細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗課件

1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗 實驗一實驗一 細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒DNADNA的提取和純化的提取和純化 菌體菌體pcr跟普通跟普通PCR原理是一樣的，因為原理是一樣的，因為94度變形可以裂解細(xì)菌，釋放出度變形可以裂解細(xì)菌，釋放出DNA，所以不用提質(zhì)粒也可以，所以不用提質(zhì)粒也可以PCR出來條帶出來條帶 因為培養(yǎng)基含有水分，恒溫培養(yǎng)時因為培養(yǎng)基含有水分，恒溫培養(yǎng)時水分蒸發(fā)出來在培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)，水分蒸發(fā)出來在培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)，水滴落下來會沖壞菌落水滴落下來會沖壞菌落 ，不利于培，不利于培養(yǎng)觀察，所以需要倒置培養(yǎng)養(yǎng)觀察，所以需要倒置培養(yǎng) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?通過細(xì)菌質(zhì)粒通過細(xì)菌質(zhì)粒DNADNA的提取，掌握共

2、價閉合環(huán)狀的提取，掌握共價閉合環(huán)狀DNADNA的提取方法。的提取方法。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗二、實驗原理二、實驗原理細(xì)菌中有兩種細(xì)菌中有兩種DNA，即染色體，即染色體DNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取方法有三種：的提取方法有三種：堿裂解法堿裂解法、煮沸法和去污、煮沸法和去污劑（如劑（如Triton和和SDS）裂解法。）裂解法。堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細(xì)胞堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細(xì)胞DNA變性，共價閉合環(huán)狀變性，共價閉合環(huán)狀DNA由于空間纏繞，兩條鏈不會徹由于空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當(dāng)外界條件到達(dá)復(fù)性條件時，質(zhì)粒底分開。當(dāng)外界條件到達(dá)復(fù)性條件時，質(zhì)粒DNA

3、的雙鏈的雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，而較大的線性染色體又迅速恢復(fù)原狀，而較大的線性染色體DNA難以復(fù)性。難以復(fù)性。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗三、實驗菌株三、實驗菌株含質(zhì)粒載體含質(zhì)粒載體pGEM-TpGEM-T的大腸桿菌（的大腸桿菌（E. coli.E. coli.）細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗四、實驗用具和藥品四、實驗用具和藥品實驗用具實驗用具 搖床、離心機(jī)、移液器及槍頭、玻璃試管（搖床、離心機(jī)、移液器及槍頭、玻璃試管（15mL15mL）及）及塞子、離心管（塞子、離心管（1.5mL1.5mL）。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗LB培養(yǎng)基配方：培養(yǎng)基配方：ddH2O950mL細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物

4、（bacto-yeast extract）5gNaCl 10g瓊脂粉（配制固體培養(yǎng)基時需加入）15gNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0（5mol/L 約0.2mL），高壓滅菌固體平板上添加氨芐青霉素細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗實驗藥品實驗藥品溶液溶液（高壓滅菌）：（高壓滅菌）： 50 mmol/L 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0pH8.0） 10 mmol/L EDTA10 mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0）溶液溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：（現(xiàn)用現(xiàn)配）： 0.2 mol/L NaOH(0.2 mol/L NaOH(臨用前用臨用前用10

5、mol/L10mol/L的溶液稀釋）的溶液稀釋） 1% SDS1% SDS溶液溶液： 5 mol/L5 mol/L乙酸鉀乙酸鉀 60mL60mL 冰乙酸冰乙酸 11.5mL11.5mL 水水 28.5mL28.5mL細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗五、實驗步驟五、實驗步驟方法：活化方法：活化- -擴(kuò)增擴(kuò)增- -離心離心- -裂解裂解- -離心離心- -抽提抽提- -沉淀沉淀- -洗滌洗滌- -溶解溶解（一）細(xì)菌繁殖（一）細(xì)菌繁殖實驗前實驗前2 2天晚上天晚上： 將凍存的菌株取出，劃線接種于將凍存的菌株取出，劃線接種于LBLB（ampamp）平板上，）平板上， 置于置于3737培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱中，中，倒置培養(yǎng)倒置培養(yǎng)至

6、菌落長成。至菌落長成。實驗前實驗前1 1天晚上：天晚上：從從LBLB平板上挑取單個菌落，接種于平板上挑取單個菌落，接種于6mlLB6mlLB液體培養(yǎng)基（加入氨液體培養(yǎng)基（加入氨芐青霉素）中，芐青霉素）中，3737，過夜振蕩（，過夜振蕩（200r/min200r/min）培養(yǎng)。）培養(yǎng)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗（二）菌體收集（二）菌體收集實驗當(dāng)天實驗當(dāng)天 ：將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入1.5mL1.5mL離心管，離心管，5000r/min5000r/min離心離心2min2min；1.1.棄上清棄上清細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗（三）堿裂解法提取質(zhì)粒（三）堿裂解法提取質(zhì)粒DNADNA 全套操作約需全套操作約需1

7、1小時，詳細(xì)說明如下。小時，詳細(xì)說明如下。 3.3. 加入加入250 l250 l的的Solution Solution （含（含RNase A1RNase A1）充分懸浮細(xì)菌沉淀。）充分懸浮細(xì)菌沉淀。 注）注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（注）注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（VortexVortex）等劇烈振蕩使）等劇烈振蕩使菌體充分懸浮。菌體充分懸浮。 4.4. 加入加入250 l250 l的的Solution Solution 輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5 56 6次，使菌體充分裂次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。解，形成透明溶液。 注）此步驟不宜超過注）此步驟不宜超

8、過5 5分鐘。分鐘。 5.5. 加入加入400 l400 l的的44預(yù)冷的預(yù)冷的Solution Solution ，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5 56 6次，直次，直至形成緊實凝集塊，然后室溫靜置至形成緊實凝集塊，然后室溫靜置2 2分鐘。分鐘。6.6. 室溫室溫12,000 rpm12,000 rpm離心離心1010分鐘，取上清。分鐘，取上清。注）此時注）此時44離心不利于沉淀沉降。離心不利于沉淀沉降。 7.7. 將試劑盒中的將試劑盒中的Spin ColumnSpin Column（離心柱）安置于（離心柱）安置于Collection Tube Collection Tube （收集（

9、收集管）上。管）上。8.8. 將上述操作將上述操作6 6的上清液轉(zhuǎn)移至的上清液轉(zhuǎn)移至Spin ColumnSpin Column中，中，12,000 rpm12,000 rpm離心離心1 1分鐘，分鐘，棄濾液。棄濾液。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗9.9. 將將500 l的的Rinse A加入加入Spin Column中，中，12,000 rpm離心離心30秒鐘，秒鐘，棄濾液。棄濾液。 10.10. 將將700 l的的Rinse（沖洗）（沖洗） B加加入入Spin Column中，中，12,000 rpm離離心心30秒鐘，棄濾液。秒鐘，棄濾液。 11.11. 重復(fù)操作步驟重復(fù)操作步驟10。12.12. 將將Sp

10、in Column安置于安置于Collection Tube上，上，12,000 rpm離心離心1分鐘。分鐘。 13.13. 將將Spin Column安置于新的安置于新的1.5 ml的離心管上，在的離心管上，在Spin Column膜的中央膜的中央處加入處加入60 l的滅菌蒸餾水或的滅菌蒸餾水或Elution Buffer（洗脫緩沖液），室溫靜置（洗脫緩沖液），室溫靜置1分鐘。分鐘。 注）把滅菌蒸餾水或注）把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱加熱至至60使用時有利于提高洗脫效率使用時有利于提高洗脫效率14.14. 12,000 rpm離心離心1分鐘洗脫分鐘洗脫DNA。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗

11、六、實驗作業(yè)六、實驗作業(yè)按上述實驗步驟提取質(zhì)粒按上述實驗步驟提取質(zhì)粒DNADNA。思考本實驗的關(guān)鍵步驟是什么？思考本實驗的關(guān)鍵步驟是什么？答：本實驗的關(guān)鍵是溶液答：本實驗的關(guān)鍵是溶液重懸須充分，溶液重懸須充分，溶液混合須混合須溫和。溫和。用用binding buffer是為了增加洗脫柱對核酸的結(jié)是為了增加洗脫柱對核酸的結(jié)合活性；合活性；wash solution是洗掉柱子里除核酸物質(zhì)以外是洗掉柱子里除核酸物質(zhì)以外的雜質(zhì)；而的雜質(zhì)；而elution buffer就是最后把就是最后把DNA從柱子上洗從柱子上洗脫下來使用的溶液，一般是脫下來使用的溶液，一般是pH=8.0的的TE，dd水也可以。水也可

12、以。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗實驗二實驗二 大腸桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康耐ㄟ^實驗了解原核生物實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的途徑，掌握質(zhì)粒DNA遺傳轉(zhuǎn)化的基本原理和操作方法。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗二、實驗原理二、實驗原理轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformationtransformation）是指一種生物由于接受了另一）是指一種生物由于接受了另一種生物（或同種生物）的遺傳物質(zhì)，從而獲得了后者的種生物（或同種生物）的遺傳物質(zhì)，從而獲得了后者的某些遺傳性狀或發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。某些遺傳性狀或發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。細(xì)菌處于容易吸收外源細(xì)菌處于容易吸收外源DNADNA的狀態(tài)叫的狀態(tài)叫感受態(tài)感受

13、態(tài)。用理化方法人工誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過程。用理化方法人工誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過程。目前應(yīng)用較廣的目前應(yīng)用較廣的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法有兩種：方法有兩種：CaClCaCl2 2轉(zhuǎn)化法（化學(xué)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法（化學(xué)轉(zhuǎn)化法）和電轉(zhuǎn)化法?；ǎ┖碗娹D(zhuǎn)化法。CaClCaCl2 2轉(zhuǎn)化法的原理是在低溫（轉(zhuǎn)化法的原理是在低溫（00）和低滲的）和低滲的CaClCaCl2 2溶液溶液中，菌體膨脹，轉(zhuǎn)化混合物中的中，菌體膨脹，轉(zhuǎn)化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羥基酶的羥基- -鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)4242短時間熱擊，短時間熱擊，促進(jìn)細(xì)胞吸收促進(jìn)

14、細(xì)胞吸收DNADNA復(fù)合物。復(fù)合物。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗三、實驗材料三、實驗材料質(zhì)粒pGEM-T easy ：編碼氨芐青霉素（Ampr）的抗性基因大腸桿菌（E.coli）DH5菌株：氨芐青霉素敏感型（Amp-）細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗四、實驗用品四、實驗用品超凈工作臺、搖床水浴鍋、離心機(jī)分光光度計、移液器及槍頭三角瓶（500mL、200mL）離心管（50mL、1.5mL）平板（Ampr、Amp-）、LB培養(yǎng)基冰冷的CaCl2溶液、質(zhì)粒DNA細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗u 0.1M CaCl2溶液配制： 稱量1.11g無水CaCl2固體，溶于1000ml雙蒸水中，高壓滅菌或0.22um濾器過濾除菌。保存于4度冰箱中。u質(zhì)粒的提取

15、： 利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗五、實驗步驟五、實驗步驟（一）感受態(tài)的制備（一）感受態(tài)的制備( (此步驟已完成）此步驟已完成）1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37，培養(yǎng)12h；2、挑取單菌落，轉(zhuǎn)移至盛有200mL LB的500mL三角瓶中，37，振蕩（200r/min）培養(yǎng)12h；細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗 3、吸取1mL菌液，轉(zhuǎn)移至盛有100mL LB的200mL三角瓶中，37，振蕩（200r/min）培養(yǎng)23h，每隔0.5h測OD600值；4、當(dāng)OD600=0.30.4（對數(shù)生長期的OD600=0.6）取出；冰上放置1060min；5、4，5000rpm，離心10min，棄

16、上清；6、冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2 10mL懸浮細(xì)胞；7、冰上放置15min；8、4，5000rpm，離心10min，棄上清；9、冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2 2mL懸浮細(xì)胞；10、用于轉(zhuǎn)化實驗；若需保存，加入終濃度15%的甘油，-70保存。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗（二）轉(zhuǎn)化（冰上操作）（二）轉(zhuǎn)化（冰上操作）1、1.5mL管中加入感受態(tài)細(xì)胞50L和待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒2L，冰浴30min30min；2、42熱擊90sec90sec（勿晃動管子）；3、冰浴2min2min；4、加入37預(yù)熱的LB至1mL；5、37，振蕩（50r/min）培養(yǎng)2h2h；6、取200L涂板（Ampr），37培養(yǎng)12-16h12-16h； 7、對生長出的白色菌落計數(shù)，計算出每微升質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗六、實驗作業(yè)六、實驗作業(yè)計算出大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率 = 平板上的白色菌落數(shù)2L。轉(zhuǎn)化過程中，會不會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，為什么？如何排除？答：轉(zhuǎn)化過程中，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性。原因很多，如質(zhì)粒、菌株不純，載體自連等。詳細(xì)的解釋見分子遺傳學(xué)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗準(zhǔn)備工作1、培養(yǎng)板和菌株準(zhǔn)備實驗前2天：制備LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基（含amp