共聚焦顯微鏡

1、共聚焦顯微鏡    從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦顯微鏡Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(dichroic mirror)，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn)上有一個(gè)帶有針孔(Pinhole)的擋板，小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個(gè) 光電倍增管(photomultiplier tube，PMT)?？梢韵胂?，探測光焦點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到

2、小孔上，會(huì)被擋板擋住。于是光度計(jì)測量的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。其意義是：通過移動(dòng)透鏡系統(tǒng)可以對一個(gè)半透明的物體進(jìn)行三維掃描。 激光掃描共聚焦顯微鏡是二十世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代的高科技產(chǎn)品，它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，把光學(xué)成像的分辨率提高了30%-40%，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+ 、PH值，膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組

3、織和細(xì)胞等，觀察研究組織切片，細(xì)胞活體的生長發(fā)育特征，研究測定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和能量轉(zhuǎn)換。能夠進(jìn)行活體細(xì)胞中離子和PH值變化研究（RATIO），神經(jīng)遞質(zhì)研究，微分干涉及熒光的斷層掃描，多重?zé)晒獾臄鄬訏呙杓爸丿B，熒光光譜分析熒光各項(xiàng)指標(biāo)定量分析熒光樣品的時(shí)間延遲掃描及動(dòng)態(tài)構(gòu)件組織與細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件，熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析，熒光原位雜交研究（FISH），細(xì)胞骨架研究，基因定位研究，原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白恢復(fù)研究（FRAP），胞間通訊研究，蛋白質(zhì)間研究，膜電位與膜流動(dòng)性等研究，完成圖像分析和三維重建等分析。 一.激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域： 涉及醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物科研、生物化學(xué)、細(xì)菌學(xué)、

4、細(xì)胞生物學(xué)、組織胚胎、食品科學(xué)、遺傳、藥理、生理、光學(xué)、病理、植物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、海洋生物學(xué)、材料學(xué)、電子科學(xué)、力學(xué)、石油地質(zhì)學(xué)、礦產(chǎn)學(xué)。 二.基本原理 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測針孔處成像，這樣得到的共聚

5、焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。 三.應(yīng)用范圍： 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析（觀察細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)，如：細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、微管、微絲、細(xì)胞橋、染色體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征；半定量免疫熒光分析）；熒光原位雜交研究；基因定位研究及三維重建分析。 1.細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化 2.生物化學(xué)：酶、核酸、FISH（熒光原位雜交）、受體分析 3.藥理學(xué)：藥物對細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué) 4.生理學(xué)：膜受體、離子通道、細(xì)胞內(nèi)離子含量、分布、動(dòng)態(tài) 5.神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞、遞質(zhì)受體、離子內(nèi)外流、神

6、經(jīng)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分布 6.微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu) 7.病理學(xué)及臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病診斷、HIV等 8.遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷 四.激光共聚焦顯微鏡在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用 A.在細(xì)胞及分子生物學(xué)中的應(yīng)用 1. 細(xì)胞、組織的三維觀察和定量測量 2. 活細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測 3. 粘附細(xì)胞的分選 4. 細(xì)胞激光顯微外科和光陷阱功能 5. 光漂白后的熒光恢復(fù) 6. 在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用 B.在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用 1. 定量熒光測定 2. 細(xì)胞內(nèi)離子的測定 3. 神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)觀察 C.在耳鼻喉

7、科學(xué)中的應(yīng)用 1. 在內(nèi)耳毛細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究上的應(yīng)用 2. 激光掃描共聚焦顯微鏡的熒光測鈣技術(shù)在內(nèi)耳毛細(xì)胞研究中的應(yīng)用 3. 激光掃描共聚焦顯微鏡在內(nèi)耳毛細(xì)胞離子通道研究上的應(yīng)用 4. 激光掃描共聚焦顯微鏡在嗅覺研究中的應(yīng)用 D.在腫瘤研究中的應(yīng)用 1. 定量免疫熒光測定 2. 細(xì)胞內(nèi)離子分析 3. 圖像分析：腫瘤細(xì)胞的二維圖像分析 4. 三維重建 E.激光掃描共聚焦顯微鏡在內(nèi)分泌領(lǐng)域的應(yīng)用 1. 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的測定 2. 免疫熒光定位及免疫細(xì)胞化學(xué)研究 3. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究：利用激光掃描共聚焦顯微鏡 F.在血液病研究中的應(yīng)用 1. 在血細(xì)胞形態(tài)及功能研究方面的應(yīng)用 2. 在細(xì)胞凋亡研究中的

8、應(yīng)用 G.在眼科研究中的應(yīng)用 1. 利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu) 2. 集合特殊的熒光染色在活體上觀察角膜外傷修復(fù)中細(xì)胞移行及成纖維細(xì)胞的出現(xiàn) 3. 利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜中視神經(jīng)細(xì)胞的分布以及神經(jīng)原的樹枝狀形態(tài) 4. 三維重建 H. 激光掃描共聚焦顯微鏡在腎臟病中的應(yīng)用 可以系統(tǒng)觀察正常人腎小球系膜細(xì)胞的斷層掃描影像及三維立體影像水平，使圖像更加清晰，從計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)可從外觀到內(nèi)在結(jié)構(gòu)，從平面到立體，從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)，從形態(tài)到功能幾個(gè)方面對系膜細(xì)胞的認(rèn)識(shí)得到提高。共聚焦顯微鏡商業(yè)化的共聚焦（共軛焦顯）顯微鏡（英語：Confocal microscope）分三類：

9、3; 共聚焦激光掃描顯微鏡（英語：Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM，LSCM）· 轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（英語：Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscopes）· 可編程序陣列顯微鏡（英語：Programmable Array Microscopes (PAM)）基本原理從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡（dichroic mirror

10、），將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn)上有一個(gè)帶有針孔（Pinhole），小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個(gè)光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）?？梢韵胂?，探測光焦點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到小孔上，會(huì)被擋板擋住。于是光度計(jì)測量的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。其意義是：通過移動(dòng)透鏡系統(tǒng)可以對一個(gè)半透明的物體進(jìn)行三維掃描。這樣的構(gòu)想，是在1953年， 美國學(xué)者馬文·明斯基提出，經(jīng)過了30年的發(fā)展，才利用激光為光源，發(fā)展出符合馬文·明斯基理想的共軛焦顯微鏡。相關(guān)應(yīng)用全內(nèi)反射螢光顯微鏡TIRF Microscope海德堡視網(wǎng)膜地形圖(

11、HRT)，以此原理對視網(wǎng)膜，特別是視盤，進(jìn)行分層的掃描，以重建視盤的三維結(jié)構(gòu)。主要用于青光眼的診斷和隨訪激光共聚焦顯微鏡的原理與應(yīng)用范圍激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和 裝置，并利用計(jì)算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統(tǒng)。把光學(xué)成像的分辨率提高了30%40%，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代的研究工具。1 激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）的原理從基本原理上講,共聚焦顯微鏡是一種現(xiàn)

12、代化的光學(xué)顯微鏡,它對普通光鏡從技術(shù)上作了以下幾點(diǎn)改進(jìn):11用激光做光源因?yàn)榧す獾膯紊苑浅：?光源波束的波長相同,從根本上消除了色差。1 2采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)當(dāng)中帶有小孔的擋板,將焦平面以外的雜散光擋住,消除了球差;并進(jìn)一步消除了色差1 3采用點(diǎn)掃描技術(shù)將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點(diǎn),用十分細(xì)小的激光束(點(diǎn)光源)逐點(diǎn)逐行掃描成像,再通過微機(jī)組合成一個(gè)整體平面的或立體的像。而傳統(tǒng)的光鏡是在場光源下一次成像的,標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到相鄰點(diǎn)的衍射光和散射光的干擾。這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的。14用計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào),并利用光電倍增管放大信號(hào)圖在共聚焦

13、顯微鏡中,計(jì)算機(jī)代替了人眼或照相機(jī)進(jìn)行觀察、攝像,得到的圖像是數(shù)字化的,可以在電腦中進(jìn)行處理,再一次提高圖像的清晰度。而且利用了光電倍增管,可以將很微弱的信號(hào)放大,靈敏度大大提高。由于綜合利用了以上技術(shù)。可以說是顯微鏡制作技術(shù)、光電技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的完美結(jié)合,是現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展的必然產(chǎn)物。2 在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用目前,一臺(tái)配置完備的在功能上已經(jīng)完全能夠取代以往的任何一種光學(xué)顯微鏡,它相當(dāng)于多種制作精良的常用光學(xué)顯微鏡的有機(jī)組合,如倒置光學(xué)顯微鏡、紫外線顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡()、微分干涉差顯微鏡()等,因此被稱為萬能顯微鏡,通過它所得到的精細(xì)圖像可使其他的顯微鏡圖像無比遜色

14、。21觀察活細(xì)胞、活組織在不損傷細(xì)胞的前提下,對活組織、活細(xì)胞進(jìn)行觀察和測量，這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程(如脫水、脫蠟、染色等);而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究。這種功能對于細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因研究尤為重要。這可以說是最大的優(yōu)勢。22 生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針,對于要檢測的成分不僅可以定位到細(xì)胞水平,還可以定位到亞細(xì)胞水平和分子水平23 動(dòng)態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時(shí)間進(jìn)行連續(xù)掃描,就可分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)、內(nèi)含、和標(biāo)記等動(dòng)力學(xué)變化。目前在這方面做得最多的是使用觀察心肌或平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣、鈉、鉀離子濃度或的動(dòng)態(tài)變化。24 數(shù)據(jù)、圖像的數(shù)字化用計(jì)算機(jī)代替了普通的照相機(jī),得到的

15、圖像是數(shù)字化的,可及時(shí)輸出或長期儲(chǔ)存,而且還可進(jìn)一步加工處理。25 定量測量首先應(yīng)用專一的熒光探針對樣品進(jìn)行染色,樣品的熒光強(qiáng)度和所測成分的含量呈正比,如果其余條件固定,通過對比各組樣品之間的熒光強(qiáng)度值,可得出特定成分的含量比。3 激光掃描共聚焦顯微鏡的使用（cAMP在體測量為例）31樣品制備311切片 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標(biāo)本無論是石蠟切片還是冰凍切片，均為越薄越好。常用的貼附劑有：多聚賴氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，瓊脂明膠cell-Tak, vectabond等。312培養(yǎng)細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞可以滿足要求，如果用購置儀器時(shí)所帶的薄底培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)則更佳313激光共

16、聚焦觀察樣品處理注意事項(xiàng)首先要盡量保持生物材料的天然狀態(tài)，避免贗像、變形和失真，因此須將生物材料做固定處理；制片必須薄而透明，才能在顯微鏡下成像，除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地觀察到結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。需長期保存的制片，還應(yīng)進(jìn)行脫水和封固。 顯微制片法一般包括切片法、整體封片法、涂片法和壓片法4類。32熒光探針的選擇熒光探針的發(fā)展非常迅速，目前僅美國Molecular Probes公司就可提供1800多種熒光探針3，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通常每項(xiàng)檢測內(nèi)容或被測物質(zhì)都有幾種或幾十種有關(guān)的或特異的熒光探針。選擇合適的熒光探針是有效地進(jìn)

17、行實(shí)驗(yàn)并獲取理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。熒光探針的選擇主要從以下幾個(gè)方面考慮：(1)現(xiàn)有儀器所采用的激光器。如我校購進(jìn)的激光掃描共聚焦顯微鏡(ACAS ULTMA312，美國Meridian公司產(chǎn)品)采用氬離子激光器，激發(fā)波長為351364nm，488nm，514nm，可激發(fā)多種熒光探針；(2)熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性。在進(jìn)行熒光定量和動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測時(shí)，要求熒光探針有較好的光穩(wěn)定性越高越好，也可通過減少激光掃描次數(shù)或降低激光強(qiáng)度的方法，來減輕光漂白的程度。但在進(jìn)行膜流動(dòng)性或細(xì)胞間通訊檢測時(shí)則需要熒光探針既有一定的光穩(wěn)定性又要有一定的光漂白性；(3)熒光的定性或定量。僅做熒光定性或僅是觀察熒光動(dòng)態(tài)變化

18、時(shí)，選擇單波長激發(fā)探針，無需制作工作曲線。做定量測量時(shí)最好選用雙波長激發(fā)比率探針，利于制定工作曲線；(4)熒光探針的特異性和毒性。盡量選用毒性小、特異性高的探針；(5)熒光探針適用的pH。大多數(shù)情況下細(xì)胞的pH在生理?xiàng)l件下，但當(dāng)pH不在此范圍時(shí)，考慮適用該環(huán)境pH的熒光探針是有必要的。同時(shí)應(yīng)注意染液自身的pH值會(huì)影響帶電荷的熒光探針與胞內(nèi)組份之間的結(jié)合，因此在染液的配備時(shí)需加以考慮。不同的熒光探針在不同標(biāo)本的效果常有差異，除綜合考慮以上因素以外，有條件者應(yīng)進(jìn)行染料的篩選，以找出最適的熒光探針。此外，許多熒光探針是疏水性的，很難或不能進(jìn)入細(xì)胞，需使用其乙酰羥甲基酯(acetoxymethyl,A

19、M)形式，也就是熒光探針與AM結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解，去掉AM后的熒光探針不僅可與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，從而能有效的發(fā)揮作用。321細(xì)胞內(nèi)游離鈣美國分子公司提供的鈣熒光探針有20多種，激光掃描共聚焦顯微鏡常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前兩者為單波長激光探針，利用其單波長激發(fā)特點(diǎn)可直接測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)變化，為鈣定性探針；后兩者為雙波長激發(fā)探針，利用其雙波長激發(fā)特點(diǎn)和比率技術(shù)，能定量細(xì)胞內(nèi)Ca2+i，為鈣定量探針322 DNA和RNA核酸的熒光探針有50多種2，

20、用于激光掃描共聚焦顯微鏡的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。323 膜電位DiBAC4(3)為最常用的膜電位熒光探針5，DiBAC4(3)為帶負(fù)電荷的陰離子慢反應(yīng)染料。該探針本身無熒光，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，測量時(shí)要求細(xì)胞浸在熒光染料中。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加即膜電位增加示細(xì)胞去極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低即膜電位降低示細(xì)胞超極化。Rhodamine 123主要用于線粒體膜電位測量6。Rhodamine123是一種親脂性陽離子熒光探針，當(dāng)線粒體膜內(nèi)側(cè)負(fù)電荷增多時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，與DiBAC4(3)的表

21、示形式相反。324 pH值常用于偏中性pH即細(xì)胞胞漿pH檢測的熒光探針有SNARF類(SNARF-1SNARF-calcein)、SNAFL類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，這些探針均為疏水性探針，需使用其AM形式。FITC-dextran則適用于pH范圍46之間7，如溶酶體pH的檢測，該探針也不能透過質(zhì)膜，但可通過細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入溶酶體，因此應(yīng)選擇分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。325 細(xì)胞內(nèi)活性氧基活性氧(active oxygen species)可影響細(xì)胞代謝，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等發(fā)生反應(yīng)，有些反應(yīng)是有害的，因此測量活性氧在毒理學(xué)研究中有一定的意義

22、。根據(jù)檢測活性氧的不同可選擇不同的熒光探針。常用熒光探針有Dichlorodihydrof-luorescein diacetate(2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、H2DCFDA)2，其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被存在的過氧化物、氫過氧化物等氧化分解為dichlorofluorescein(DCF)而產(chǎn)生熒光，其反應(yīng)靈敏到10-12mole水平，熒光強(qiáng)度與活性氧的濃度呈線性關(guān)系。326 細(xì)胞間通訊激光掃描共聚焦顯微鏡可采用熒光光漂白恢復(fù)FRAP技術(shù)檢測細(xì)胞縫隙連接通訊，該方法的原理是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力。而臨近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連

23、接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中，熒光可以逐漸恢復(fù)。由于光漂白過程是不可逆的，因此可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能。采用FRAP技術(shù)檢測細(xì)胞間通訊常用熒光探針是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基熒光乙酰乙酸、CFDA)。需用其酯化形式CFDA-AM。該技術(shù)可用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用。由于某些毒性物質(zhì)尤是促癌物可影響縫隙連接介導(dǎo)的物質(zhì)運(yùn)輸，因此該方法也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。327細(xì)胞膜流動(dòng)性采用熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)還可對細(xì)胞膜流動(dòng)

24、性進(jìn)行研究9。利用NBD-C6-HPC熒光探針標(biāo)記細(xì)胞膜磷脂，然后用高強(qiáng)度的激光束照射活細(xì)胞膜表面的某一區(qū)域(12m)，使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激光束照射該區(qū)域?？蓹z測到細(xì)胞膜上其它地方未被漂白的熒光探針流動(dòng)到漂白區(qū)域時(shí)的熒光重新分布情況。熒光恢復(fù)的速率和程度可提供有關(guān)的信息，如用于觀察細(xì)胞受體介導(dǎo)內(nèi)吞過程中膜磷脂流動(dòng)性的變化情況。NBD-C6-HPC在溫度稍高時(shí)可能會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此熒光染色和測量時(shí)應(yīng)在低于常溫的環(huán)境下進(jìn)行。328細(xì)胞結(jié)構(gòu)、受體、蛋白質(zhì)、酶等激光掃描共聚焦顯微鏡可獲得較一般普通光學(xué)顯微鏡分辨率高的細(xì)胞內(nèi)線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器圖象，同時(shí)還可動(dòng)態(tài)

25、觀察活細(xì)胞狀態(tài)下細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化情況，此外還可通過光學(xué)切片即斷層掃描技術(shù)進(jìn)行三維重建，顯示細(xì)胞器的空間關(guān)系及其變化。適用于線粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、Rhodamine 123等。高爾基復(fù)合體常用的熒光探針有NBD ceramide、BODIPY ceramide。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral red。有報(bào)道選用NBC-PC標(biāo)記細(xì)胞膜、Mitotracker標(biāo)記線粒體、Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核DNA，同時(shí)顯示細(xì)胞的三部分結(jié)構(gòu)。33 激光掃描共聚焦顯微鏡的使用331根據(jù)

26、標(biāo)本選擇的熒光探針對激發(fā)波長選擇激光器類型。332根據(jù)熒光探針的發(fā)射波長選擇相應(yīng)的濾片，K凌鏡無濾片掃描則不需要這一步。最好根據(jù)現(xiàn)有儀器配制選擇熒光探針。333根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適當(dāng)軟件。一般儀器的軟件分靜息狀態(tài)度圖像分析軟件、動(dòng)態(tài)測量軟件和特殊軟件。334按軟件要求設(shè)置有關(guān)參數(shù)，進(jìn)行觀察和分析。4 激光掃描共聚焦顯微鏡的功能激光掃描共聚焦顯微鏡的功能主要分圖像處理功能和細(xì)胞生物學(xué)功能兩個(gè)方面41 圖層處理功能411 組織光學(xué)切片：激光掃描共聚焦成像利用照明點(diǎn)與探測點(diǎn)共軛特性，可有效抑制同一焦點(diǎn)平面上非測量點(diǎn)的雜散熒光及來自樣品中非焦平面的熒光，從而獲得普通光鏡無法達(dá)到的分辨率。同時(shí)具有深度識(shí)

27、別率和縱向分辨率。它以一個(gè)微動(dòng)步進(jìn)馬達(dá)控制載物臺(tái)的升降，可以逐層獲得高反差、高分辨率、高靈敏度的二維光學(xué)橫斷面圖像，從而對活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的系列“光學(xué)切片”(Optical sectioning)，得到各個(gè)層面的信息。這種功能也被稱為“細(xì)胞CT”或“顯微CT”。412 三圖像重建：激光掃描共聚焦顯微鏡通過薄層光學(xué)切片功能，可獲得真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)過計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件，沿X、Y和Z軸或其它任意角度來觀察標(biāo)本的外形及剖面，并得到三維的立體結(jié)構(gòu)，從而能十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)觀察，并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。 §413 細(xì)胞物理會(huì)生物化學(xué)測定：激光掃描共聚焦

28、顯微鏡可進(jìn)行低光探測、活細(xì)胞定量分析和重復(fù)極佳的熒光定量分析，從而能對單細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞特異結(jié)構(gòu)的含量、組份及分布進(jìn)行定性、定量、定時(shí)及定位測定；同時(shí)還可測定分子擴(kuò)散、膜電位、氧化還原狀態(tài)和配體結(jié)合等生化反應(yīng)變化程度。另外，還可以對細(xì)胞的面積、平均熒光強(qiáng)度、積分熒光強(qiáng)度、細(xì)胞周長、形狀因子及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測定。 §414 熒光的定量、定位分析：激光掃描共聚焦顯微鏡可對單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進(jìn)行定量分析，并顯示熒光沿Z軸的強(qiáng)度變化；同時(shí)還可自動(dòng)將熒光圖像與象差圖像重疊以顯示熒光

29、在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。還可測量標(biāo)本深層的熒光分布。也適用于高靈敏度的快速熒光測定，準(zhǔn)確地監(jiān)測抗原表達(dá)、熒光原位雜交斑點(diǎn)及細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)學(xué)特性，并作定量分析415 Ca2+ 、pH及其它細(xì)胞內(nèi)離子的實(shí)時(shí)定量測定：利用Flu-3、Indo-1、Fura-Red等多種熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡能完成活細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，可對單個(gè)細(xì)胞內(nèi)各種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+和pH)的比例及動(dòng)態(tài)變化作毫秒級(jí)實(shí)時(shí)定量分析；可以定量探測胞質(zhì)中(Ca2+對腫瘤啟動(dòng)因子、化學(xué)因子、生長因子及各種激素等刺激反應(yīng)；使用熒光探針Flu-3和SNARF可同時(shí)測定Ca2+和pH值。42 細(xì)胞生物學(xué)功能421 熒光光漂泊恢復(fù)(FRAP)技術(shù)：激光掃描共聚焦顯微鏡能借助于高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，其