實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)課件

1、實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 馬馬 立立 克克 氏氏 病病瓊瓊 脂脂 擴(kuò)擴(kuò) 散散 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 雞馬立克氏病是由雞馬立克氏病是由雞 馬 立 克 氏 病 病 毒雞 馬 立 克 氏 病 病 毒（MDVMDV）引起的雞的一種）引起的雞的一種腫瘤性傳染病。臨床上以腫瘤性傳染病。臨床上以消瘦、麻痹、皮膚和內(nèi)臟消瘦、麻痹、皮膚和內(nèi)臟出現(xiàn)腫瘤為主要特征。可出現(xiàn)腫瘤為主要特征。可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是世 界 養(yǎng) 雞 業(yè) 的 主 要 疾世 界 養(yǎng) 雞 業(yè) 的 主 要 疾病之一。病之一。 雞馬立克氏病引起的劈叉姿勢(shì)實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 流行病學(xué)

2、臨床癥狀 病理組織學(xué)檢查 病毒分離鑒定 血清學(xué)試驗(yàn): 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(OIE推薦的替代試驗(yàn)方法)馬立克氏病診斷主要根據(jù)馬立克氏病診斷主要根據(jù) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)AGP可用于20日齡以上馬立克氏病雞羽髓抗原檢測(cè)和1月齡以上雞血清抗體檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 目的要求 了解瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行疾病診斷的操作和結(jié)果判定方法 儀器與材料 器材：瓊脂打孔器、微量移液器或帶膠乳頭滴管、平皿等。 試劑：馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。 實(shí)驗(yàn)類(lèi)型 單向單擴(kuò)散、單向雙擴(kuò)散、雙向單擴(kuò)散、雙向雙擴(kuò)散雙向雙擴(kuò)散 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進(jìn)行相向擴(kuò)散反應(yīng)，當(dāng)抗

3、原抗體分子相遇并達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，就會(huì)互相結(jié)合、凝集，在兩孔之間比例最合適的位置上出現(xiàn)白色沉淀帶，從而判定相應(yīng)的抗體和抗原。 可用于20日齡以上馬立克氏病雞羽髓抗原檢測(cè)和1月齡以上雞血清抗體檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖的疏散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于大分子的自由遷移；合適比例的抗原抗體結(jié)合后聚集形成沉淀；沉淀的產(chǎn)生阻止抗原抗體復(fù)合物的自由運(yùn)動(dòng)；沉淀帶一經(jīng)形成，就像一道特異性的屏障一樣，繼續(xù)擴(kuò)散而來(lái)的相同的抗原抗體，只能是沉淀帶加濃加厚，而不能再向外擴(kuò)散，但對(duì)其他抗原抗體系統(tǒng)則無(wú)屏障作用。實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)沉淀線(xiàn)的特征與位置： 1 抗原、抗體的特異

4、性和濃度 2 抗原、抗體分子的大小 3 擴(kuò)散率 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)a.如抗原抗體的濃度基本平衡時(shí)，此沉淀帶的位置主要決定 于兩者的擴(kuò)散系數(shù)。b.如果抗原過(guò)多，則沉淀帶向抗體偏移，反之亦然。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 抗原分子量抗原分子量 抗體分子量抗體分子量抗原分子量抗原分子量= =抗體分子量抗體分子量抗原分子量抗原分子量 抗體分子量抗體分子量c.實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)1%瓊脂粉瓊脂粉 封底封底 1萬(wàn)硫柳汞萬(wàn)硫柳汞水浴加熱融化水浴加熱融化實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟瓊脂平板制備瓊脂平板制備實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 雞群馬立克氏病

5、感染情況的監(jiān)測(cè)通常采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，檢測(cè)對(duì)象包括：血清中馬立克氏病病毒特異抗體或感染雞羽髓中馬立克氏病病毒抗原。其操作方法如下：1瓊脂糖平板制備 用0.01M pH7.4的PBS配制1瓊脂糖溶液，水浴加溫充分溶化后，加入培養(yǎng)皿，制成厚度約23mm厚的瓊脂糖凝膠板；置于室溫下冷卻凝固后，用7孔（梅花孔）打孔器準(zhǔn)確打孔，加熱封底。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)2檢測(cè)血清抗體時(shí)，中央孔內(nèi)滴加馬立克氏病病毒標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，周邊孔滴加待檢血清，但至少一孔加陽(yáng)性血清，抗原和血清的加入量以加滿(mǎn)而不溢出為度。樣品加畢后，將瓊脂平皿加蓋后平放于加蓋的濕盒內(nèi)，37溫箱中孵育824h，觀察并記錄結(jié)果

6、。測(cè)定抗體效價(jià)時(shí)可倍比稀釋血清，以出現(xiàn)沉淀帶的血清最大稀釋度為抗體效價(jià)。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)3檢測(cè)抗原時(shí)，中央孔加馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，周邊1、4孔加馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，周邊2、3、5、6孔加待檢羽髓浸液，即在試管內(nèi)加入12滴PBS然后將羽髓在其中擠壓而成。加樣后將瓊脂平皿置濕盒內(nèi)，于37溫箱孵育，824h內(nèi)觀察結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)1、切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現(xiàn)。2、反應(yīng)時(shí)間要適宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，沉淀線(xiàn)可解離而導(dǎo)致假 陰性、不出現(xiàn)或不清楚。 3、加樣時(shí)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿(mǎn)為度。 4、每加完不同的樣后要更換槍頭

7、，以免造成污染。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟抗原檢測(cè)抗原檢測(cè)Ab+Ag+32Ag+65檢測(cè)檢測(cè)羽髓抗原羽髓抗原2，3，5，6孔分別孔分別加入倍比稀釋的加入倍比稀釋的待檢羽髓浸液待檢羽髓浸液Ag+432165檢測(cè)檢測(cè)待檢血清待檢血清15孔分別加入倍比稀釋的孔分別加入倍比稀釋的待測(cè)效待測(cè)效價(jià)的血清，價(jià)的血清，6孔加孔加PBS抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 當(dāng)被檢樣品孔與中心孔之間形成清晰的沉淀線(xiàn)，并與周邊已知抗原孔的沉淀線(xiàn)互相融合時(shí)判為陽(yáng)性；不出現(xiàn)沉淀線(xiàn)者判為陰性 結(jié)果判定結(jié)果判定 實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 已知抗原與陽(yáng)性血清之間所產(chǎn)生的沉淀線(xiàn)末端彎向被檢樣品孔內(nèi)側(cè)時(shí)，則該被檢樣品判為弱陽(yáng)性。 結(jié)果判定結(jié)果判定 Ag+Ag+Ab+待檢血清實(shí)驗(yàn)二馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 被檢材料可能出現(xiàn)兩條以上沉淀線(xiàn)，其中一條與已知抗原和陽(yáng)性血清的沉淀線(xiàn)融合者判為陽(yáng)性。當(dāng)抗原存在多種成分時(shí)，將呈現(xiàn)多條沉淀線(xiàn)以至交叉反應(yīng)線(xiàn)，因此可用來(lái)檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度，比較抗原之間的異同點(diǎn)，因而應(yīng)用范圍較廣。標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原待檢羽髓浸液待檢羽髓浸液 結(jié)果判定結(jié)果判定 實(shí)驗(yàn)二