蛋白多肽類藥物藥代動力學(xué)分析方法研究進展

1、蛋白多肽類藥物藥代動力學(xué)分析方法研究進展作者：張琪王廣基摘要通過查閱近期國內(nèi)外有關(guān)文獻10余篇，綜述了現(xiàn)代分析方法在蛋白多肽類 藥物代謝動 力學(xué)研究中的應(yīng)用，重點介紹了生物檢定法、同位素標記法、免疫學(xué)、色譜等方法的原理、 特點、及發(fā)展狀況。關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)；多肽；藥物動力學(xué)；生物檢定法；同位素標記法；免疫 學(xué)；色譜文章編號：1005-8915(2000)02-0126-03The Progress of the Analysis Method of Protein Polypeptide Drug Pharmac okineticsZhang QiWang Guangji(Center of Ph

2、armacokinetics, China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)AbstractA review of application of modern analysis methods in studying the pha rmacokinetics of protein polypeptide drug is presented with 16 references. The paper emphasizes the principle, characteristic, and progress of bioassay, radio

3、i odination, immunoassay, and chromatography.Key WordsProtein, Polypeptide, Pharmacokinetics, Bioassay, Rad ioiodination, Immunoassay, Chromatography在國家確定的發(fā)展高新技術(shù)計劃中，生物技術(shù)產(chǎn)品一直作為優(yōu) 先開發(fā)的領(lǐng)域之一。蛋白多肽類藥物在實現(xiàn)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化過程中，受到諸多因素的制約，其中藥物動力學(xué)的研究面臨著更高的要求。其主要原因是蛋白多肽類藥物的結(jié)構(gòu)特殊、用藥量很小、生物體內(nèi)有大量相似物 質(zhì)的干擾，這一切都使得該類藥的分析方法不同于傳統(tǒng)藥物，大大

4、增加了檢測的難度。本文就目前進行該類藥藥物代謝動力學(xué)過程中所使用或發(fā)展中的幾種分析方法做一概述。1蛋白多肽類藥物的分析方法1.1生物檢定法由于蛋白多肽類藥物多為有生物活性的物質(zhì),且生物活性不僅取決于藥物的一級結(jié)構(gòu)，與二 、三級結(jié)構(gòu)亦密切相關(guān)，故生物檢定法是研究該類藥物動力學(xué)獨特而必需的方法。生物檢定法有兩個目的，直接推薦精選測定體液中藥物濃度及鑒定標記藥物的生物活性。其方法主要可分為兩大類。 1.1.1在體分析常規(guī)的有胰島素的小鼠血糖法等，另外還有根據(jù)各類蛋白多肽的生物活性不同而建立的各異的方法，如根據(jù)IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質(zhì)1 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內(nèi)實驗

5、。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物 ，費時費力，靈敏度不高，變異較大。 1.1.2離體組織（細胞）分析如NGF刺激雞背根神經(jīng)節(jié)增長，縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多特異性強，靈敏度高的依賴細胞株被建立，細胞培養(yǎng)已是最常用的方法。根據(jù)蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同，具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 （Proliferation assays），快速靈敏，但特異性稍差；抑制增殖法(Antiproliferation assays)，檢測系統(tǒng)簡單、靈敏而專一；減少細胞損傷法(Cytopathic effect reduction assays ) 2，則是依據(jù)具

6、有抗病毒活性的藥物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷，方法直觀靈敏，但可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數(shù)目的增減為量效指標，計數(shù)方法有直接計數(shù)法和間接計數(shù)法，后者包括MTT法，同位素（3H，14C）摻入法 等。此外，還有根據(jù)蛋白多肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯(lián)用的抗體誘導(dǎo)法3，結(jié)合酶反應(yīng)的酶誘導(dǎo)分解法4等。 總的說來，細胞培養(yǎng)法多具有靈敏特異，客觀可靠的優(yōu)點，但其不足也顯 而易見。 首先，生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內(nèi)動態(tài)； 其次 ，樣品多存在于人或動物血清中，血清中內(nèi)源物質(zhì)的干擾以及可能存在的內(nèi)源因子的交叉反應(yīng)，影響了方法的專屬性； 再者，啟動生

7、物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ； 依賴株細胞長期培養(yǎng)易發(fā)生變異而影響檢測的特異性。1.2免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是利用蛋白多肽藥物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢藥物 ，再以放射計數(shù)，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應(yīng)配以靈敏檢測的方法。常用的方法有三種。推薦精選 1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）該法是被測藥物（Ag ）,標記藥物（多為125I-Ag）與抗體（Ab）的競爭性結(jié)合反應(yīng)，方法的特異性 取決于抗原抗體的親和力及標記藥 物的純度，與生物檢定法相比，有簡明，易于控制的優(yōu)點。 1.2.2免疫放射定量法（Immunorad

8、iometrec assays IRMA）該法中 被測藥物依然是Ag，它 先與固定相上的Ab形成AbAg復(fù)合物，再與標記抗體125I-Ab結(jié)合，形成AbAg 125I-Ab夾心狀。由于Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法， 只是對標記抗體的純度要求很高。 1.2.3酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA） ELISA的原理與IRMA相 似，只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發(fā)生顯色反應(yīng)的酶如HRP來標記，與上述兩法相比，ELISA具有使用壽命長，重復(fù)性好，無輻射源的優(yōu)點，并且已有不少實驗證明 ，

9、它與生物檢定法具有一定的量效關(guān)系4及相關(guān)性5，提示它可部分地反映藥物的生物活性。免疫學(xué)方法的缺點在于： 它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性； 不能同時測定代謝物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結(jié)果誤差； 不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反應(yīng)可能有較大的差別； 還可能受到內(nèi)源物質(zhì)的干擾。 但免疫法畢竟是一種迅速，靈敏，適于批處理的方法，已有數(shù)十種蛋白多肽被開發(fā)成能滿足藥物動力學(xué)研究的商品藥盒。目前臨床藥動學(xué)領(lǐng)域，免疫法已逐漸取代生物檢定法。1.3同位素標記示蹤法放射性同位素標記技術(shù)是研究蛋白多肽在生物體內(nèi)處置的一種最常用的方法。所使用的同位素有125I，99mTc，3H，14C，35S

10、 等，其中125I因比放射性高，半衰期適宜，標記制備簡單而最為常用。標記方法有兩種，一是內(nèi)標法，即把含有同位素的氨基酸加入生長細胞或合成 體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由于制備復(fù)雜而限制了其廣泛應(yīng)用；二是外標法 ，常用化學(xué)方法如氯胺T或Iodogen法將125I 連接于大分子上，因相對簡單而被首選。推薦精選同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優(yōu)點，尤其適用于蛋白多肽藥物的組織分布研究，但其缺點亦顯而易見。 首先，它不能進行人體藥物動力學(xué)研究； 其次，同位素標記后是否會引起藥物的生物活性及其在生物體內(nèi)的代謝行為發(fā)生變化，一直存在爭議。 前者可通過調(diào)整反應(yīng)條件和生物檢定法加以改善和驗證，基本上

11、可使生物活性無明顯變化；后者因藥而異則復(fù)雜的多，已有報道認為6，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用， 從而導(dǎo)致 其體內(nèi)清除的紊亂； 最后，由于蛋白多肽進入體內(nèi)會被降解代謝，或與其它蛋白質(zhì)結(jié)合，總的放射性不能代表藥物動力學(xué)過程，因此如何鑒別樣品的原藥，降解物及結(jié)合物是該法中需解決的關(guān)鍵問題，目前常用的方法有兩種。 1.3.1SDS-PAGE法根據(jù)藥物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳，通過控制電流等條件使得原 藥與其它產(chǎn)物分開，然后通過切割膠條放射計數(shù)或放射自顯影的方法，來檢測電泳放射性圖譜。該法具有較高的分辨率和靈敏度，但電泳過程中，125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠

12、或電解液中，從而使結(jié)果可能偏高。 1.3.2HPLC法高效反相色譜（RHPLC），高效排阻液相色譜（SEHPLC ）7，高效離子交換液相色 譜（IEHPLC）分別根據(jù)保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特征，Mr大小，極性的關(guān)系 來分離樣品中的物質(zhì)。它們共同的優(yōu)點是特異性高，分辨率好，可同時測定原藥和降解物， 其中SEHPLC亦可得到結(jié)合物的信息，而RHPLC用于蛋白多肽的分離有獨特的優(yōu)越性。但因受 注入樣品量的限制，靈敏度，重現(xiàn)性都受影響，且設(shè)備昂貴，成本較高。1.4色譜法1.4.1HPLC在進行普通藥物動力學(xué)研究中，HPLC是技術(shù)成熟，應(yīng)用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽藥物的實驗研究或產(chǎn)業(yè)化中

13、，HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒于蛋白多肽藥物結(jié) 構(gòu)的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio8，加壓素的八肽拮抗劑（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）9可分別直接或經(jīng)選擇性柱反應(yīng)后，單獨用帶熒光檢測 器的HPLC進行藥動學(xué)研究外，HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術(shù)聯(lián)用方能滿足 藥動學(xué)的需要。除了上述提及的與同位素的聯(lián)用，還有許多與免疫學(xué)方法的聯(lián)用，如Phillips10采用免疫親和色譜技術(shù)分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度； Partilla 11等認為HPLC與RIA聯(lián)用可以檢測人體液中的神經(jīng)肽。此外，令

14、人矚目的還有液 質(zhì)在線聯(lián)用（LC-MS）。推薦精選LC-MS將高分離能力，適用范圍廣泛的色譜分離技術(shù)與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋白多肽的結(jié)構(gòu)中具有重要價值的質(zhì)譜法聯(lián)用起來，成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術(shù)發(fā)展的決定因素是接口問題，由傳送帶接口（Moving-belt interface），熱噴 霧 接口（Thermospray），到最近的電噴霧離子化接口（Electrosptay ionization ESI），聯(lián) 用技術(shù)日趨成熟，尤其適用于生物樣品中低濃度（pg/ml）藥物及代謝物的測定12 ，而蛋 白多肽類藥物恰有在體內(nèi)代謝快，濃度低的特點。國外已將用LC-MS于該類

15、藥物，藥物代謝物13，14的動力學(xué)研究，國內(nèi)尚處于起步階段，除了儀器本身價格昂貴，技術(shù)上亦存在一些問題： 如它對樣品的純度要求很高如何將藥物從生物體液，尤其是血漿中提取純化以 減少干擾； 如何選擇合適的內(nèi)標以減少系統(tǒng)誤差； 在將LC-MS用于檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發(fā)現(xiàn)，糖肽難用于質(zhì)譜分析，因為在質(zhì)譜條件下，同樣的氨基酸序列可產(chǎn)生 多種不同質(zhì)量的多糖鏈，而每條鏈及整個分子都有可以產(chǎn)生質(zhì)譜信號，這就大大降低了質(zhì)譜 信號的專屬性。 目前，盡管LC-MS在蛋白多肽藥物的體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)研究中還存在一定的難度，但其作為實用性強，前景好的領(lǐng)域已引起人們的廣泛關(guān)注。 1.

16、4.2高效毛細管電泳（HPCE）HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動 力，在毛細管中按其濃度和分配系數(shù)不同進行高效，快速分離的新技術(shù)，它以高分辨率，高靈敏度，分析時間短 ，樣品量少及操作簡單等諸多優(yōu)點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床上 ，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有： 蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起的遷移時間的改變，這可以通過涂層CE加以改善； 推薦精選 由于毛細管很細，管內(nèi)容積很小，進樣量 的不易控制給實驗的重復(fù)性帶來影響，而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 近年來，國外根據(jù)樣品的性質(zhì)采用不同的預(yù)處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種， 將樣品

17、加以濃縮，取得了滿意的效果15。HPCE在檢測上的迅速發(fā)展與HPLC已有并駕齊驅(qū)之 勢，況且鑒于HPCE在樣品微量分析的優(yōu)越性，已有人在藥物動力學(xué)研究、體內(nèi)分析中，將微 透析連續(xù)采樣與之聯(lián)用16，這在整個藥動學(xué)研究中都不失為一有希望的方向。2結(jié)語由以上可知，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展給蛋白多肽類藥物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒于該類藥物的特殊性，目前尚無一種方法能完全滿足動力學(xué)研究的要求。根據(jù)人用藥物注冊國 際協(xié)調(diào)會議（ICH）對生物藥物臨床前安全性評價“在科學(xué)基礎(chǔ)上的靈活性和具體情節(jié)個別 處理”的總則，人們通常將幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，互相補充，才能得到比較可靠的結(jié)果。張琪（中國藥科大學(xué)藥代中心，南京

18、 210009）王廣基（中國藥科大學(xué)藥代中心，南京 210009）參 考 文 獻1，Jagels MA, Hugli. TE Neutrophil chemotactic factors promo te leukocytosis: a co mmon mechanism for celluar recruitment from bone marrow. J Immunol, 1992, 148(4): 11192，Sparreboom A, Rongen HAH, Bennekom WPV. Assays for interferons a n d interleukins in biolo

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