CD40基因多態(tài)性與自身免疫性甲狀腺病的相關(guān)性

1、CD40基因多態(tài)性與自身免疫性甲狀腺病的相關(guān)性【摘要】 目的 了解CD40基因多態(tài)性在西北地區(qū)漢族人群中的分布及其與自身免疫性甲狀腺病(AITD)的相關(guān)性。方法 隨機選取本院內(nèi)分泌科門診的165例Graves病(GD)患者、113例橋本甲狀腺炎(HT)患者為研究對象，以94例健康體查者為對照。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測CD40基因5非翻譯區(qū)1位點C/T多態(tài)性(5UTR C(1)T)、第三外顯子58038位點-/T多態(tài)性；應(yīng)用擴增受阻突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)檢測第九外顯子64610位點C/G多態(tài)性。結(jié)果 5UTR C(1)T位點中CC基因型、C等位基因在GD組和對照組間有顯著差

2、異(P<0.05)；58038位點在372例樣本中均為TT型;64610位點未發(fā)現(xiàn)GG基因型。結(jié)論 西北地區(qū)漢族人CD40基因5UTR C(1)T位點上C等位基因型與GD發(fā)病有相關(guān)性，CC基因型者患GD的危險性較TT高；58038位點-/T在西北地區(qū)漢族人中無多態(tài)性；64610位點C/G在西北地區(qū)漢族人中未發(fā)現(xiàn)GG基因型。 【關(guān)鍵詞】 自身免疫性甲狀腺病 CD40基因 單核苷酸多態(tài)性ABSTRACT: Objective To investigate polymorphism of CD40 gene and its relation with autoimmune thyroi

3、d disorders (AITD) in Chinas Northwest region. Methods The study recruited 372 subjects: 165 Graves disease (GD) and 113 Hashimotos thyroiditis (HT) and 93 healthy subjects as controls. Using PCRrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) to analyze the C/T polymorphism in the 5UTR and the 58

4、038T point mutation in exon3. Using amplification refractory mutation systemPCR (ARMSPCR) to analyze the C64610G point mutation in exon9. Results There were significant differences in allele frequencies of C and genotype CC between GD group and control group in 5UTR C(1)T (P<0.05). We only fo

5、und TT gene type in 58038 T in the 372 subjects. GG gene type was not found. Conclusion The CD40 gene 5UTR C(1)T polymorphism is associated with GD and C allele appears to be a risk factor for GD in Han of Chinas Northwest region. We found no polymorphism in 58038T in Han of Chinas Northwest region.

6、 We found no GG gene type in C64610G in Han of Chinas Northwest region.KEY WORDS: autoimmune thyroid disorder; CD40 gene; single nucleotide polymorphism; polymerase chain reaction combined with restriction fragment length polymorphism; amplification refractory mutation system自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thy

7、roid disorders, AITD)主要包括Graves病(GD)、橋本甲狀腺炎(HT)及特發(fā)性黏液性水腫。自身免疫反應(yīng)為本病的中心環(huán)節(jié)，而CD40屬于正性共刺激分子，起著上調(diào)免疫反應(yīng)的作用，在AITD的發(fā)病及病情進展中起著重要作用 。國外關(guān)于CD40基因多態(tài)性與GD的關(guān)系雖有研究但結(jié)論尚有爭議，而國內(nèi)尚無報道。本文關(guān)于CD40基因58038T、C64610G位點的多態(tài)性在中國人群中的研究尚屬首次。1 對象與方法1.1 研究對象 研究對象均選自本院內(nèi)分泌科門診患者，無其他自身免疫病病史。GD組：165例，男性32例，女性133例，平均年齡(35.33±13.11)歲。根據(jù)臨床癥

8、狀、體征、甲狀腺激素水平升高、促甲狀腺素(TSH)降低、促甲狀腺激素受體抗體(TSHRAb)(+)入選。HT組：113例，男性8例，女性105例，平均年齡(35.66±12.09)歲。根據(jù)臨床癥狀、體征、甲狀腺功能測定、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)(+)入選。正常對照組：均為健康體查者，共94例，男性28例，女性66例，平均年齡(37.38±13.58)歲。選入者個人及家族無甲狀腺病史，無甲狀腺腫，檢測甲狀腺功能正常，甲狀腺自身抗體(-)。1.2 基因組DNA提取 EDTA抗凝靜脈血200L，應(yīng)用chelex100提取DNA。Chelex100購自BioRad公司。1

9、.3 CD40基因5UTR C(1)T位點PCR擴增及基因型分析1.3.1 PCR擴增 本實驗引物均由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，引物設(shè)計參照文獻1序列：上游5TGGGAATGTTCTGGGGAA3，下游5AGGCCTCTTCCCCGAA3。體系為(20L)2×Taq PCR MasterMix 10L、上下游引物各1L、模板DNA 3L，其余以滅菌雙蒸水補足。PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性5min后進入循環(huán)，94變性30s、58退火30s、72延伸45s。共30個循環(huán)。末次循環(huán)后72延伸7min。1.3.2 基因型分析 5L擴增產(chǎn)物經(jīng)Nco酶切后，80g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染確定

10、基因型。Nco內(nèi)切酶購自寶生物公司。1.4 第三外顯子58038T PCR擴增及基因型分析1.4.1 PCR擴增 引物利用生物軟件Primer premier5設(shè)計，序列為：上游引物5CCCACTCTGGAAGCTCTTCGT3，下游引物5CTGGAGCAGCAGTGTTGGAG3。體系為(20L)2×Taq PCR MasterMix 10L、上下游引物各1L、模板DNA 3L，其余以滅菌雙蒸水補足。94預(yù)變性5min后進入30個循環(huán)：94變性30s、57退火30s、72延伸45s，末次循環(huán)后72延伸7min。1.4.2 基因型分析 PCR擴增產(chǎn)物5L經(jīng)Mva酶切后，30g/L瓊脂

11、糖凝膠電泳確定基因型。Mva內(nèi)切酶購自寶生物公司。1.5 第九外顯子C64610G ARMSPCR檢測1.5.1 PCR擴增 引物利用生物軟件Primer premier5設(shè)計，序列為：上游引物5ACCTTGCCTCTCCAGGCCC3，上游引物5ACCTTGCCTCTCCAGGCCG3，下游引物5AAGCAGCTTCCAGTTGTTCACTAT3。體系為(20L)2×Taq PCR MasterMix 10L、上下游引物各1L、模板DNA 3L，其余以滅菌雙蒸水補足。94預(yù)變性5min后進入30個循環(huán)：94變性30s、68退火30s、72延伸45s。末次循環(huán)后72延伸7min。1.

12、5.2 基因型分析 PCR擴增產(chǎn)物可直接判定基因型。1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進行處理。各組間基因頻率和等位基因頻率的比較用2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 5UTR C(1)T位點的酶切結(jié)果 CD40基因5UTR C(1)T位點上有C或T堿基的變化，根據(jù)限制性內(nèi)切酶Nco酶切片斷的情況基因型有3種(圖1)：CC基因型(184bp、136bp兩條帶)、TT基因型(320bp一條帶)、CT基因型(320bp、184bp、136bp三條帶)。圖1 Nco酶切 5UTR C(1)T 位點的PCR擴增產(chǎn)物（略）Fig.1 Ide

13、ntification of 5UTR C(1)T PCR pruducts by Nco restrictionM: DNA marker; 1, 12, 13: heterozygote genotype CT; 2-11, 14: homozygote genotype CC; 15: homozygote genotype TT2.2 第三外顯子58038T位點的酶切結(jié)果 58038T位點上有缺失或T堿基的變化，根據(jù)限制性內(nèi)切酶Mva酶切片斷的情況基因型有3種：TT基因型(82bp、126bp兩條帶)、缺失基因型(208bp一條帶)、CT基因型(82bp、126bp、208bp三條帶)

14、，基因型檢測結(jié)果全部樣本為82bp、126bp兩條帶，即TT基因型(圖2)。圖2 Mva酶切58038 -/T位點的PCR擴增產(chǎn)物（略）Fig.2 Identification of 58038 -/T PCR pruducts by Mva restrictionM: DNA marker; 1-5: homozygote genotype TT2.3 第九外顯子C64610G位點的PCR結(jié)果 ARMSPCR擴增CD40基因包含C64610G位點的DNA序列，不同的上游引物可分別結(jié)合不同基因型位點，372例樣本中3例CG基因型，其余為CC基因型。1、2、5、6所示為2例CC基因型標本，3、4

15、所示為1例CG基因型(圖3)。圖3 C64610G位點的PCR擴增產(chǎn)物（略）Fig.3 PCR pruducts of C64610GM: DNA marker; 1, 2, 5, 6: homozygote genotype CC; 3, 4: heterozygote genotype CT2.4 5UTR C(1)T位點的多態(tài)性分析 GD組CC基因型頻率及C等位基因頻率顯著高于對照組(OR分別1.74、1.603，P均<0.05)。HT組CC基因型頻率及C等位基因型頻率與對照組比較基本相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。表1 正常對照組和患者組5UT

16、R C(1)T位點基因型及等位基因頻率的比較（略）Table1 Genotype distribution and allele frequency of the 5UTR C(1) T polymorphism in patients and controls*P<0.05 vs. control group. GD: Graves disease; HT: Hashimotos thyroiditis3 討論 Kim等1對韓國人的研究及Tomer等2對高加索人種的研究認為CD40基因5UTR C(1)T中CC基因型與GD相關(guān)，而Heward等3對高加索人種的研究卻顯示C等位基

17、因與GD無關(guān)。目前有關(guān)58038T、C64610G多態(tài)性與AITD的關(guān)系尚未見報道。 我們的研究結(jié)果表明，58038T位點在西北地區(qū)漢族人中未發(fā)現(xiàn)突變；C64610G位點在西北地區(qū)漢族人中未發(fā)現(xiàn)GG基因型，C、G頻率分別為0.992、0.008，無多態(tài)性，故不討論其與AITD的相關(guān)性。 在CD40基因5UTR C(1)T位點的研究中我們與Kim等人的結(jié)果一致，即C等位基因型與GD病的發(fā)病有相關(guān)性，CC基因型者患GD病的危險性較TT者高。CD40基因5UTR C(1)T位于CD40基因翻譯起始密碼子前一位上，而圍繞在起始密碼子ATG上下游的一段約6-8而個堿基序列稱為Kozak序列，其中起始密碼

18、子前的一個核苷酸序列為翻譯時核糖體結(jié)合部位，T基因變成C基因使Kozak序列發(fā)生改變，影響到基因的翻譯表達，最終影響CD40分子的表達水平，若CD40表達增多，自身免疫反應(yīng)的強度會加大。從而促使GD發(fā)病。 然而HT的發(fā)病亦以自身免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，我們的結(jié)果卻只顯示5UTR C(1)T位點多態(tài)性與GD病相關(guān)。CD40可能在兩種疾病發(fā)病中的作用強度不同，GD病主要以體液免疫為主，而HT以細胞免疫為主。根據(jù)現(xiàn)有研究，CD40在體液免疫中作用可能更為重要，CD40不僅介導(dǎo)T細胞和B細胞之間的相互作用，而且?guī)缀醣磉_于B細胞分化與發(fā)育的全過程，貫穿B細胞分化發(fā)育的各個階段。在GD病患者中CD40異常表達于甲狀腺上皮細胞，并可使甲狀腺細胞呈遞自身抗原給T細胞從而開啟自身免疫應(yīng)答；CD40及其配體的相互作用進一步促使B淋巴細胞產(chǎn)生TsAb，從而導(dǎo)致GD發(fā)病。若能再進一步研究CD40的表達水平將更有力的說明此種影響。 本研究結(jié)果支持CD40基因5UTR C(1)T多態(tài)性與GD有相關(guān)性，C等位基因者傾向發(fā)病。但是該多態(tài)性與CD40分子的生理功能方面的關(guān)系還需進一步研究；CD40基因5UTR C(1)T位點和CD40基因其他的多態(tài)性位點的關(guān)系還有待研究；CD40基因和AITD的其他相關(guān)基因的關(guān)系也將是今后研