基因重組分析軟件RDP4分析演示

1、1、 要分析一個(gè)重組事件，首先需要一些基礎(chǔ)軟件的支持，其中最重要的是mega。2、 打開一個(gè).meg格式的文件：左擊鼠標(biāo)open按鈕。3、 點(diǎn)擊頁(yè)面頂端options按鈕，進(jìn)入General頁(yè)面選擇一系列參數(shù)：選擇你的序列是環(huán)狀還是線性，檢測(cè)所需要的方法，建議選擇默認(rèn)的選項(xiàng)（RDP, GENECONV and MAXCHI）你選擇的方式越多，消耗時(shí)間越長(zhǎng)。如果你分析的是小型數(shù)據(jù)（小于50個(gè)序列），你還可以選擇CHIMAERA，BOOTSCAN 和SISCAN 。一般不使用LARD方法，除非在驗(yàn)證重組時(shí)間或檢測(cè)小于20個(gè)序列的數(shù)據(jù)時(shí)。再看右邊的選項(xiàng)，在你第一次分析數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)該選上disentan

2、gle overlapping events選項(xiàng)，如果分析時(shí)卡住了再取消分析，把這個(gè)選項(xiàng)刪掉就可以了。其他選項(xiàng)選擇默認(rèn)就可以了4、 一旦所有選項(xiàng)都調(diào)試好之后，左擊主界面上的X-over按鈕開始進(jìn)行重組分析。如果你認(rèn)為耗費(fèi)的時(shí)間超出了你的預(yù)期，你可以點(diǎn)擊stop按鈕，如果你不想分析其中的某個(gè)序列，可以點(diǎn)擊Sequence display界面中右側(cè)序列的名字，左擊一下名字變灰，為mask這個(gè)序列，即對(duì)這個(gè)序列不進(jìn)行重組分析，但依然作為參考序列在做樹中顯示出來；左擊兩下名字變白，disable這個(gè)序列，即完全除去這個(gè)序列。這樣的處理可以提高分析重組的能力，集中精力分析你需要的序列。5、 分析完畢后出

3、現(xiàn)四個(gè)界面，順時(shí)針方向依次為Sequence display，The recombination information display.，Schematic sequence display以及 Plot display。下面分四個(gè)部分具體講解。1. The Sequence Display：左擊序列中的部位可以顯示不同顏色代表的含義鼠標(biāo)懸空在某個(gè)核苷酸上會(huì)顯示出該核苷酸處于何序列的具體位置。右擊鼠標(biāo)可以保存不同形式你想要的序列。Save entire alignment.：保存整個(gè)比對(duì)結(jié)果，可以保存成多種形式。Save alignment with recombinant sequence

4、s removed：保存沒有重組序列的比對(duì)結(jié)果。即在plot display 板塊中為一個(gè)完整的長(zhǎng)條的序列。Save alignment with recombinant columns removed.：將去除所有與重組相關(guān)的序列，如果一個(gè)比對(duì)結(jié)果中與重組相關(guān)的序列太多，很可能結(jié)果是一個(gè)空白或接近于空白。Save alignment with recombinant regions removed.：所有與重組相關(guān)的核苷酸將被取代為或.Save alignmnet with recombinant regions seperated.:重組序列將被分割成兩部分，一部分與重組無關(guān)，一部分是重組

5、部分。可以分別與其他序列進(jìn)行比對(duì)。Split alignment into common mosaics.：具有同一重組鑲嵌體的序列和其余的非重組序列被分裂為兩個(gè)單獨(dú)的比對(duì)結(jié)果。Save only enabled sequences.：只有被enable的序列才會(huì)保存。這個(gè)選項(xiàng)有助于手動(dòng)將同一組的序列保存成新的比對(duì)結(jié)果。Save only disabled sequences.：只有mask和disable的序列被保存下來如果你想單獨(dú)分析某一組序列，右擊鼠標(biāo)選擇select groups，點(diǎn)擊你想選擇的序列，變?yōu)樗{(lán)色即為選中，未選中的為黑色。如果你想專門看某個(gè)序列，右鍵點(diǎn)擊go to ，然后在

6、schematic sequence display中會(huì)顯示這個(gè)序列。5、The Recombination Information Display 這些信息包括用于檢測(cè)的方法,重組事件的編號(hào),可能的斷點(diǎn),序列的名字,可能的突變位點(diǎn)，與該重組毒株密切相關(guān)的,可能父母代的序列名字(主要和次要的父母)和次要父母代毒株比主要父母代毒株與重組序列的關(guān)系更密切的概率，以及P值的大小。如果出現(xiàn)以下情況，該界面還會(huì)出現(xiàn)warning標(biāo)示（紅色）：（1）在比對(duì)序列中只有一個(gè)可能為父母代毒株的序列（2）有可能(約30%或更大的可能)誤認(rèn)為重組序列(即實(shí)際上父母代的序列中的某個(gè)才是真正的重組毒株)如果是這樣會(huì)在后

7、面顯示出實(shí)際上可能為重組毒株的父母代毒株的名字。（3）無法識(shí)別出一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)突變位點(diǎn)。（4）一個(gè)或兩個(gè)突變位點(diǎn)是錯(cuò)位的。（5）重組信號(hào)微弱（6）如果復(fù)合信號(hào)可能是一個(gè)分析錯(cuò)誤的人工制品?！癱onfirmation table”部分表明了用不同方法檢測(cè)出發(fā)生該重組事件的毒株數(shù)和關(guān)于目前檢測(cè)到的重組事件的符合程度Confirmation table 下面是一個(gè)總結(jié)性的柱狀圖，對(duì)于99%的用戶來說前三條柱狀圖代表的是有用的信息。柱狀圖下面的分?jǐn)?shù)大于60分代表這該毒株幾乎確定為重組毒株。大于40小于60的分?jǐn)?shù)代表軟件可能犯了錯(cuò)誤，但也可能沒有。小于40表示該毒株很可能不是重組毒株。6、Schemat

8、ic sequence displayFigure 2. The schematic sequence displayCurrent viewCycle through display optionsSave sub-alignmentRecombinant regionBackground sequence每一個(gè)長(zhǎng)條都代表一個(gè)重組序列。不同的顏色可以代表不同的意思：1.每一個(gè)最可能為重組事件供體的序列被賦予獨(dú)一無二的顏色。2.用于檢測(cè)重組序列的方法。3.他們相關(guān)的P值4.它們與推測(cè)的父母代序列之間的關(guān)聯(lián)性大小?？梢酝ㄟ^cycle through display options” button

9、選項(xiàng)改變顏色。而這些顏色代表的意思可以通過左擊擊灰色部分看到。右擊鼠標(biāo)灰色部分可以將該圖拷貝到剪貼板或保存成.emf文件。該圖表可以轉(zhuǎn)換三種模式 (1) “Show all events for sequence X” (sequence X 是你的鼠標(biāo)距離最近的序列) (2) “Show only best events for all sequences,” and (3) “Show all events for all sequences.”就是有的重組事件可能用所有方法都可以檢測(cè)到，而有的重組事件只有一到兩種方法可以檢測(cè)到。如果你選擇（2）的話只有最優(yōu)的重組事件會(huì)顯示出來（即P值最低

10、）。你可以通過鍵盤上的pgDn和PgUp瀏覽重組事件。在序列彩色條上右擊鼠標(biāo)會(huì)出現(xiàn)一系列的選項(xiàng)，你可以通過“接受或不接受該重組事件”選項(xiàng)來人為修改你認(rèn)為RDP出現(xiàn)的錯(cuò)誤，也可以將父母代供體和重組毒株相互調(diào)換，但必須慎重，因?yàn)檫@個(gè)調(diào)換是不可恢復(fù)的，如果你要取消調(diào)換只能重新分析。而且，盡管RDP可能出現(xiàn)錯(cuò)誤，但它至少是一個(gè)客觀的判斷方法，沒有人的主觀性。所以，除非你有充足的理由，否則不要隨便調(diào)換。在你瀏覽這些重組序列的時(shí)候，應(yīng)該時(shí)刻accept你認(rèn)為正確的重組序列，這樣有利于你記錄自己的進(jìn)度，也有利于修改RDP的錯(cuò)誤，因?yàn)橐坏㏑DP在這里出現(xiàn)錯(cuò)誤，那么它在后面出現(xiàn)錯(cuò)誤的幾率也會(huì)增大。所以，在acc

11、ept之后就選擇選項(xiàng)欄的Re-Identify recombinant sequences for all unaccepted events，或者點(diǎn)擊下面的“Re-scan”按鈕重新進(jìn)行分析。檢測(cè)RDP的誤差可以通過選擇show all evidences選項(xiàng) 來觀察不同方法檢測(cè)到的重組事件的breakpoints是否不同，如果不同的話就值得你人工去觀察到底哪個(gè)是正確的。如果你認(rèn)為兩個(gè)重組事件來源于一個(gè)祖代毒株，可以選擇通過Merge events選項(xiàng)將其合并為一個(gè)重組事件7.The Plot DisplayFigure 4. The plot display. See section 8

12、for details on what is plotted.KeyPlot displayPress to abort a check Press to select methodP-value cutoffX and Y coordinatesof the mouse pointer雙擊這個(gè)區(qū)域的任何位置都會(huì)在上方的sequence display panel顯示出相應(yīng)的序列。鼠標(biāo)移動(dòng)到任何位置都會(huì)顯示出X軸和Y軸的數(shù)值。5.5 The Tree Displays如果你按下“tree”按鈕,一系列表示該重組毒株與其他毒株關(guān)系的樹將會(huì)以兩種不同的方式展示如果單擊屏幕頂部在命令面板的“tree

13、”按鈕兩棵樹將會(huì)并排顯示。而如果你按下recombination information display 上方的“Tree”按鈕則會(huì)在該區(qū)域顯示一株進(jìn)化樹。點(diǎn)擊右上角的“cycle through trees”按鈕即可以用該序列的不同部分進(jìn)行做樹分析。包括：（1）根據(jù)重組序列的不同部分分別作樹（2）只有已確認(rèn)的重組區(qū)域做樹（即用minor parent 部分）（3）只用已確認(rèn)的非重組區(qū)域做樹（即major parent部分）（4）忽略重組的所有區(qū)域做樹。在同一個(gè)頁(yè)面顯示兩棵樹可以追蹤一個(gè)序列在不同區(qū)域做樹后的變化，左擊樹上的某個(gè)序列可以標(biāo)記這個(gè)序列在樹上的位置。在樹的部位右擊會(huì)出現(xiàn)一系列的選項(xiàng)

14、，比如“清除顏色”“自動(dòng)選擇顏色”“自主選擇顏色”等，可以把樹上的序列分別弄上不同的顏色。你還可以選擇不同方法做樹，包括： neighbour joining, least squares, maximum likelihood, and Bayesian trees. “Mark sequence name as also having evidence of this event” 和“Mark sequence name as not having evidence of this event.”選項(xiàng)可以使你在樹上手動(dòng)修改你認(rèn)為RDP所犯的錯(cuò)誤，就是如果你認(rèn)為這個(gè)序列不屬于這個(gè)重組事件你

15、可以把它從該事件中剔除，或這個(gè)序列本應(yīng)屬于該重組事件，但RDP把他排除在外了，你可以認(rèn)為把它加進(jìn)去。“Go to sequence name”選項(xiàng)可以指引你在schematic sequence display板塊看到這個(gè)序列?！盧echeck plot with sequence name as recombinant/minor parent/major parent”選項(xiàng)可以使你看到如果你替換了重組序列/次要母本/主要母本（即樹中的紅色、藍(lán)色和綠色序列）其中的一個(gè)序列后，進(jìn)化樹會(huì)變成什么樣子。The Matrix Display點(diǎn)擊主面板上的Matrix選項(xiàng)，就會(huì)顯示出矩陣圖像，有好多種矩陣的顯示方法供你選擇。右擊鼠標(biāo)或者點(diǎn)擊主面板上的下拉三角都可以選擇。如果你確定一個(gè)重組事件真的發(fā)生了，這時(shí)你就要仔細(xì)檢查RDP有沒有準(zhǔn)確判斷出重組發(fā)生的位點(diǎn)，和有沒有夸大或過小分組的現(xiàn)象，你就要用其他RDP提供的附加應(yīng)用進(jìn)行驗(yàn)證。可使用的方法簡(jiǎn)介：RDP method, GENECONV, Boots