分子生物學(xué)實驗實驗操作PPT課件

1、基因、載體、受體菌株基因、載體、受體菌株基因基因載體載體菌株菌株質(zhì)粒質(zhì)粒酶切連接酶切連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取PCRPCR第1頁/共24頁應(yīng)掌握的實驗技術(shù)應(yīng)掌握的實驗技術(shù)酶切酶切,連接連接凝膠回收凝膠回收制備感受態(tài)細胞制備感受態(tài)細胞質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取PCR瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳考察指標考察指標電泳電泳電泳電泳感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率率電泳電泳電泳電泳電泳電泳第2頁/共24頁rhIL-18rhIL-18基因的基因的PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物質(zhì)粒質(zhì)粒pUC18pUC18BglBgl和和PstPst雙雙酶切酶切BamHBamH和和PstPst雙雙酶切酶切濃度濃度1%1%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠

2、電泳凝膠回收凝膠回收配制配制 LB LB 液體與固體平板培養(yǎng)基液體與固體平板培養(yǎng)基滅菌滅菌第3頁/共24頁凝膠回收與溶液回收凝膠回收與溶液回收電泳檢驗電泳檢驗T4T4連接酶連接酶連接過夜連接過夜E .E .colicoli DH5 DH5菌株菌株 3737過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng)第4頁/共24頁提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNADNA濃度濃度1%1%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第5頁/共24頁PCRPCR濃度濃度1%1%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第6頁/共24頁L rhIL-18的PCR產(chǎn)物 P C R 產(chǎn) 物 1 0 L B u f f e r O 2 L 無菌水 7L 質(zhì)粒pUC18 質(zhì)粒 10L B a

3、m H B u ff e r 2 L 無菌水 Pst 1L37酶切反應(yīng)3小時。第7頁/共24頁第8頁/共24頁 LB液體培養(yǎng)基每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化鈉 5g 調(diào)節(jié)pH到 LB固體培養(yǎng)基:每100ml液體培養(yǎng)基添加瓊脂 每組準備：1個30ml 液體培養(yǎng)基第9頁/共24頁滅菌滅菌 1個30ml LB 液體培養(yǎng)基 微量移液器槍頭（200uL）第10頁/共24頁 瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA 片段的標準方法。 DNA 的分子大小 瓊脂糖濃度 DNA 分子的構(gòu)象 電源電壓 嵌入染料的存在 離子強度影響第11頁/共24頁瓊脂糖凝膠電泳檢驗，回收酶切產(chǎn)物：使用UNIQ-

4、10柱式凝膠回收試劑盒柱式凝膠回收試劑盒分別對： 目的基因片段（片段）溶液回收 載體片段（片段）進行凝膠回收第12頁/共24頁1.通過瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其他片段盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀切下含需回收DNA的瓊脂塊，放入Ep管。2.按300L/100mg（3:1）的比例加入 Binding Buffer，置于50-60水浴中10min，使凝膠徹底融化。期間，每2 min混勻一次。3.將融化的溶膠液轉(zhuǎn)移到套在 2-ml 收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置 2 min。12000 rpm 室溫離心 1 min。4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同

5、一個收集管中，加入500L Wash Solution，12000 rpm 室溫離心 1 min。5.重復(fù)步驟4一次。第13頁/共24頁6.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將 UNIQ-10 柱放入同一個收集管中，12000 rpm 室溫離心 2 min。7.將 UNIQ-10 柱放入一根新的 Ep 管中，在柱子膜中央加30L Elution Buffer，60放置 5min。8.12000 rpm 室溫離心 1 min ，離心管中的液體即為回收的DNA片段。從溶液中回收從溶液中回收DNA： 根據(jù)溶液的體積，加入 3 倍體積的 Binding Buffer混勻。 以下操作參照瓊脂糖凝

6、膠中回收DNA步驟3-8. 第14頁/共24頁計算基因與載體片段比例計算基因與載體片段比例 紫外下觀察基因與載體片段的亮度紫外下觀察基因與載體片段的亮度 基因的摩爾數(shù)基因的摩爾數(shù)基因片段亮度基因片段亮度/ /堿基數(shù)（堿基數(shù)（495bp495bp） 載體的摩爾數(shù)載體的摩爾數(shù)載體片段亮度載體片段亮度/ /堿基數(shù)（堿基數(shù)（2700bp2700bp） 基因摩爾數(shù)基因摩爾數(shù)/ /載體摩爾數(shù)載體摩爾數(shù) 最佳比例是最佳比例是3 3：1 1第15頁/共24頁 在滅菌的離心管（在滅菌的離心管（PCR管）中進行管）中進行 20L體積反應(yīng)體系中：體積反應(yīng)體系中： 10快速連接緩沖液快速連接緩沖液 2L rhIL-1

7、8雙酶切產(chǎn)物雙酶切產(chǎn)物 X L 質(zhì)粒質(zhì)粒pUC18雙酶切產(chǎn)物雙酶切產(chǎn)物 Y L T4-DNA連接酶連接酶 1L201h，4 過夜過夜第16頁/共24頁（1）E.coli DH5菌株菌株37過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液加入到菌液加入到30 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，37，230 r/min振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)3 h，至至OD600約為左右。約為左右。（2）無菌條件下，將）無菌條件下，將50mL菌液轉(zhuǎn)移至菌液轉(zhuǎn)移至離心管離心管中，冰上放置中，冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻至，使培養(yǎng)物冷卻至0。（3）在預(yù)冷）在預(yù)冷4的離心機上以的離心機上以4000r/mi

8、n離心離心10min，棄去上清，棄去上清，加入加入30mL預(yù)冷的預(yù)冷的2溶液重懸沉淀，冰浴上放置溶液重懸沉淀，冰浴上放置10 min。（4）以）以4000r/min在在4離心離心10min，棄去上清，每，棄去上清，每30mL初始培初始培養(yǎng)物用預(yù)冷的養(yǎng)物用預(yù)冷的2溶液重懸細胞沉淀，溶液重懸細胞沉淀，200L/管分裝管分裝。第17頁/共24頁（1）向分裝有）向分裝有200LE.coli DH5菌株感受態(tài)細胞的菌株感受態(tài)細胞的EP管中加入管中加入10L的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30 min。（2）將該）將該EP

9、管放入預(yù)加溫至管放入預(yù)加溫至42的水浴中，放置的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻12 min。 （3）向）向EP管加入管加入800 L LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37搖床上，搖床上，150r/min，溫育，溫育45 min以復(fù)蘇菌株。以復(fù)蘇菌株。第18頁/共24頁（4）將）將200L上述培養(yǎng)物加到含上述培養(yǎng)物加到含100g/mL氨卞氨卞青霉素的青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)平板上，以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細胞平鋪于瓊脂平板表面?；毎戒佊诃傊桨灞砻妗＃?）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，

10、倒置平皿，平皿，37過夜培養(yǎng)，篩選鑒定。過夜培養(yǎng)，篩選鑒定。第19頁/共24頁1 將過夜培養(yǎng)的12ml細菌12,000rpm離心1 min，徹底去除上清。2 加入250l Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。3 加入250 l Solution II，立即溫和混勻（傾斜45度角，順一個方向，慢慢旋轉(zhuǎn)離心管），使細菌裂解，室溫放置2分鐘。4 加入350l Solution III，立即上下顛倒510次，使之充分中和，室溫放置5分鐘。5 12,000rpm，離心10分鐘。6 將步驟5中上清轉(zhuǎn)移到套放于收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min后，8,000rpm室溫離心1 mi

11、n。7 棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室溫離心1 min。8 重復(fù)步驟7。9 棄收集管中的廢液，將U N I Q - 1 0 柱 放 入 同 一 支 收 集 管 中 ，12,000rpm室溫離心2 min以徹底去除Wash Solution。10 將UNIQ-10柱放入新的潔凈離心管中，加30l Elution Buffer，60放置10 min后，10,000rpm室溫離心1分鐘。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。第20頁/共24頁第21頁/共24頁1、調(diào)整模板（、調(diào)整模板（ 待鑒定質(zhì)

12、粒）濃度至待鑒定質(zhì)粒）濃度至 5 ng/ L2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl2（25mmol/L） 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs （2mmol/L） 2.0 L Ta q 酶 （ 5 U / L ） 加ddH2O至 20L外源基因的特異引物：外源基因的特異引物：引物引物M13 Primer M4:（5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3） 引物引物M13 Primer RV: （ 5-CAGGAAACAGCTAAC-3）第22頁