RNA干擾對腎癌細胞端粒酶活性及增殖凋亡的影響

1、RNA干擾對腎癌細胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影響 作者：郝林,鄭駿年,李望,楊文發(fā),劉俊杰,溫儒民,陳家存,孫曉青【摘要】 目的 探討針對人端粒酶RNA（hTR）及其催化亞基（hTERT）的小干擾RNA（siRNA）對腎癌細胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影響。方法 將hTRsiRNA、hTERTsiRNA（100nmol/L）單獨或聯(lián)合轉染人腎癌7860細胞，采用RTPCR法檢測hTR、hTERT mRNA表達，TRAPELISA法檢測端粒酶活性，MTT法檢測細胞增殖，免疫組化TUNEL法檢測細胞凋亡。結果 （1）hTRsiRNA可顯著降低7860細胞hTR mRNA表達(P<0.

2、01)，hTERTsiRNA可顯著降低hTERT mRNA表達(P<0.01)，但彼此互不影響。（2）二者均能顯著抑制端粒酶活性(P<0.01，P<0.01)，并增加7860細胞增殖抑制率及凋亡細胞陽性率 (P<0.01，P<0.01)。二者聯(lián)合應用與單獨應用差異亦無顯著性(P>0.05)。結論 hTR、hTERT siRNA通過抑制各自基因表達，抑制人腎癌細胞端粒酶活性，進而抑制增殖、促進凋亡。 【關鍵詞】 腎癌；小干擾RNA；端粒酶RNA；端粒酶逆轉錄酶of Proliferation and Induct

3、ion of ApoptosisKey words：Renal neoplasm；Small interfering RNA； Human telomerase RNA；Human telomerase reverse transcriptase0 引言 端粒酶被激活導致腫瘤細胞無限增殖，抑制端粒酶活性能使腫瘤細胞無法合成端粒而凋亡，因此是腫瘤治療的理想靶點1。端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR)及端粒酶逆轉錄酶(hTERT)組成。端粒酶以hTR為模板合成端粒DNA，hTERT則是催化這一反應的唯一限速酶。RNA干擾能特異、高效阻抑靶基因表達，有望成為腫瘤基因治療的有力工具。我們應用RNA干擾技

4、術阻抑hTR、hTERT表達,觀察其對腎癌細胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影響。1材料與方法1.1材料 人腎癌透明細胞株7860由本室保存。hTRsiRNA、hTERTsiRNA、陰性對照siRNA、siRNA轉染試劑盒為美國Ambion公司產品?？俁NA提取試劑盒、RTPCR試劑盒為美國Promega公司產品。TRAPELISA端粒酶活性檢測試劑盒購自Roche公司。原位末端凋亡檢測試劑盒購自Santa Cruz公司。1.2方法1.2.1siRNA的設計、合成 由Ambition公司設計、合成針對人端粒酶hTR序列及hTERT基因顯性失活突變體區(qū)（NM003219，堿基序列位置21822200）

5、的siRNA。hTR序列如下:正義鏈： 5'UUGUCUAACCCUAACUGAGtt 3'，反義鏈3'ttAACAGAUUGGGAUUGACUC5'。hTERT序列如下:正義鏈5'CAAGGUGGAUGUGACGGGCtt3'.反義鏈3'ttGUUCCACCUACACUGCCCG5'。經基因庫檢索確認與hTR、hTERT以外的基因序列無同源性。1.2.2細胞培養(yǎng)及轉染 7860細胞于含10%FCS的RPMI1640中常規(guī)培養(yǎng)48h，按轉染試劑盒說明將hTRsiRNA、hTERTsiRNA調整到終濃度為100 nmol/L，單獨或

6、聯(lián)合加入培養(yǎng)細胞內,另以生理鹽水(空白對照)、脂質體、陰性對照siRNA作對照。培養(yǎng)24h后檢測hTR/hTERT mRNA表達及端粒酶活性，72h后檢測細胞增殖及凋亡。1.2.3RTPCR 提取總RNA，RTPCR試劑盒一步法行RTPCR反應。hTR上、下游引物序列如下：5'CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT3'， 5'CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT3'。hTERT引物：5'GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA3'，5'AATCATCCACCAAACGCAGGAGC3'。以GADPH基因作為內參

7、照。取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外照相并掃描分析，以hTR、hTERT/GADPH表達水平行半定量分析。1.2.4端粒酶活性的測定 采用端粒重復序列擴增酶聯(lián)免疫吸附(TRAPELISA) 法進行檢測,根據(jù)A=A450A690計算端粒酶活性,并計算與空白對照組比值。具體步驟按說明書進行。1.2.5MTT法檢測細胞增殖 處理后7860細胞加入MTT10l/孔(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄上清。加入二甲亞砜100l/孔，溶解甲瓚紫結晶，酶標儀570nm波長處測定吸光度A值，計算抑制率。1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡 7860細胞于玻片上固定，洗片后與Triton100共同孵育2mi

8、n，滴加TUNEL反應混合液，在濕盒中37孵化1h，PBS洗3次，二氨基聯(lián)苯染色，洗片后封片。高倍鏡下隨機計數(shù)5個視野，細胞核呈黃褐色即為陽性，計算陽性細胞百分比。2結果2.1siRNA對7860細胞hTR、hTERT mRNA表達的影響 與陰性siRNA對照組比較，hTRsiRNA組hTR mRNA水平明顯下調（P0.01），hTERT mRNA水平無明顯變化（P>0.05）。hTERTsiRNA組hTERT mRNA水平明顯下調（P0.01），hTR mRNA水平無明顯變化（P>0.05）,見表1。表1 hTRsiRNA、hTERTsiRNA對腎癌7860細胞h

9、TR、hTERT mRNA表達的影響（略）注：與陰性siRNA組比較，P0.05，*P0.012.2siRNA對7860細胞端粒酶活性的影響 hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明顯抑制端粒酶活性（P0.01），但二者比較差異無顯著性（P>0.05）。聯(lián)用組與單用組比較差異無顯著性（P>0.05）,見表2。表2hTRsiRNA、hTERTsiRNA對腎癌7860細胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影響（略）注：與陰性siRNA組比較，P0.01;三組之間兩兩比較，P0.052.3siRNA對7860細胞增殖的影響 hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明顯抑制78

10、60細胞增殖，二者比較差異無顯著性（P>0.05）。聯(lián)用組與單用組比較差異無顯著性（P>0.05）,見表2。2.4siRNA對7860細胞凋亡的影響 hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明顯促進7860細胞凋亡，二者比較差異無顯著性（P>0.05）。聯(lián)用組與單用組比較差異無顯著性（P>0.05）,見表2。3討論 端粒位于線性染色體末端，細胞每分裂一次端粒序列縮短50200bp,當縮短至臨界長度時細胞凋亡2。端粒酶是催化合成并維持端粒長度的一種核糖核蛋白,由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶催化亞基（hTERT）組成，它能以hTR為模板，

11、在hTERT催化下合成端粒,以彌補縮短的端粒3。癌細胞由于端粒酶的激活使染色體端粒維持在一定長度，一方面使細胞獲得永生，另一方面使細胞周期縮短、生長變快3。研究證實針對hTR、hTERT的反義核酸能夠通過抑制端粒酶活性，抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導凋亡1,4。Kanaya等5報道hTR、hTERT在腎癌組織的檢出率分別為80%、86%,且其表達與端粒酶活性呈正相關，而正常腎組織無hTERT表達，因此hTR、hTERT是腎癌基因治療的有效靶點。 RNA干擾是由小片斷雙鏈RNA（siRNA）介導的轉錄后基因沉默技術。siRNA進入細胞后與RNA誘導的沉默復合體(RISC)結合，并在RISC作用下特異

12、性降解靶基因mRNA，其效率比單鏈反義RNA強100倍6，因此siRNA可在體內外抑制癌基因表達，并抑制腫瘤生長7。本研究發(fā)現(xiàn)siRNA可抑制腎癌細胞hTR、hTERT基因表達，且具有高度特異性。hTR、hTERT表達抑制后，腎癌細胞端粒酶活性降低。二者抑制端粒酶活性作用相仿，聯(lián)用亦不能增強抑制作用。我們的研究結果與Kosciolek在結腸癌、宮頸癌細胞中獲得的結果一致8。 本研究還發(fā)現(xiàn)hTRsiRNA與hTERTsiRNA具有相似的抑制腎癌細胞增殖、促進凋亡作用，聯(lián)合應用也不能增加其作用。腫瘤細胞端粒酶活性下降后，通常需要數(shù)周時間，腫瘤細胞經過數(shù)代分裂使端?？s短至臨界值后才能凋亡9。但如果腫

13、瘤細胞的端粒加帽延長功能具有缺陷，腫瘤細胞也能立即出現(xiàn)增殖抑制、凋亡增加10。本研究siRNA處理后72h細胞即出現(xiàn)增殖抑制、凋亡增加，可能與7860細胞端粒加帽延長功能缺陷有關?！緟⒖嘉墨I】 1許寧，趙忠文，石愛平，等.端粒酶反義寡核苷酸對腎癌細胞端粒酶活性及其體外增殖的影響J.中華泌尿外科雜志，2000,21(6):331333.2Richard CA,Homagoun V,Christopher P.Telomeres length predicts replicative capacity of human fibroblastsJ.Proc Natl Acad Sci USA,199

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15、 Biol Int,2002,26(5):427431.5Kanaya T,Kyo S,Takakura M,et al.hTERT is a critical determinant of telomerase activity in renalcell carcinoma J.Int J Cancer,1998,78(5):539543.6Lipardi C,Wei Q,Paterson BM.RNAi as random degradative PCR:siRNA primer convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate

16、new siRNAsJ.Cell,2002,107(4):297307.7Martinez LA,Naguibneva I,Lehrmann H,et al.Synthetic small inhibiting RNAs:Efficienct tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathwaysJ.PNAS,2002,99 (23):1484914854.8Kosciolek BA,Kalantidis K,Tabler M,et al. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference J.Mol Cancer Ther,2003,2(3):217218.9Hahn WC,Stewart SA,Brooks MW,et al.Inhib