高通量藥物篩選課件

1、高通量藥物篩選高通量藥物篩選高通量藥物篩選高通量藥物篩選高通量藥物篩選 高通量藥物篩選（high throughput screening，HTS），是指用現(xiàn)代科技手段，對可能作為藥用的物質進行大規(guī)模的生物活性檢測，從而尋找出具有藥用價值的物質，為新藥的開發(fā)研究奠定基礎。高通量藥物篩選高通量藥物篩選的形成 高通量藥物篩選是20世紀80年代后期發(fā)展起來的高新技術。它主要由生物高通量和藥物篩選結合而成。所謂的高通量就是以新的藥物作為靶點，對藥物的作用進行研究；而藥物篩選可以簡略的解釋為重復性實驗操作。 高通量藥物篩選的出現(xiàn)，使藥物篩選逐步實現(xiàn)規(guī)模化、自動化和集成化，具有篩選速度快，所需樣品用量少的

2、特點。高通量藥物篩選傳統(tǒng)藥物篩選高通量藥物篩選藥物作用分子靶點藥物篩選活性化合物作用機制研究組織、器官水平研究藥效學研究疾病相關動物模型研究人類疾病相關動物模型藥物篩選發(fā)現(xiàn)有效藥物活性化合物藥效學研究組織器官水平研究作用機制研究分子細胞水平研究藥物開發(fā)研究高通量藥物篩選高通量篩選與組合化學 組合化學應用組合合成的方法，可以在短時間內合成出含有102106個化合物的化學庫，為高通量藥物篩選提供了物質基礎。 高通量藥物篩選高通量篩選與組合化學 組合化學實現(xiàn)了組合庫的虛擬化，從而可以根據合成目標，獲得一個虛擬組合庫。然后通過相關軟件，從虛擬組合庫中篩選出，可能實現(xiàn)的、符合目標要求的藥物化學式，這就得

3、到了實驗組合庫。 通過對虛擬組合庫的優(yōu)化，可以大大減少實驗組合庫的藥物數(shù)量，這為我們節(jié)省了大量的時間和資源。高通量藥物篩選新藥的發(fā)現(xiàn)過程：合成化合物，純化，鑒定結構，1. 進行生物活性的測定。高通量藥物篩選 傳統(tǒng)合成方法是要逐一合成，這種方法效率低、速度慢、成本高、周期長。 高通量篩藥物選利用組合合成方法同時和成大量化合物，然后通過生物高通量方法，對大量化合物進行高速、高效、低成本、微量化的篩選，并促進了許多新的生物活性評價方法。高通量藥物篩選高通量篩選生物活性評價方法：組合化學樣品的準備藥理活性評價細胞毒性評價藥代動力學評價高信息篩選技術高通量藥物篩選組合化學樣品的準備：樣品登記稱量稀釋轉運

4、標記具體操作：樣品登記時涉及樣品名稱、理化性質、測試目的等內容，樣品入庫后稱取一定量并用相應的溶劑（常用而甲基亞砜）溶解后作為母液共篩選用，然后經過稀釋制備工作液，實驗室一般工作液分布在96孔板上，每板可以分布80個樣品，剩余16個孔作為篩選時設置各種對照。一般母液經過2次100倍稀釋后即可作為工作液供篩選使用。高通量藥物篩選2.藥理活性評價靶點的選擇 受體結合分析法、酶活性測定法、細胞活性因子測定法、代謝物質測定法、細胞活性測定法等。藥理活性結果評價 陽性率法、活性指標法、陽性藥標準。 高通量藥物篩選 對于同一結構類型、具有活性的化學樣品，應將該類化合物作為一組樣品，選取活性較好的樣品進行進

5、一步研究，并分析其構效關系。 對于毒性較大的化學樣品，就要比較其最小有效濃度和最低毒性濃度差距，然后判斷其藥用價值。 高通量藥物篩選 對于結構類型完全不同的化學樣品，通過活性綜合分析，判斷樣品的藥理作用的選擇性。若該樣品只在特定模型中表現(xiàn)活性，且選擇性較好，則具有特定方面的開發(fā)價值；若在多種模型上都表現(xiàn)活性，則需通過綜合資料分析其是否具有藥用價值，然后再做進一步藥理價值研究。高通量藥物篩選3.細胞毒性評價 細胞毒性終點包括細胞吸附、遷移、凋亡、分裂、分化和壞死等。因細胞的生長抑制具有較好的毒性預測性，常選擇單一來源的細胞進行高通量細胞毒性篩選作為毒性的初篩。 細胞毒性檢測方法有：化學染料法、M

6、TT法、LDH法、放射性核素標記法、熒光法、化學發(fā)光法、生物發(fā)光檢測法。高通量藥物篩選4.藥代動力學評價 這是一種通過建立研究候選化合物吸收、分布和代謝的體外篩選模型，根據藥理學、毒理學和藥動學篩選結果反饋來指導下一步的合成或改造。 目前常用的模型有：肝切片、培養(yǎng)的肝細胞、亞細胞部分如S9及肝微粒體等。高通量藥物篩選5.高信息篩選技術 高信息篩選技術是指通過軟件（常用ArrayscanTM和ImageProTM）獲得高分辨率的圖像，從而獲得單個細胞、細胞器和細胞內藥靶的多方位信息。圖像一般可以反映多種細胞毒性的指征：細胞密度、溶解后pH、細胞形態(tài)、核形態(tài)和膜通透性等。高通量藥物篩選高通量篩選常

7、用分析技術熒光分析法放射性分析技術比色技術發(fā)光檢測技術核磁共振技術高通量藥物篩選熒光分析法 熒光分析法的特點：靈敏度高、易于檢測、實驗條件簡單、可以實現(xiàn)篩選體系的微量化等。高通量藥物篩選熒光分析法包括:熒光強度分析法均相時間分辨熒光法（ HTRF ）極化熒光法（FP）熒光共振能量傳遞分析法（FRET）時間分辨熒光能量傳遞分析法（TRET）熒光關聯(lián)光譜法（FCS）高通量藥物篩選 熒光強度分析法原理：許多分子帶有天然熒光基團，當待測大分子本身的熒光團不夠強烈而無法檢測時，可結合一些熒光染料以加強其光譜特征，然后根據其熒光強度的變化進行檢測。高通量藥物篩選時間分辨熒光分析 原理：利用激發(fā)波長、發(fā)射波

8、長和熒光壽命的變化，對物質進行檢測。 該方法具有靈敏度高、無放射性危害、標記物穩(wěn)定、線性范圍寬、分析速度快和操作簡便等優(yōu)點，受到廣大藥物篩選工作者的關注。高通量藥物篩選熒光極化（熒光偏振）原理：當處于激發(fā)期的可自由運動的熒光團分子，被平面極化的光激發(fā)，使其發(fā)射到一個固定平面，分子間的旋轉碰撞導致發(fā)射光平面與激發(fā)光平面產生差別，導致極化值變化，從而進行檢測。適用于：酶催化水解的檢測、蛋白質互相作用、DNA診斷、生物膜的流動性變化、高通量篩選。高通量藥物篩選熒光共振能量傳遞分析法原理：在合適的能量供體和能量受體分子間，提供一定的條件，即當供體激發(fā)態(tài)能量滿足光學和空間上的要求時，能量就會有效轉移給受

9、體，通過記錄能量轉移接受體的接收時間來進行檢測。高通量藥物篩選時間分辨能量傳遞分析方法原理：常范圍能量傳遞在熒光鑭復合物和共振能力安防受體之間。優(yōu)點：受體長期存活和受體信號的時間通過減少背景具有高的靈敏度，無需對試劑進行特殊處理、檢測或沉淀。適用于檢測大量天然產物。高通量藥物篩選 放射性分析技術，主要應用于檢測RNA轉錄，測定P56激酶活性，對氨基乙?；痶RNAd進行測定以及肝炎C病毒NS3蛋白酶抑制劑的藥物篩選等方面。 比色技術，用于檢測具有吸收性質的物質濃度，根據光線經過被檢物質后被吸收的多少，來評價吸收物質的含量。是目前應用最廣泛的一向檢測法。高通量藥物篩選 核磁共振技術，通過改變碰撞能，測定復合體解離時的能量，測得配體的親和力。在應用于NMR研究小分子化合物與生物大分子相互作用時具有明顯優(yōu)勢。發(fā)光檢測技術，有些生物和化學物質可以在一定條件下進行化學反應，產生發(fā)光現(xiàn)象，根據這些發(fā)光反應產生的光線強弱，判斷反應的進行程度。高通量藥物篩選高通量藥物篩選的基本步驟：高通量藥物篩選模型的建立操作程序的編制帶篩樣品的準備篩選的實施數(shù)據分析高通量藥物篩選藥物發(fā)現(xiàn)的基本過程初篩和復篩（分子、細胞水平）深入篩選（綜合分析獲得先導化合物）確證篩選（確定開發(fā)前景并進行臨床研究）高通量藥物篩選高通量藥物篩選的前景 高通量藥物篩選只經過十余年的實踐檢驗，在藥理