，計數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。3.3.直接計數(shù)法直接計數(shù)法細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察74.血球計數(shù)板的構(gòu)造血球計數(shù)板的構(gòu)造細(xì)菌形態(tài)觀察

5、細(xì)菌形態(tài)觀察8 血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有玻片上有4 4條槽而構(gòu)成條槽而構(gòu)成3 3個平臺。中間的平個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)計數(shù)區(qū)（圖（圖21-121-1），），計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為1616個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成個大方格又分成2525個小方格；另一種是一個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成個計數(shù)區(qū)分成2525個大方格（大方格

6、之間用個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成雙線分開），而每個大方格又分成1616個小個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400400個個小方格組成。小方格組成。 細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察9計數(shù)區(qū)邊長為計數(shù)區(qū)邊長為1mm1mm，高度為，高度為0.1mm0.1mm，所以每個計，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為數(shù)區(qū)的體積為0.10.1mmmm3 3。在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)n n，然后，然后求得每個中方格的平均值，再乘上求得每個中方格的平均值，再乘

7、上1616或或2525，就，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成換算成1ml1ml菌液中的總菌數(shù)菌液中的總菌數(shù), ,最后乘以稀釋倍數(shù)最后乘以稀釋倍數(shù)m m。計算公式： 25個中方格個中方格 1ml菌液中的總數(shù)=n/52510000m=50000nm（個） 16個中方格個中方格 1ml菌液中的總數(shù)=n/51610000m=32000nm（個）細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察105.5.計數(shù)原則計數(shù)原則1.1.在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每

8、小格內(nèi)約有 510 510 個菌體為宜。個菌體為宜。2.2.每個計數(shù)室選每個計數(shù)室選 5 5 個中格（可選個中格（可選 4 4 個角和中央的個角和中央的一個中格）中的菌體進(jìn)行計數(shù)。一個中格）中的菌體進(jìn)行計數(shù)。3.3.位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。 4.4.如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時，如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。即作為兩個菌體計數(shù)。5.5.計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣來計算樣 品的含菌量。品的含菌量。 細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察11三

9、、實驗操作:1.1.配制培養(yǎng)基、滅菌、接種培養(yǎng)配制培養(yǎng)基、滅菌、接種培養(yǎng)每臺配制每臺配制100ml100ml馬丁氏液體培養(yǎng)基（不加瓊脂），分裝馬丁氏液體培養(yǎng)基（不加瓊脂），分裝到到8 8支試管中，支試管中，121121，30min30min滅菌，滅菌后每一小組分滅菌，滅菌后每一小組分得得2 2支試管，液體接種酵母菌，支試管，液體接種酵母菌，3030恒溫?fù)u床培養(yǎng)恒溫?fù)u床培養(yǎng)細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察122.2.死活細(xì)胞鑒定美藍(lán)浸片觀察死活細(xì)胞鑒定美藍(lán)浸片觀察（1 1）在載玻片中央加一滴）在載玻片中央加一滴0.10.1美藍(lán)染色美藍(lán)染色 液，挑菌混勻；液，挑菌混勻；（2 2）傾斜緩慢放置蓋玻片；）傾斜

10、緩慢放置蓋玻片；（3 3）放置）放置3min3min后鏡檢；后鏡檢；（4 4）染色半小時后再次進(jìn)行觀察，注意死）染色半小時后再次進(jìn)行觀察，注意死 活細(xì)胞數(shù)量是否增加；活細(xì)胞數(shù)量是否增加； (5) (5) 用用0.050.05呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述操作。操作。 細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察133.3.血球計數(shù)實驗操作血球計數(shù)實驗操作（1 1）鏡檢計數(shù)室：去污，清洗，吹干；）鏡檢計數(shù)室：去污，清洗，吹干；（2 2）加樣品：蓋上蓋玻片，菌懸液于邊緣滴一小滴，）加樣品：蓋上蓋玻片，菌懸液于邊緣滴一小滴，滲入，使充滿菌液；滲入，使充滿菌液；（3 3）顯微鏡計數(shù)：加樣后靜止）顯微鏡計數(shù)：加樣后靜止5min5min，每個小格內(nèi)，每個小格內(nèi)5 51010個菌體，取個菌體，取5 5個中格（可選個中格（可選4 4個角和中央的個角和中央的一個中格）計數(shù)；一個中格）計數(shù)；（4 4）清洗）清洗（5 5）計算菌濃度）計算菌濃度細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌形態(tài)觀察14思考題思考題:1、呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時間的不同，、呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時間的不