實驗1 細菌的培養(yǎng)方法

1、 細菌的培養(yǎng)方法細菌的培養(yǎng)方法（綜合性實驗）（綜合性實驗）1. 1. 實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則2 2錄相：細菌標本的采集和細菌的接種方法錄相：細菌標本的采集和細菌的接種方法3 3操作：操作： 細菌的接種法細菌的接種法 （液體、半固體、固體（液體、半固體、固體 1 1套套/3/3人）人） 空氣中細菌的檢查空氣中細菌的檢查 （沉降法（沉降法 血平板血平板 1 1塊塊/6/6人）人） 呼吸道細菌的檢查呼吸道細菌的檢查 （咳碟培養(yǎng)（咳碟培養(yǎng) 血平板血平板 1 1塊塊/3/3人）人） 隨身物品的細菌檢查隨身物品的細菌檢查 （普通平板（普通平板 1 1塊塊/3/3人）人）4. 4. 材料：材料： 大腸桿菌斜面

2、培養(yǎng)物大腸桿菌斜面培養(yǎng)物 （1 1支支/6/6人）人） 碘酒、碘酒、75%75%酒精、棉簽等酒精、棉簽等 （1 1套套/6/6人）人） 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容教學目標教學目標了解：了解： 培養(yǎng)基的類型與制備方法；細菌菌落的觀察培養(yǎng)基的類型與制備方法；細菌菌落的觀察 常用的細菌接種方法和各種細菌的培養(yǎng)方法常用的細菌接種方法和各種細菌的培養(yǎng)方法掌握：掌握： 1. 1. 細菌的液體、半固體、固體接種細菌的液體、半固體、固體接種 2. 2. 空氣中細菌的檢查方法空氣中細菌的檢查方法沉降法沉降法 3. 3. 呼吸道細菌的檢查法呼吸道細菌的檢查法咳碟法咳碟法 4. 4. 隨身物品的細菌檢查方法隨身物品的細菌檢查

3、方法實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則1. 1. 穿白大褂，盡量少帶物件進實驗室。穿白大褂，盡量少帶物件進實驗室。2. 2. 嚴格按老師及教材要求進行實驗，以獲得正確結(jié)果。嚴格按老師及教材要求進行實驗，以獲得正確結(jié)果。3. 3. 書、筆記本、筆等文具放入實驗臺抽屜里。書、筆記本、筆等文具放入實驗臺抽屜里。4. 4. 嚴禁在實驗室喝水，吃東西，用嘴咬筆或標簽，不嚴禁在實驗室喝水，吃東西，用嘴咬筆或標簽，不要用手撫摸頭、臉等部位，以免發(fā)生感染。要用手撫摸頭、臉等部位，以免發(fā)生感染。 微生物學實驗的對象多為病原微生物，如有不慎微生物學實驗的對象多為病原微生物，如有不慎就會發(fā)生實驗室感染。就會發(fā)生實驗室感染。5.

4、5. 實驗室不得高聲喧嘩，保持安靜，守秩序，不要隨便走實驗室不得高聲喧嘩，保持安靜，守秩序，不要隨便走動，以免影響他人實驗和安全。動，以免影響他人實驗和安全。6. 6. 如果發(fā)生實驗室不慎，吸入菌液、劃破手指、培養(yǎng)物破如果發(fā)生實驗室不慎，吸入菌液、劃破手指、培養(yǎng)物破損傳染物外溢，應(yīng)及時報告，及時處理。損傳染物外溢，應(yīng)及時報告，及時處理。7. 7. 實驗過程中應(yīng)注意節(jié)約實驗材料、愛護儀器，損壞器材實驗過程中應(yīng)注意節(jié)約實驗材料、愛護儀器，損壞器材要及時報告、登記、并作相應(yīng)的賠償。實驗室內(nèi)物品，要及時報告、登記、并作相應(yīng)的賠償。實驗室內(nèi)物品，未經(jīng)老師許可，嚴禁帶出室外。未經(jīng)老師許可，嚴禁帶出室外。8

5、. 8. 每次實驗之后，所用物品放回原處。需要培養(yǎng)或消毒處每次實驗之后，所用物品放回原處。需要培養(yǎng)或消毒處理的物品及時送到指定地點，用過的涂菌載玻片放入小理的物品及時送到指定地點，用過的涂菌載玻片放入小桶內(nèi)，不得亂丟亂放。桶內(nèi)，不得亂丟亂放。9. 9. 實驗完畢，整理桌面，肥皂洗手，值日生打掃實驗室衛(wèi)實驗完畢，整理桌面，肥皂洗手，值日生打掃實驗室衛(wèi)生，關(guān)好水電門窗，待老師檢查后方可離開。生，關(guān)好水電門窗，待老師檢查后方可離開。 細菌和其它生物一樣，大多數(shù)屬異養(yǎng)菌，必須細菌和其它生物一樣，大多數(shù)屬異養(yǎng)菌，必須從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)，進行新陳代謝及生長繁殖從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)，進行新陳代謝及生長繁殖

6、等生命活動。等生命活動。 人為地提供細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)（適人為地提供細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)（適宜的培養(yǎng)基）和創(chuàng)造適合細菌生長繁殖的有利條件宜的培養(yǎng)基）和創(chuàng)造適合細菌生長繁殖的有利條件如溫度、濕度、氣體等，能使細菌在體外迅速生長如溫度、濕度、氣體等，能使細菌在體外迅速生長繁殖。繁殖。細菌的人工培養(yǎng)細菌的人工培養(yǎng)細菌生長繁殖的條件：細菌生長繁殖的條件：1 1充足的營養(yǎng)物質(zhì)充足的營養(yǎng)物質(zhì)2 2適宜的溫度適宜的溫度3 3合適的酸堿度（合適的酸堿度（pHpH）4 4必要的氣體環(huán)境必要的氣體環(huán)境一、細菌生長繁殖所需營養(yǎng)一、細菌生長繁殖所需營養(yǎng) 1 1水水 營養(yǎng)的吸收與代謝均需有水才能進行。營養(yǎng)

7、的吸收與代謝均需有水才能進行。2 2碳源碳源 病原菌主要從糖類獲得碳及能量。病原菌主要從糖類獲得碳及能量。 4 4無機鹽無機鹽 常用元素如磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣、鐵等常用元素如磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣、鐵等3 3氮源氮源 其主要功能是作為菌體成分的原料。其主要功能是作為菌體成分的原料。5 5生長因子生長因子 某些細菌生長所必需而又不能自身合成的有某些細菌生長所必需而又不能自身合成的有機化合物。機化合物。（一）培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基（culture mediumculture medium） 由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。使用的混

8、合營養(yǎng)物制品。 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備（1 1）按用途劃分）按用途劃分1 1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基）基礎(chǔ)培養(yǎng)基含多數(shù)細菌生長所需要的最基本營養(yǎng)，能滿足一含多數(shù)細菌生長所需要的最基本營養(yǎng)，能滿足一般細菌生長繁殖的營養(yǎng)需要，如肉湯（含有水、般細菌生長繁殖的營養(yǎng)需要，如肉湯（含有水、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等原料）。牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等原料）。2 2）營養(yǎng)培養(yǎng)基）營養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、酵母浸膏等。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、酵母浸膏等。1 1、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用3 3）鑒別培養(yǎng)基）鑒別培養(yǎng)基4 4）選擇培養(yǎng)基）選擇培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入一定底物和指示劑，而不同種

9、類的細在培養(yǎng)基中加入一定底物和指示劑，而不同種類的細菌由于分解代謝及合成代謝能力的不同，會產(chǎn)生不同的特菌由于分解代謝及合成代謝能力的不同，會產(chǎn)生不同的特征性培養(yǎng)結(jié)果，從而將不同細菌區(qū)分開來的培養(yǎng)基征性培養(yǎng)結(jié)果，從而將不同細菌區(qū)分開來的培養(yǎng)基。 在培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)或化學物質(zhì)，使在培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)或化學物質(zhì)，使之能抑制一些細菌生長，而有利于另一些細菌生長，從而之能抑制一些細菌生長，而有利于另一些細菌生長，從而將后者從混雜的細菌群體中分離出來的培養(yǎng)基。將后者從混雜的細菌群體中分離出來的培養(yǎng)基。SSSS瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基 大腸埃希菌大腸埃希菌沙門菌沙門菌志賀菌志賀菌5 5

10、）厭氧培養(yǎng)基）厭氧培養(yǎng)基 用于培養(yǎng)厭氧性細菌的培養(yǎng)基，此時需要在培用于培養(yǎng)厭氧性細菌的培養(yǎng)基，此時需要在培養(yǎng)基中加入還原劑降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，厭養(yǎng)基中加入還原劑降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，厭氧菌才能生長發(fā)育。氧菌才能生長發(fā)育。 u 皰肉培養(yǎng)基皰肉培養(yǎng)基 不飽和脂肪酸和谷胱甘肽不飽和脂肪酸和谷胱甘肽（2 2）根據(jù)物理狀態(tài)分）根據(jù)物理狀態(tài)分液體培養(yǎng)基：增菌液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為1.51.5）：）：分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.5%0.5%）：）：動力檢查動力檢查 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基

11、半固體培養(yǎng)基 l嗜冷菌（嗜冷菌（1 10-200-20）l嗜溫菌（嗜溫菌（20-4020-40）：絕大多數(shù)病原菌：絕大多數(shù)病原菌l嗜熱菌嗜熱菌（50-6050-60）二、適宜的溫度二、適宜的溫度 嗜中性菌（嗜中性菌（pH 6.0-8.0pH 6.0-8.0） 嗜酸性菌（嗜酸性菌（pH 5.5pH 8.5pH 8.5） 多數(shù)病原菌最適酸堿度為多數(shù)病原菌最適酸堿度為pH 7.2-7.6pH 7.2-7.6 霍亂弧菌耐堿霍亂弧菌耐堿(pH 8.4-9.2)(pH 8.4-9.2) 結(jié)核分枝桿菌耐酸結(jié)核分枝桿菌耐酸(pH 6.5-6.8)(pH 6.5-6.8)三、適宜的酸堿度（三、適宜的酸堿度（pH

12、pH）氧和二氧化碳氧和二氧化碳1 1、按細菌對氧的需求可分為四種類型、按細菌對氧的需求可分為四種類型：u 專性需氧菌（專性需氧菌（obligate aerobeobligate aerobe）u 兼性厭氧菌（兼性厭氧菌（facultative anaerobefacultative anaerobe）u 微需氧菌（微需氧菌（microaerophilic bacteriummicroaerophilic bacterium）u 專性厭氧菌（專性厭氧菌（obligate anaerobeobligate anaerobe）四、適宜的氣體環(huán)境四、適宜的氣體環(huán)境2、細菌的二氧化碳培養(yǎng)法、細菌的二氧化

13、碳培養(yǎng)法燭缸法燭缸法二氧化碳孵箱二氧化碳孵箱 某些細菌（腦膜炎雙球菌、淋球雙球菌、布氏桿某些細菌（腦膜炎雙球菌、淋球雙球菌、布氏桿菌等少數(shù)細菌）的生長，需在孵育時加入菌等少數(shù)細菌）的生長，需在孵育時加入5-10% CO5-10% CO2 2示教示教1. 1. 細菌的接種法：液體、半固體、固體培養(yǎng)基細菌的接種法：液體、半固體、固體培養(yǎng)基2. 2. 空氣中細菌的檢查（沉降法，血平板）空氣中細菌的檢查（沉降法，血平板）3. 3. 呼吸道細菌的檢查（咳碟培養(yǎng)，血平板）呼吸道細菌的檢查（咳碟培養(yǎng)，血平板）4. 4. 隨身物品細菌檢查（普通平板）隨身物品細菌檢查（普通平板）操作內(nèi)容操作內(nèi)容 細菌的分離接種

14、是人工分離培養(yǎng)細菌的重要步細菌的分離接種是人工分離培養(yǎng)細菌的重要步驟，是微生物學的基本技術(shù)之一，其目的是從含多驟，是微生物學的基本技術(shù)之一，其目的是從含多種細菌的患者標本中分離出單一病原菌，從而可以種細菌的患者標本中分離出單一病原菌，從而可以進行感染性疾病的病原學診斷。進行感染性疾病的病原學診斷。 同時，在細菌學的研究，生物制品如疫苗、類同時，在細菌學的研究，生物制品如疫苗、類毒素、抗毒素和免疫血清等的制備，基因工程及工毒素、抗毒素和免疫血清等的制備，基因工程及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面，人工培養(yǎng)分離細菌，都有著極為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面，人工培養(yǎng)分離細菌，都有著極為重要的意義。重要的意義。 操作一操作一 細菌

15、的接種法細菌的接種法瓊脂平板劃線分離接種法（固體培養(yǎng)基）瓊脂平板劃線分離接種法（固體培養(yǎng)基） 劃線法劃線法 斜面培養(yǎng)基接種法（蛇形劃線法）斜面培養(yǎng)基接種法（蛇形劃線法）半固體培養(yǎng)基接種法（半固體培養(yǎng)基接種法（穿刺法穿刺法）液體培養(yǎng)基接種法（乳磨法）液體培養(yǎng)基接種法（乳磨法） 接種時要注意無菌操作，避免污染，也要防止細菌接種時要注意無菌操作，避免污染，也要防止細菌外溢污染環(huán)境。外溢污染環(huán)境。細菌的分離接種方法細菌的分離接種方法固體平板培養(yǎng)基的劃線接種固體平板培養(yǎng)基的劃線接種三線法三線法劃線接種手法劃線接種手法平板劃線接種的結(jié)果平板劃線接種的結(jié)果菌落觀察菌落觀察1 1固體平板培養(yǎng)結(jié)果觀察固體平板培

16、養(yǎng)結(jié)果觀察 單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面生長、單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面生長、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見的有一定繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見的有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌集團，稱為菌落（形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌集團，稱為菌落（colonycolony）。）。 菌落特征是鑒別細菌的重要依據(jù)之一。菌落特征是鑒別細菌的重要依據(jù)之一。肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌奇異變形桿菌奇異變形桿菌菌落形態(tài)菌落形態(tài)鏈球菌鏈球菌斜面培養(yǎng)基接種斜面培養(yǎng)基接種蛇形劃線蛇形劃線半固體培養(yǎng)基的穿刺接種及結(jié)果觀察半固體培養(yǎng)基的穿刺接種及結(jié)果觀察液體培養(yǎng)基的乳磨接種手法液體培養(yǎng)基的乳磨接種手法液體培養(yǎng)結(jié)果觀察液體培養(yǎng)結(jié)果觀察表面生

17、長表面生長 沉淀生長沉淀生長 混濁生長混濁生長 空氣中沒有營養(yǎng)物質(zhì)，且受日光中紫外線的作空氣中沒有營養(yǎng)物質(zhì)，且受日光中紫外線的作用，細菌一般不能繁殖。然而，土壤中有大量的細用，細菌一般不能繁殖。然而，土壤中有大量的細菌存在，可隨塵埃散布到空氣中；寄生在人和動物菌存在，可隨塵埃散布到空氣中；寄生在人和動物呼吸道及消化道中的細菌也能通過各種途徑散布到呼吸道及消化道中的細菌也能通過各種途徑散布到空氣中，使得空氣中也有一定量的細菌存在。空氣中，使得空氣中也有一定量的細菌存在。 空氣中細菌的數(shù)量和種類隨地區(qū)、季節(jié)和人口空氣中細菌的數(shù)量和種類隨地區(qū)、季節(jié)和人口密度的不同而不同。通常，可測定單位體積空氣中密

18、度的不同而不同。通常，可測定單位體積空氣中所含細菌的數(shù)量來評價空氣的污染程度。所含細菌的數(shù)量來評價空氣的污染程度。操作二操作二 空氣中細菌的檢查空氣中細菌的檢查 沉降法沉降法是利用含有細菌的塵?；驓馊苣z粒因重是利用含有細菌的塵?；驓馊苣z粒因重力作用自然下降到培養(yǎng)基表面，通過細菌培養(yǎng)，計力作用自然下降到培養(yǎng)基表面，通過細菌培養(yǎng)，計數(shù)菌落數(shù)，粗略評估空氣中細菌含量。數(shù)菌落數(shù)，粗略評估空氣中細菌含量。 沉降法沉降法簡單易行，缺點是不夠準確。但它客觀簡單易行，缺點是不夠準確。但它客觀地反映了空氣污染的程度和衛(wèi)生通風狀況，對手術(shù)地反映了空氣污染的程度和衛(wèi)生通風狀況，對手術(shù)室、食品業(yè)等有重要的參考意義，是

19、判斷空氣污染室、食品業(yè)等有重要的參考意義，是判斷空氣污染的指標之一。的指標之一。操作：操作：將血平板打開蓋，放到教室的四個角上，將血平板打開蓋，放到教室的四個角上，靜止靜止1515分鐘后，合上蓋送分鐘后，合上蓋送3737孵箱培養(yǎng)。孵箱培養(yǎng)。 據(jù)推算，據(jù)推算，每每100cm100cm培養(yǎng)基在空氣中暴露培養(yǎng)基在空氣中暴露5min5min，其表面接受自然沉降的細菌數(shù)約相當于其表面接受自然沉降的細菌數(shù)約相當于1010升空氣中升空氣中所含的細菌量。所含的細菌量。那么，暴露于空氣中那么，暴露于空氣中15min15min應(yīng)相當應(yīng)相當于于3030升，所以，升，所以，每每m m空氣中活菌數(shù)空氣中活菌數(shù)= =（1

20、00 cm100 cm培養(yǎng)培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)基上菌落平均數(shù)/30/30）x1000 x1000注意：注意：計數(shù)菌落時，兩個或幾個菌落邊緣有重疊者，均計數(shù)菌落時，兩個或幾個菌落邊緣有重疊者，均分別計算為兩個或幾個。分別計算為兩個或幾個。 人體呼吸道與外界相通，常常有不同種類的細人體呼吸道與外界相通，常常有不同種類的細菌存在。其中，菌存在。其中，1/41/4為需氧菌，為需氧菌，3/43/4為厭氧菌。這些為厭氧菌。這些細菌常是條件致病菌，在一般情況下并不致病。有細菌常是條件致病菌，在一般情況下并不致病。有時，正常人的呼吸道中也有致病菌的存在，如肺炎時，正常人的呼吸道中也有致病菌的存在，如肺炎球菌、腦

21、膜炎球菌、乙型鏈球菌、流感桿菌等，是球菌、腦膜炎球菌、乙型鏈球菌、流感桿菌等，是引起疾病傳播的一個重要因素。引起疾病傳播的一個重要因素。 由于寄居人體的關(guān)系，這些細菌對營養(yǎng)的要求由于寄居人體的關(guān)系，這些細菌對營養(yǎng)的要求較高，常需要用含較高，常需要用含血液成分的培養(yǎng)基血液成分的培養(yǎng)基進行分離。進行分離。操作三操作三 呼吸道細菌的檢查呼吸道細菌的檢查咳碟試驗咳碟試驗操作方法：操作方法： 打開血平板，將平板置于口腔前約打開血平板，將平板置于口腔前約15cm15cm處，處，對準培養(yǎng)基表面用力咳嗽對準培養(yǎng)基表面用力咳嗽3 34 4次，然后蓋好平板次，然后蓋好平板蓋，放置于蓋，放置于3737孵箱內(nèi)培養(yǎng)孵箱內(nèi)培養(yǎng)2424小時后觀察結(jié)果。小時后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：結(jié)果判斷： 平板上可有不同的菌落長出，觀察菌落的形平板