04第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)(四)

1、第四節(jié)第四節(jié) 植物花藥和花粉培養(yǎng)植物花藥和花粉培養(yǎng) 花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)：花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)： 指離體培養(yǎng)花藥和花粉，使花粉改變原來的配子體發(fā)育途徑，轉(zhuǎn)向孢子體體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株從中鑒定出單倍體植株并使之二倍化的細胞工程技術(shù)單倍體的應(yīng)用潛力單倍體的應(yīng)用潛力 克服后代分離，縮短育種年限； 選擇效率高； 有利于隱性基因控制性狀的選擇； 快速獲得純合自交系； 其他：復(fù)壯；遠緣雜交；進行花粉發(fā)育等的理論研究。一、培養(yǎng)材料的選取與制備一、培養(yǎng)材料的選取與制備（一）材料選擇（一）材料選擇（二）預(yù)處理（二）預(yù)處理（三）外植體制備（三）外植體制備（一）材料選擇（一）材料選擇1

2、. 基因型：基因型：培養(yǎng)材料的基因型是影響花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體成功的最重要因素之一。2. 花粉發(fā)育時期花粉發(fā)育時期3. 生理狀態(tài)生理狀態(tài)（二）預(yù)處理（二）預(yù)處理1. 低溫處理：將花蕾用濕紗布包裹后再用塑料袋封裝，放在冰箱中冷藏2. 高溫處理（熱激處理）3. 高溫和低溫交替處理4. 黑暗處理5. 高糖液處理6. 激光照射7. 其他方法（三）外植體制備（三）外植體制備 花藥和花粉培養(yǎng)中的表面滅菌通常先用70%75%乙醇浸潤花蕾30s左右，然后在孢和漂白粉溶液(上清液)中浸泡10-20min，或在0.1%氯化汞溶液中處理5-10min，之后用無菌水漂洗3-5次。由于花藥和花粉粉培養(yǎng)所取材料是未開放的花

3、蕾，其內(nèi)部的花和花粉實際上處于無菌狀態(tài)，表面滅菌在能殺滅花蕾表面微生物的前提下，處理的強度以盡可能輕為好。花蕾經(jīng)表面滅菌后，需在無菌條件下錄取花藥，接種在培養(yǎng)基上。 花粉培養(yǎng)來說，需制備花粉外植體：花粉培養(yǎng)來說，需制備花粉外植體： 自然釋放法。研磨過濾收集法。機械游離法。磁拌法。 二、植株再分化二、植株再分化（一）脫分化培養(yǎng)（一）脫分化培養(yǎng)1. 培養(yǎng)方式的選擇培養(yǎng)方式的選擇2. 基本培養(yǎng)基的選擇基本培養(yǎng)基的選擇3. 培養(yǎng)溫度的選擇培養(yǎng)溫度的選擇4. 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇5. 碳源的選擇碳源的選擇6. 其他添加成分其他添加成分1. 培養(yǎng)方式的選擇培養(yǎng)方式的選擇（1）固體平板培養(yǎng)：

4、固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)（2）液體培養(yǎng)：在液體培養(yǎng)基表面進行培養(yǎng)（3）雙層培養(yǎng) ：在固體液體雙層培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（4）分步培養(yǎng)：花藥-花粉分步培養(yǎng)（5）條件培養(yǎng)：用預(yù)先培養(yǎng)過花藥的液體條件培養(yǎng)基再次進行花藥培養(yǎng)（6）看護培養(yǎng)：）看護培養(yǎng)：（7）微室培養(yǎng)）微室培養(yǎng)2. 基本培養(yǎng)基的選擇基本培養(yǎng)基的選擇（1）常用的培養(yǎng)基有MS、Nitsch、B5、N6、H、Miller培養(yǎng)基等（2）基本培養(yǎng)基的影響實質(zhì)上是無機鹽離子濃度、氮源總濃度、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的濃度和比值等差異造成的3. 培養(yǎng)溫度的選擇培養(yǎng)溫度的選擇 離體培養(yǎng)的花藥(花粉)在培養(yǎng)初期對溫度比較敏感，大多需要在2528C下培養(yǎng)4. 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇

5、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇 在花藥和花粉培養(yǎng)的脫分化階段，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇是最重要的壞節(jié)。 花藥和花粉培養(yǎng)的主要內(nèi)容是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選，包括生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度及配比。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇，主要根據(jù)植物種類和植株再生方式來進行。5. 碳源的選擇碳源的選擇 碳源的選擇包括碳源濃度和各類的選擇，以適應(yīng)不同植物種類離體花藥和花粉小孢子脫分化過程中對滲透和異養(yǎng)能源物質(zhì)的要求。 一般來說，單子葉植物比雙子葉植物要求更高濃度的碳源，前者一般5%以上，高者可達到15%，后者一般3%左右。 大多數(shù)情況下，采用蔗糖作為碳源都可獲得較好的結(jié)果，但采用其他糖作為碳源可或多或少提高培養(yǎng)的效果。6. 其他添加成分其他添加

6、成分（1）活性炭（2）水解酪蛋白（3）維生素C（4）維生素A（5）聚乙烯吡哆酮（6）硝酸銀（7）三十烷醇（三）再分化培養(yǎng)（三）再分化培養(yǎng)1. 胚狀體途徑（1）直接胚狀體發(fā)生：從離體培養(yǎng)的花藥和花粉直接產(chǎn)生胚狀體（2）間接胚狀體發(fā)生：離體培養(yǎng)的花藥和花粉先形成胚性愈傷組織，然后再由胚性愈傷組織分化出胚狀體2. 器官發(fā)生途徑1. 胚狀體途徑胚狀體途徑（1）通過胚狀體途徑再生植株的，都是那些很容易做花藥(花粉)培養(yǎng)的基因型或從極佳生理狀態(tài)的母株上取到的處于最適宜發(fā)育時期的花藥(花粉)（2）對于直接胚狀體途徑來說再分化培養(yǎng)一般只是將完成了誘導(dǎo)脫分化的花藥和花粉進行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。在少數(shù)情況下，轉(zhuǎn)管培養(yǎng)所用的

7、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方式可以和脫分化培養(yǎng)階段完全相同，多數(shù)情況下，這種轉(zhuǎn)管培養(yǎng)要做有別于脫分化培養(yǎng)階段的適當(dāng)調(diào)整2. 器官發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑 通過器官發(fā)生型途徑再生植株的分化培養(yǎng)中.最重要的是選擇適宜的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)類、濃度和配比。生長素和細胞分裂素共同作用調(diào)控愈傷組織形態(tài)發(fā)生的模式可以用來指導(dǎo)花藥和花粉培養(yǎng)中愈傷組織分化器官的培養(yǎng)。（四）煉苗和移栽（四）煉苗和移栽三、單倍體植株鑒定和染色體加倍三、單倍體植株鑒定和染色體加倍（一）花藥和花粉植株的倍性花藥和花粉植株的倍性（二）花藥和花粉植株倍性鑒定（二）花藥和花粉植株倍性鑒定（三）花藥和花粉單倍體植株的染色體加倍（三）花藥和花粉單倍體植株的染色體加

8、倍（一）花藥和花粉植株的倍性（一）花藥和花粉植株的倍性1. 由花藥和花粉培養(yǎng)獲得的植株，倍性多樣。由花藥和花粉培養(yǎng)獲得的植株，倍性多樣。2.花藥植株倍性混雜的原因：花藥植株倍性混雜的原因：體細胞組織的干擾。生殖細胞的自發(fā)加倍（二）花藥和花粉植株倍性鑒定（二）花藥和花粉植株倍性鑒定1. 形態(tài)鑒定形態(tài)鑒定 （1） 一般情況下，單倍體植株的形態(tài)為植株瘦弱、葉片窄小、花小柱頭長，而多倍體植物的形態(tài)為植株健壯、葉片寬大、花大柱頭短 （2）顯微鏡下觀察葉片氣孔保衛(wèi)細胞的長度，是近年來采用較多的細胞倍性鑒定法。一般情況下，倍性越高氣孔越大，單位面積氣孔數(shù)目越小。2. 結(jié)實性鑒定結(jié)實性鑒定 單倍體植株、三部體

9、植株和非整體植株雖然都能開花但不結(jié)實；二倍體植株則開花結(jié)實都正常；四倍體植株雖能開花和結(jié)實，結(jié)實性不良，但經(jīng)過長期選擇淘汰，其結(jié)實性可能提高。3. 染色體數(shù)目鑒定染色體數(shù)目鑒定 采用涂片法(或壓片法)和去壁低滲法，通過檢查根尖或莖尖染色體數(shù)目，排除嵌合體的干擾，可同時對根尖以外的細胞，如嫩葉細胞、花粉母細胞等的染色體進行觀察。4. 遺傳標(biāo)記鑒定遺傳標(biāo)記鑒定（1）生化標(biāo)記鑒定：）生化標(biāo)記鑒定：以基因表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)為主的一類標(biāo)記系統(tǒng)，常用的是同工酶標(biāo)記。（2）分子標(biāo)記鑒定：）分子標(biāo)記鑒定：標(biāo)記檢測的是植物基因組DNA水平的差異5. 流式細胞儀鑒定法流式細胞儀鑒定法（三）花藥和花粉單倍體植株的染色體

10、（三）花藥和花粉單倍體植株的染色體加倍加倍1. 在常規(guī)條件下處理 用0.02%0.4%秋水仙素處理花藥和花粉單倍體植株2. 在組織培養(yǎng)條件下處理 用秋水仙素加倍也可在組織培養(yǎng)條件下進行。常用的方法有兩種：一是在培養(yǎng)基中加入秋水仙素進行培養(yǎng)；二是在培養(yǎng)過程中單獨用秋水仙素溶液浸泡培養(yǎng)材料，然后置于不含秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第五節(jié)第五節(jié) 植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)（一）胚胎培養(yǎng)的概念（一）胚胎培養(yǎng)的概念 1. 胚胎培養(yǎng)：胚胎培養(yǎng)：指使胚指使胚或具胚器官（如子房、或具胚器官（如子房、胚珠等）在離體無菌胚珠等）在離體無菌條件下發(fā)育成幼苗的條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。技術(shù)。廣義的胚胎培養(yǎng)還包括胚乳培養(yǎng)和試管

11、受精等技術(shù)。一、植物胚胎培養(yǎng)的概念和應(yīng)用一、植物胚胎培養(yǎng)的概念和應(yīng)用（二）植物胚胎培養(yǎng)分類（二）植物胚胎培養(yǎng)分類1. 胚培養(yǎng)：胚培養(yǎng)：指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的技術(shù)。分離出來，置于培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的技術(shù)。 一般分為幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)。一般分為幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)。 幼胚培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)則指胚齡處于早期原胚、球形期胚、心形則指胚齡處于早期原胚、球形期胚、心形期胚、魚雷期胚的培養(yǎng)。期胚、魚雷期胚的培養(yǎng)。 成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)一般指子葉期至發(fā)育成熟胚的培養(yǎng)，其一般指子葉期至發(fā)育成熟胚的培養(yǎng)，其培養(yǎng)較易成功。培養(yǎng)較易成功。幼胚： 原胚

12、球形胚心型胚魚雷胚子葉胚球形胚前期球形胚前期心心型型胚胚前前期期魚雷胚魚雷胚球形胚球形胚2. 胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng)指對處于細胞期的胚乳組織進行離體培養(yǎng)的方法。3. 胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng) 胚珠培養(yǎng)是指未受精或受精后的胚珠離體培養(yǎng)。4. 子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)是指授粉和未授粉的子房培養(yǎng)5試管受精試管受精 試管受精指在無菌離體條件下培養(yǎng)離體的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)產(chǎn)生的花粉管進入胚珠從而完成受精過程。(二二)植物胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用植物胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用1. 克服遠緣雜交的不育性，獲得稀有雜種植物克服遠緣雜交的不育性，獲得稀有雜種植物2. 打破種子休眠，提早結(jié)實，縮短育種年限打破種子休眠，提早

13、結(jié)實，縮短育種年限3. 使生活力低下或無生活力的種子萌發(fā)使生活力低下或無生活力的種子萌發(fā)4. 使柑橘類植物合子胚正常發(fā)育使柑橘類植物合子胚正常發(fā)育5. 測定種子活力測定種子活力6. 獲三倍體或單倍體植株獲三倍體或單倍體植株7. 快速繁殖特殊植物快速繁殖特殊植物8. 用于理論研究用于理論研究二、植物胚培養(yǎng)二、植物胚培養(yǎng)（一）胚培養(yǎng)的方法（一）胚培養(yǎng)的方法是將受精后成熟（未成熟）種子或果實，用是將受精后成熟（未成熟）種子或果實，用70%酒精表面消毒酒精表面消毒幾秒鐘，再用幾秒鐘，再用0.1%升汞溶液或飽和漂白粉溶液消毒升汞溶液或飽和漂白粉溶液消毒10min，無，無菌水反復(fù)沖洗。菌水反復(fù)沖洗。1.

14、成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)一般指子葉期至發(fā)育成熟胚的培養(yǎng)，其一般指子葉期至發(fā)育成熟胚的培養(yǎng)，其培養(yǎng)較易成功。培養(yǎng)較易成功。2. 幼胚培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)則指胚齡處于早期原胚、球形期胚、心則指胚齡處于早期原胚、球形期胚、心形期胚、魚雷期胚的培養(yǎng)。形期胚、魚雷期胚的培養(yǎng)。 （二）離體胚形態(tài)發(fā)生及影響因素（二）離體胚形態(tài)發(fā)生及影響因素1. 離體胚形態(tài)發(fā)生離體胚形態(tài)發(fā)生（1）正常胚胎發(fā)育：）正常胚胎發(fā)育：成熟胚在適宜的培養(yǎng)條件下，維持胚的生長進行正常的胚胎發(fā)育過程，直至形成再生植株。 （2）胚性發(fā)育：）胚性發(fā)育：幼胚生長增大至正常胚大小甚至超過正常胚，但不能萌發(fā)成幼苗?？赏ㄟ^提高培養(yǎng)基滲透壓進行調(diào)整，也可以用生長素

15、或天然營養(yǎng)物調(diào)節(jié)使胚正常生長。（3）早熟萌發(fā)）早熟萌發(fā) ：幼胚在培養(yǎng)中越過正常胚發(fā)育階段，在未達到生理和形態(tài)成熟時迅速萌發(fā)長成幼苗，這一現(xiàn)象稱為早熟萌發(fā)。這樣產(chǎn)生的苗往往畸形、細弱、難易成活。因此，幼胚培養(yǎng)應(yīng)防止早熟萌發(fā)。（4）產(chǎn)生愈傷組織）產(chǎn)生愈傷組織 在幼胚培養(yǎng)中常常能在追加生長調(diào)節(jié)劑時誘發(fā)愈傷組織產(chǎn)生，進而分化形成胚狀體或不定芽。2.離體胚培養(yǎng)影響因素離體胚培養(yǎng)影響因素（1） 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 常用的培養(yǎng)基種類包括：成熟胚培養(yǎng)-Tukey、Randilph和Cox、White、MS、B5（1968）；未成熟幼胚培養(yǎng)-Rijven、Rappaport、Rangaswamy、Norstog、Ni

16、tsh、B5、MS 不同發(fā)育時期的胚要求蔗糖濃度不同，通常胚齡越小要求蔗糖濃度越高 培養(yǎng)基pH對幼胚生長也十分重要。一般pH范圍在5.2-6.3（2）附加物）附加物 氨基酸類。氨基酸類。無論是單一的還是復(fù)合的氨基酸都能刺激胚的生長。維生素類。維生素類。各種維生素一直被用于胚培養(yǎng)中，對初期幼胚一般是必須的。天然提取物天然提取物 。CM、各種胚乳汁、酵母提取物，麥芽提取物等天然營養(yǎng)被廣泛使用生長調(diào)節(jié)劑。生長調(diào)節(jié)劑。不同植物的胚培養(yǎng)對生長調(diào)節(jié)劑的需求很不一致。情況比較復(fù)雜。（3）環(huán)境條件）環(huán)境條件 弱光和黑暗更適宜幼胚培養(yǎng)，因為胚在胚珠內(nèi)發(fā)發(fā)育時不見光的，但是到萌發(fā)時器需要光。光有利于胚芽生長，黑暗

17、有利于胚根生長，因此，以光暗交替培養(yǎng)更佳。（4）培養(yǎng)材料）培養(yǎng)材料 材料基因型不同，胚培養(yǎng)的難易程度也不同。發(fā)育階段以越幼嫩的胚越難以培養(yǎng)。（5） 胚乳的看護培養(yǎng) 培養(yǎng)極早期的胚困難較大，胚乳看護培養(yǎng)在一定程度上有助于早期培養(yǎng)的成活與發(fā)育。三、植物胚乳培養(yǎng)三、植物胚乳培養(yǎng)（一）胚乳培養(yǎng)方法和培養(yǎng)后代特征（一）胚乳培養(yǎng)方法和培養(yǎng)后代特征1. 胚乳培養(yǎng)方法胚乳培養(yǎng)方法（1）外植體取材：）外植體取材：取待胚乳細胞的種子（或果實）表面滅菌后，無菌條件下剝離胚乳組織接種。 植物材料胚乳發(fā)育類型及發(fā)育時期直接影響外植體取材時期以及胚乳細胞產(chǎn)生愈傷組織頻率。 （2）培養(yǎng)基的選擇）培養(yǎng)基的選擇基本培養(yǎng)基?；?/p>

18、培養(yǎng)基。誘導(dǎo)愈傷組織常用基本培養(yǎng)基是MS、LS、White，其中MS使用頻率最高。適當(dāng)添加生長調(diào)節(jié)劑。有機添加物。有機添加物。各種植物胚乳組織的培養(yǎng)對培養(yǎng)條件要求類似。胚乳培養(yǎng)時，培養(yǎng)基配合使用生長素，細胞分裂素和天然胚乳培養(yǎng)時，培養(yǎng)基配合使用生長素，細胞分裂素和天然營養(yǎng)物（即有機氮源），效果顯著。營養(yǎng)物（即有機氮源），效果顯著?！芭咭蜃优咭蜃印薄Ｅ咴谂呷榕囵B(yǎng)中的作用問題早期研究認為胚是必須的。pH。2.培養(yǎng)后代特征培養(yǎng)后代特征成熟和未成熟胚乳培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或直成熟和未成熟胚乳培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或直接進行器官分化。只有能分化的胚乳愈傷組織才接進行器官分化。只有能分化的胚乳愈傷組織才

19、能產(chǎn)生器官分化。能產(chǎn)生器官分化。長期培養(yǎng)的胚乳愈傷組織，細胞染色體數(shù)目常發(fā)長期培養(yǎng)的胚乳愈傷組織，細胞染色體數(shù)目常發(fā)生變化，如多倍化、非整倍體等。胚乳組織培養(yǎng)生變化，如多倍化、非整倍體等。胚乳組織培養(yǎng)再生植株。不一定保持原來倍性。再生植株。不一定保持原來倍性。（二）胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生（二）胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生1. 胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生途徑胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生途徑胚乳培養(yǎng)中，僅僅少數(shù)寄生和半寄生植物可以從胚乳直接胚乳培養(yǎng)中，僅僅少數(shù)寄生和半寄生植物可以從胚乳直接分化出器官，大多數(shù)植物都不行，都需要先形成愈傷組織，分化出器官，大多數(shù)植物都不行，都需要先形成愈傷組織，再進行分化。再進行分化。2. 胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生

20、影響因素胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生影響因素欲使胚乳組織培養(yǎng)分化莖芽，必須使用一種外源細胞分裂欲使胚乳組織培養(yǎng)分化莖芽，必須使用一種外源細胞分裂素，其中素，其中2ip具有極其顯著促進胚乳組織分化莖芽的效果，具有極其顯著促進胚乳組織分化莖芽的效果，激動素的使用效果也十分明顯。激動素的使用效果也十分明顯。四、植物胚珠和子房培養(yǎng)四、植物胚珠和子房培養(yǎng) 植物胚珠植物胚珠和子房培養(yǎng)指和子房培養(yǎng)指已經(jīng)授粉和未已經(jīng)授粉和未授粉胚珠和子授粉胚珠和子房的離體培養(yǎng)。房的離體培養(yǎng)。（一）胚珠培養(yǎng)（一）胚珠培養(yǎng)1.培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：從花蕾中取出子房，表面消毒后在無菌條件下剝?nèi)幕ɡ僦腥〕鲎臃?，表面消毒后在無菌條件下剝?nèi)∨咧苯又?/p>

21、培養(yǎng)。培養(yǎng)基常用胚直接中培養(yǎng)。培養(yǎng)基常用Nitsh、Ms、N6、B5等，添加等，添加IAA、IBA、2,4-D等激素和等激素和YE、CM、CH等營養(yǎng)物質(zhì)及糖等營養(yǎng)物質(zhì)及糖和維生素。和維生素。2. 離體胚珠培養(yǎng)成功的關(guān)鍵離體胚珠培養(yǎng)成功的關(guān)鍵（1）材料基因型）材料基因型 （2）發(fā)育時期）發(fā)育時期 （3）胎座組織）胎座組織 。（4）附加成分）附加成分 （二）子房培養(yǎng)（二）子房培養(yǎng)1. 培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：受精后子房仍需要進行表面消毒接種。而未受受精后子房仍需要進行表面消毒接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無菌條件下直接剝?nèi)∽臃烤臃靠蓪⒒ū槐砻嫦竞螅跓o菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。子房培養(yǎng)對

22、培養(yǎng)基要求不嚴格，如接種。子房培養(yǎng)對培養(yǎng)基要求不嚴格，如MS、White、Nitsch等均可。需要添加適量有機成分和激素等均可。需要添加適量有機成分和激素2. 影響培養(yǎng)成功的因素影響培養(yǎng)成功的因素（1）材料選擇）材料選擇（2）花被組織）花被組織（3）生長物質(zhì)）生長物質(zhì)（4）未授粉子房在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)方式以子房直插比）未授粉子房在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)方式以子房直插比子房平方效果更好。子房平方效果更好。第六節(jié)第六節(jié) 植物離體授粉受精植物離體授粉受精一、植物離體授粉的概念和意義一、植物離體授粉的概念和意義（一）離體授粉（離體受精）：（一）離體授粉（離體受精）：離體授粉指在無菌離體授粉指在無菌條件下

23、培養(yǎng)未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌條件下培養(yǎng)未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)進入胚珠，完成受精過程。發(fā)進入胚珠，完成受精過程。因全過程從花粉萌發(fā)到精卵細胞融合形成種子，直至種子萌發(fā)產(chǎn)生幼苗均在試管內(nèi)完成，故稱為離體受精。離體受精。（二）離體授粉（離體受精）意義：（二）離體授粉（離體受精）意義：二、植物離體授粉方法二、植物離體授粉方法（一）收集花粉：（一）收集花粉：開花前數(shù)天（因不同植物而異）套袋，開花前一天或當(dāng)天取花蕾或花藥，表面消毒后，無菌條件下離體收集花粉。（二）剝?nèi)∽臃炕蚺咧椋海ǘ﹦內(nèi)∽臃炕蚺咧椋鹤瞿副镜幕ɡ僭陂_花前數(shù)天去雄并套袋，開花前一天取花蕾在實驗室進行常規(guī)表面消毒之后，在無

24、菌條件下剝?nèi)∨咧椋◣プ蚍瘢┗蜃臃颗囵B(yǎng)。（三）離體受精方法（三）離體受精方法1. 子房試管授粉子房試管授粉（1）直接引入法。無菌條件下用鋒利刀片將子房壁或子房頂端切開一個小口，把花粉懸浮液直接滴入切口后進行培養(yǎng)。（2）注射法。）注射法。用無菌注射器吸取花粉懸浮液，從子房基部或上端切口注入子房，基部切口可用凡士林封口，然后接種于培養(yǎng)基上。2. 胚珠試管授粉胚珠試管授粉 ：胚珠剝離后可從胎座上切下單個胚珠授粉，也可將帶著完整胎座或部分胎座的胚珠接種并撒播花粉。（1）哺育法。）哺育法。將胚珠表面先蘸滿有助于花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，然后撒上花粉后培養(yǎng)。（2）接近法。）接近法。將花粉預(yù)先撒于培養(yǎng)基上培養(yǎng)使之

25、萌發(fā)或不萌發(fā)，然后接種胚珠（甚至子房）培養(yǎng)三、影響離體受精的因素三、影響離體受精的因素（一）胚珠（子房）的成活率及育齡（一）胚珠（子房）的成活率及育齡胚珠（子房）離體成活率的關(guān)鍵是培養(yǎng)基成分的篩選；有的植物開花時適于受精，有的植物開花前適于受精（二）母體組織的影響（二）母體組織的影響柱頭的影響 ；胎座的影響（三）花粉萌發(fā)和花粉管生長（三）花粉萌發(fā)和花粉管生長 關(guān)鍵的因素仍然是培養(yǎng)基。往往適宜胚珠離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基不利于花粉萌發(fā)和花粉管伸長。后者需要添加鈣、硼離子。本章作業(yè)本章作業(yè) 一、名詞解釋一、名詞解釋 植物細胞全能性：植物細胞全能性： 外植體：外植體： 脫分化：脫分化： 愈傷組織：愈傷組織： 繼代培養(yǎng)：繼代培養(yǎng)： 再分化：再分化： 胚狀體（體細胞