生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR是由美國(guó)科學(xué)家是由美國(guó)科學(xué)家生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)體內(nèi)體內(nèi)DNADNA的復(fù)制體系的復(fù)制體系 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)引物引物引物引物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）將耐熱）將耐熱DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。模板可行。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)循環(huán)生物化

2、學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 P2DNA聚合酶：聚合酶：Taq原料：原料：dNTP反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液輔助因子：輔助因子：Mg2+生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù) 單、雙鏈單、雙鏈DNADNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制劑、聚合酶抑制劑、DNADNA結(jié)合蛋白類(lèi)。結(jié)合蛋白類(lèi)。 DNADNA模板一般模板一般100ng /100100ng /100 L L。 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-P

3、CR技術(shù)0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配, ,反應(yīng)特異性下降。反應(yīng)特異性下降。 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降酶量增加使反應(yīng)特異性下降; ;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種四種dNTPdNTP濃度應(yīng)相等濃度應(yīng)相等 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入, ,濃度過(guò)低則降濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTPdNTP可與可與Mg2+Mg

4、2+結(jié)合結(jié)合, ,使游離的使游離的Mg2+Mg2+濃度下降濃度下降, ,影響影響DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù) Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-0.5-2.5mmol/L2.5mmol/L反應(yīng)體系。反應(yīng)體系。 Mg2+Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使?jié)舛冗^(guò)低會(huì)使TaqTaq酶活性喪失、酶活性喪失、PCRPCR產(chǎn)量下降；產(chǎn)量下降； Mg2+Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合可與負(fù)離子結(jié)合, ,所以反應(yīng)體系中所以反應(yīng)體系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等的濃度影響

5、反應(yīng)中游離的等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+Mg2+濃度。濃度。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA解鏈為單鏈解鏈為單鏈 9494， 20-30 20-30秒秒溫度由引物長(zhǎng)度和溫度由引物長(zhǎng)度和GCGC含量決定。含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合; ;降降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)70-75,70-75,一般為一般為7272 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定主要取決于模版主要取決于模版DNADNA的濃度的濃度 一般為一般為25-3525-35次次 次數(shù)過(guò)

6、多：擴(kuò)增效率降低次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低 錯(cuò)誤摻入率增加錯(cuò)誤摻入率增加生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)擴(kuò)增量達(dá)擴(kuò)增量達(dá)230230個(gè)拷貝（個(gè)拷貝（109109拷貝）拷貝）PCRPCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù) 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCRPCR反反 應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和 特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)利用利用PC

7、RPCR擴(kuò)增擴(kuò)增, ,只需要數(shù)小時(shí)只需要數(shù)小時(shí), ,就可以擴(kuò)增出就可以擴(kuò)增出 可用可用電泳法檢出的電泳法檢出的DNADNA，可用于檢測(cè)基因組中僅含數(shù)個(gè)拷，可用于檢測(cè)基因組中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。貝的模板序列。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)PCR示例示例一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)學(xué)習(xí)PCRPCR分析的原理與技術(shù)。分析的原理與技術(shù)。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)1 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段的克隆載體插入片段的克隆載體Pmd18-Pmd18-T T 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA2 2、儀器：微量移液器及吸頭、儀器：微量移液器及吸頭、PCRPCR儀及儀及PCRPCR管管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備瓊

8、脂糖凝膠電泳設(shè)備3 3、試劑：、試劑：1010X XPCRPCR 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP 10mol/L 10mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑試劑生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)1.1.按照如下體積向按照如下體積向PCRPCR管中按順序加入各試管中按順序加入各試劑劑 并混勻：并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0

9、 L 10mol/L引物2 1.0L 質(zhì)粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水補(bǔ)充至 25.0 L三、操作步驟三、操作步驟生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)2.2.按照如下體積向按照如下體積向PCRPCR管中按順序加入各試管中按順序加入各試劑劑 并混勻：并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 質(zhì)粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水補(bǔ)充至 25.0 L三、操作步驟三、操作步驟生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-PCR技術(shù)3.3.反應(yīng)完成后反應(yīng)完成后, ,將反應(yīng)液與凝膠電泳