PCR引物的設(shè)計ppt課件

1、1l引物l引物的重要性l引物設(shè)計的原則l引物與PCRl引物設(shè)計軟件l如何使用Primer Premier 5.0l引物同源性分析2l引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。3355Sense primerAntisense primer3l在整個PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。4l引物長度 l堿基分布的均衡性lTm值l引物二級結(jié)構(gòu)l引

2、物3端l引物5端l引物的內(nèi)部穩(wěn)定性l引物的保守性與特異性l擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)5l一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過50個核苷酸。6l同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個lGC含量一般40-60%GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。7l一般要求：55-65。l計算：對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。lTm = H/

3、( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.158l引物二聚體盡可能避免兩個引物分子之間3端有有較多堿基互補l發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。9l引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。10l引物5端可以有與模板DNA不配對堿基，在5端引入一段非模板依賴性序列。5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護

4、堿基）。5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。11l過去認為，引物3端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進行延伸，故3端最好為G或C。l現(xiàn)在的觀點認為，引物的5端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3端幾個堿基與模板互補結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。12l保守性：通用引物檢測同一類病原微生物盡可能多的型別l特異性：避免非特異性擴增13l模

5、板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，在選擇引物時，應(yīng)使擴增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。擴增區(qū)域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30lTm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length14l引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L)l退火溫度最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25一般采用較引物Tm值低5作為PCR退火溫度。15lPrimer Premier 5.0 生物軟件網(wǎng)下載安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。 lOligolprimer 3lThe Primer GeneratorlNetPrimer16l引物設(shè)計一般引物設(shè)計5帶酶切位點引物設(shè)計巢式PCR引物設(shè)計多重PCR引物設(shè)計l探針設(shè)計l引物