革蘭氏染色與莢膜染色

1、 革蘭氏染色與莢膜染色革蘭氏染色與莢膜染色n1、掌握革蘭氏染色法和細(xì)菌莢膜染色法。、掌握革蘭氏染色法和細(xì)菌莢膜染色法。n2、觀察菌體的一些簡單結(jié)構(gòu)。、觀察菌體的一些簡單結(jié)構(gòu)。二、實驗原理二、實驗原理一、目的與要求：一、目的與要求：（一）革蘭氏染色法原理（一）革蘭氏染色法原理n 革蘭氏染色法是革蘭氏染色法是18841884年由丹麥病理學(xué)家年由丹麥病理學(xué)家c.gramc.gram創(chuàng)立的。作創(chuàng)立的。作為細(xì)菌學(xué)上最常用最重要的鑒別染色法，革蘭氏染色法可將為細(xì)菌學(xué)上最常用最重要的鑒別染色法，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（g+g+）和革蘭氏陰性菌（）和革蘭氏陰

2、性菌（g g）兩大類。兩大類。n g g菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。 n g+g+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透

3、性降低，因脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。（二）莢膜染色法原理（二）莢膜染色法原理n莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)。物質(zhì)。n由于莢膜與染料的親和力弱，不容易著色；而且由于莢膜與染料的親和力弱，不容易著色；而且可溶于水，易在用水沖洗時被除去?？扇苡谒?，易在用水沖洗時被除去。n所以通常用襯托染色法所以通常用襯托染色法(負(fù)染色法負(fù)染色法)染色，使菌體染色，使菌體和背景著色，而莢膜不著色，從而在菌體周圍形和背景著色，而莢膜不著色，從而在菌體周圍形成一透明圈。成一透明圈。n由

4、于莢膜富含水分，制片時應(yīng)自然干燥，不可以由于莢膜富含水分，制片時應(yīng)自然干燥，不可以加熱固定，避免加熱蒸發(fā)，影響觀察。加熱固定，避免加熱蒸發(fā)，影響觀察。三、實驗器材三、實驗器材n1 1、菌種：枯草桿菌（、菌種：枯草桿菌（bacillus subtilisbacillus subtilis），）， n 大腸桿菌（大腸桿菌（escherichia coliescherichia coli），），n 未知菌（環(huán)境中分離）（斜面培養(yǎng)物）未知菌（環(huán)境中分離）（斜面培養(yǎng)物）n褐球固氮菌（褐球固氮菌（azotobacter chroococcusazotobacter chroococcus）裝片。）裝片。n

5、2 2、染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫、染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫、盧戈氏盧戈氏碘液、碘液、95%95%乙醇、番紅、二甲苯、香柏油乙醇、番紅、二甲苯、香柏油n3 3、器材：顯微鏡、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、器材：顯微鏡、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、廢液缸擦鏡紙、廢液缸 四、革蘭氏染色法實驗步驟四、革蘭氏染色法實驗步驟n流程路線：流程路線：n涂片涂片 干燥干燥 固定固定 草酸銨結(jié)晶草酸銨結(jié)晶紫染色紫染色1min水洗干燥水洗干燥 碘液媒染碘液媒染 1min 水洗干燥水洗干燥 95%乙醇脫色乙醇脫色 1520秒秒 水洗干燥水洗干燥 番紅復(fù)染番紅復(fù)染1min 水洗干燥水洗干燥 鏡檢鏡檢 (1

6、) (1)涂片涂片 干燥干燥 固定固定: :21（2）草酸銨結(jié)晶紫染色）草酸銨結(jié)晶紫染色1min 水洗干燥水洗干燥 （3）碘液媒染1min 水洗 干燥（4 4）95%95%乙醇脫色乙醇脫色15201520秒秒 水洗水洗 干燥干燥（5 5）番紅復(fù)染）番紅復(fù)染1min 1min 水洗水洗 干燥干燥 鏡檢鏡檢 五、注意事項：五、注意事項：n（1 1）在涂片時不可過厚，否則在染色脫色時，都不）在涂片時不可過厚，否則在染色脫色時，都不易均勻，固定時，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。易均勻，固定時，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。n（2 2）嚴(yán)格掌握脫色程度，是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟。）嚴(yán)格掌握脫色程度，是革蘭

7、氏染色的關(guān)鍵步驟。如脫色時間太長，陽性菌會誤為革蘭氏陰性菌，時間如脫色時間太長，陽性菌會誤為革蘭氏陰性菌，時間不足，革蘭氏陰性菌會誤為革蘭氏陽性菌。不足，革蘭氏陰性菌會誤為革蘭氏陽性菌。n（3 3）在鏡檢時，以分散開的菌體的革蘭氏染色反應(yīng)）在鏡檢時，以分散開的菌體的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。為準(zhǔn)。n（4 4）染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，）染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。染色效果。n（5 5）選用幼齡的細(xì)菌。若菌齡太老，由于菌體）選用幼齡的細(xì)菌。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)

8、呈陰性反應(yīng)。死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。莢膜示意圖：莢膜染色步驟：莢膜染色步驟：n1、總路線：涂片 用1%結(jié)晶紫染色3分鐘 用20%cuso4沖洗 鏡檢 2、涂片： 3、結(jié)晶紫染色： 4、cuso4沖洗：注意事項：注意事項：n（1 1）不能加熱固定，否則莢膜受熱失水收縮，失）不能加熱固定，否則莢膜受熱失水收縮，失去原形。去原形。n（2 2）涂片不要用力過猛，不要滴加水，以防破壞）涂片不要用力過猛，不要滴加水，以防破壞其莢膜原形其莢膜原形. .n(3)(3)要用要用cusocuso4 4沖洗，不要用水。沖洗，不要用水。n n第第4 4組值日組值日莢膜示意圖：革蘭氏染色步驟革蘭氏染色步

9、驟涂片涂片 干燥干燥 固定固定 草酸銨結(jié)晶紫染色草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥水洗干燥 碘液媒染碘液媒染 1min 水洗干燥水洗干燥 95%乙醇脫色乙醇脫色 1520秒秒 水洗干燥水洗干燥 番紅復(fù)染番紅復(fù)染1min 水洗干燥水洗干燥 鏡檢鏡檢莢膜染色步驟：涂片莢膜染色步驟：涂片 用用1%結(jié)晶紫染色結(jié)晶紫染色3分鐘分鐘 用用20%cuso4沖洗沖洗 鏡檢鏡檢1 1、細(xì)胞壁細(xì)胞壁實驗報告實驗報告n給出給出枯草桿菌，大腸桿菌，未知菌枯草桿菌，大腸桿菌，未知菌形態(tài)圖，并形態(tài)圖，并注明其革蘭氏染色反應(yīng)。注明其革蘭氏染色反應(yīng)。n繪圖示褐球固氮菌的形態(tài)特征繪圖示褐球固氮菌的形態(tài)特征思考題思考題1.1.哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭色染色結(jié)果的正確性？其中最哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭色染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？ 2.2.進(jìn)行革蘭氏染色時，為什么特別強調(diào)菌齡不能太老，進(jìn)行革蘭氏染色時，為什么特別強調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題? ? 3.3.革蘭氏染色時，