熒光共振能量轉(zhuǎn)移FERT

1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET陳同生J華南師范大學(xué)信點(diǎn)光電子科技學(xué)院丿包翁電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)。分子能級(jí)與熒光子的I1J能狀態(tài)是個(gè)連續(xù)的,大此各狀態(tài)對(duì)卅能螢tt顯賣(mài)的2熒光(Fluorescence)：當(dāng)處于基態(tài)的分子吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即返回基態(tài)并以 光*J形式釋放能量，這種光稱(chēng)為熒光。4.3磷光(Phosphorescence):分子從激發(fā)三線(xiàn)態(tài)返回基態(tài)以光的形式釋放能量。 '敷發(fā)(Excitation, Ex)和發(fā)射(Emission, Em)光譜(Spectra):Fluorescence SpectraStoker ShiftCy3熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象1 供

2、體(Donor, D)2. 受體(Acceptor, A)3. FRET現(xiàn)象的特征：選擇性激發(fā)供體,卻能檢測(cè)到受體發(fā)射的熒光Em. 470nmDonorEm. 535nmCFPEx. 470nmAcceptorEx. 440nmFRET 原理(Principle)Acceptor (YFP)Don orf luoresice-nce!FRETfluor-esc-ence2、1 -E= 代/?o+7?6局:&50%時(shí)供體和受體分子間的距離.對(duì)于特定 的供體受體對(duì)是常數(shù)；R：供體和受體分子間的距離.E: FRET效率.對(duì)于用寺別靈破450500 550600 九(nm)3、供體分子的發(fā)射態(tài)

3、偶極矩與受體分 子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量 必須滿(mǎn)足一定的條件1X)NORACCEPTOREnergy Transfer EfficiencyE=!rj屮Rg1=50% transfer efficiency distance3nm7nmuSpect roscopic Ruler*00 A.© © Jk1、供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收 光譜必須有顯著的重迭，一般大于30%； 供體分子和受體分子間的距離必須在10 run之間.D和A間的FRET效率:通過(guò)FRET技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個(gè)蛋白分子之間相互作用的空間信息。 常用于解決如下問(wèn)題：1）蛋白分子的共定位;2）蛋白

4、分子聚合體；3）轉(zhuǎn)錄機(jī)制；4）轉(zhuǎn)換途徑；5）分子運(yùn)動(dòng);6）蛋白折疊等生物學(xué)問(wèn)題.FRET技術(shù)應(yīng)用一:檢測(cè)兩個(gè)發(fā)光分子間的重合與共定LaserLaser利用FRET技術(shù)檢測(cè)不發(fā)光分子間相互作用的策略AcceptorLabe led Protei nsFRET技術(shù)應(yīng)用二:檢測(cè)分子間的相互作用IntermohcularFRETProtein A Protein BProtein-protein complexProtein A Protein BProtein-protein complexLaserProtein A Protein BProtein-protein complexFRET技術(shù)應(yīng)用

5、三:檢測(cè)分子的折疊與構(gòu)象變FRET技術(shù)應(yīng)用舉例：細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的實(shí)時(shí)測(cè)量490 nm(b)Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887在FRET實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的/4-t /-Jr- TT7 /-Jr-d±T %|/ / Dye)供體-支1耶災(zāi)尤分十河FITC-Rhodam i neAl exa488Cy3Cy3-Cy5 綠色熒光蛋白類(lèi)(reen luorescent roteins, 3FPs)BFP-GFPBFP-YFPCFP-YFPCFP-dsREDGFP-dsRED參考閱讀文獻(xiàn)1. Jonathan D. Violin,et al.

6、, A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899-9092. Elizabeth A J et 1., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-13953.4.5.6.Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of

7、live cell protein localizations. J Cell Biology. 2003, 160: 629-633Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 9& 14997-15002Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal, 2003,85:599-611Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy Current Biology 2000,10: