《天然藥物分析》4章TLC

1、1 中藥中藥( (天然藥物天然藥物) )分析分析 第四章第四章色譜分析法的應(yīng)用2 色譜法（色譜法（Chromatography）是一種物理或物理）是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。形成氣相色譜、液相色譜、化學(xué)的分離分析方法。形成氣相色譜、液相色譜、薄層色譜、離子色譜、親和色譜、超臨界流體色譜、薄層色譜、離子色譜、親和色譜、超臨界流體色譜、毛細(xì)管電泳、電色譜等分支。各種色譜儀器與質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳、電色譜等分支。各種色譜儀器與質(zhì)譜、紅外、核磁等技術(shù)聯(lián)用創(chuàng)立了復(fù)雜混合物分析的新紅外、核磁等技術(shù)聯(lián)用創(chuàng)立了復(fù)雜混合物分析的新手段，成為發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的分析方法之一。手段，成為發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的分析

2、方法之一。 由于色譜分析具有分離與由于色譜分析具有分離與“在線在線”分析兩種功能，分析兩種功能，能很好的排除組分間的相互干擾，逐個將組分進(jìn)行能很好的排除組分間的相互干擾，逐個將組分進(jìn)行定性、定量分析，還能制備純成分，因此在藥物分定性、定量分析，還能制備純成分，因此在藥物分析中，特別是中藥材、中成藥、復(fù)方制劑分析、痕析中，特別是中藥材、中成藥、復(fù)方制劑分析、痕量分析、雜質(zhì)檢查、藥材鑒別時，一般首選色譜分量分析、雜質(zhì)檢查、藥材鑒別時，一般首選色譜分析法。各國藥典都大量收載色譜法就是很好的證明。析法。各國藥典都大量收載色譜法就是很好的證明。 3l 分離原理主要是利用物質(zhì)在流動相與固定分離原理主要是利

3、用物質(zhì)在流動相與固定相兩相中的分配系數(shù)差異、吸附與解吸差異相兩相中的分配系數(shù)差異、吸附與解吸差異或其他差異而被分離?；蚱渌町惗环蛛x。l 當(dāng)兩相相對運(yùn)動時，樣品中的各組分將在當(dāng)兩相相對運(yùn)動時，樣品中的各組分將在兩相中多次分配（可達(dá)兩相中多次分配（可達(dá)2000100萬次），這萬次），這樣就使得原來那種微小的性質(zhì)差異，產(chǎn)生很樣就使得原來那種微小的性質(zhì)差異，產(chǎn)生很大的分離效果，分配系數(shù)大的組分遷移速度大的分離效果，分配系數(shù)大的組分遷移速度慢，反之分配系數(shù)小的組分遷移速度快而被慢，反之分配系數(shù)小的組分遷移速度快而被分離。分離。l 色譜法主要是一種分離技術(shù)，基礎(chǔ)是色譜法主要是一種分離技術(shù)，基礎(chǔ)是“差差

4、速遷移速遷移”。 4 第一節(jié)第一節(jié) 色譜法的分類與色譜法的分類與 柱色譜法、紙色譜法的應(yīng)用柱色譜法、紙色譜法的應(yīng)用 l 一色譜法的分類一色譜法的分類l 1按兩相所處的狀態(tài)分類按兩相所處的狀態(tài)分類l （1）氣相色譜法（）氣相色譜法（gas chromatography，GC）；）；l （2）液相色譜法（）液相色譜法（liquid chromatography，LC）;l （3）超臨界流體色譜法（）超臨界流體色譜法（supercripical fluid chromatograph，SFC）。）。 5l2按操作方法分類按操作方法分類l （1）柱色譜法（）柱色譜法（column chromatogr

5、aphy）l （2）紙色譜法（）紙色譜法（paper chromatography）l （3）薄層色譜法（）薄層色譜法（thin-layer chromatography） l 紙色譜法和薄層色譜法亦稱為平面色譜法（紙色譜法和薄層色譜法亦稱為平面色譜法（planar chromatography）63按分離原理分類按分離原理分類 l （1）吸附色譜法（）吸附色譜法（adsorption chromatography）利用吸附）利用吸附劑表面對不同組分物理吸附性能的差別而使之分離的色譜法稱劑表面對不同組分物理吸附性能的差別而使之分離的色譜法稱為吸附色譜法。吸附色譜有為吸附色譜法。吸附色譜有GSC

6、和和LSC等。等。l （2）分配色譜法（）分配色譜法（partition chromatography）利用固定液）利用固定液對不同組分分配性能的差異而使之分離的色譜法稱為分配色譜對不同組分分配性能的差異而使之分離的色譜法稱為分配色譜法。分配色譜法有法。分配色譜法有GLC和和LLC等。等。 l （3）離子交換色譜法（）離子交換色譜法（ion exchange chromatography，IEC） 是用離子交換樹脂作固定相，利用樹脂上離子交換基團(tuán)是用離子交換樹脂作固定相，利用樹脂上離子交換基團(tuán)對樣品離子交換能力的差別而使之分離的色譜法稱為離子交換對樣品離子交換能力的差別而使之分離的色譜法稱為離

7、子交換色譜法。色譜法。l （4）尺寸排阻色譜法（）尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC） 用多孔凝膠作固定相，利用凝膠孔穴對不同尺寸的分用多孔凝膠作固定相，利用凝膠孔穴對不同尺寸的分子排阻效應(yīng)的差別使之分離的色譜法稱為尺寸排阻色譜法。子排阻效應(yīng)的差別使之分離的色譜法稱為尺寸排阻色譜法。 7l （5）親和色譜法（）親和色譜法（affinity chromatography）用具有生物活）用具有生物活性的配位基（如抗體、酶等）鍵合到非活性載體或基質(zhì)表面構(gòu)性的配位基（如抗體、酶等）鍵合到非活性載體或基質(zhì)表面構(gòu)成固定相，利用生物分子與固定相表面上配位基的專

8、屬親和力成固定相，利用生物分子與固定相表面上配位基的專屬親和力使之分離的色譜法稱為親和色譜法。使之分離的色譜法稱為親和色譜法。l （6）毛細(xì)管電泳法（）毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）樣品）樣品在毛細(xì)管的液體介質(zhì)中，在電場力作用下的分離分析方法稱為在毛細(xì)管的液體介質(zhì)中，在電場力作用下的分離分析方法稱為毛細(xì)管電泳法。毛細(xì)管電泳法。l （7）毛細(xì)管電色譜法（）毛細(xì)管電色譜法（capillary electro- chromatography，CEC）分離機(jī)制是靠色譜與電場兩種作用力，依據(jù)樣品組分的）分離機(jī)制是靠色譜與電場兩種作用力，依據(jù)樣品組分的分配系數(shù)及電

9、泳速度的差別使之分離的色譜法稱為毛細(xì)管電色分配系數(shù)及電泳速度的差別使之分離的色譜法稱為毛細(xì)管電色譜法。譜法。 8二柱色譜法的應(yīng)用二柱色譜法的應(yīng)用 l 2.洗脫劑的選擇洗脫劑的選擇 所用溶劑的吸附力應(yīng)較弱，一般石油醚、苯、氯仿等為弱洗所用溶劑的吸附力應(yīng)較弱，一般石油醚、苯、氯仿等為弱洗脫劑；乙醚、異丙醚為中等強(qiáng)度的洗脫劑；低分子量醇及酮為脫劑；乙醚、異丙醚為中等強(qiáng)度的洗脫劑；低分子量醇及酮為強(qiáng)洗脫劑。強(qiáng)洗脫劑。l 對未知樣品的洗脫，常先試用石油醚、石油醚對未知樣品的洗脫，常先試用石油醚、石油醚-苯不同比例苯不同比例的混合液、苯、苯的混合液、苯、苯-乙醚混合液、乙醚、乙醚乙醚混合液、乙醚、乙醚-甲

10、醇混合液及甲甲醇混合液及甲醇等。物質(zhì)被洗脫出的先后順序一般是：飽和烴、烯烴、雙烯醇等。物質(zhì)被洗脫出的先后順序一般是：飽和烴、烯烴、雙烯烴、芳烴、醚、酯、酮、醇及羧酸。烴、芳烴、醚、酯、酮、醇及羧酸。l 3.吸附劑應(yīng)具備的條件吸附劑應(yīng)具備的條件l （1）能可逆地吸附待分離的物質(zhì)；）能可逆地吸附待分離的物質(zhì)；l （2）不會引起被吸附物質(zhì)的化學(xué)變化；）不會引起被吸附物質(zhì)的化學(xué)變化；l （3）吸附劑的粒度適當(dāng)，能使洗脫劑以一定速率流出）吸附劑的粒度適當(dāng)，能使洗脫劑以一定速率流出（56ml/min）。）。9常用吸附劑的種類l （1）硅膠）硅膠l （2）氧化鋁）氧化鋁l （3）大孔樹脂）大孔樹脂l （4）

11、硅藻土）硅藻土l （5）Sephadex LH 20l （6）C-18,C-810l 色層的分離色層的分離l 可以采用推出法和洗脫法。色帶的檢出可以采用可以采用推出法和洗脫法。色帶的檢出可以采用直觀（有色物質(zhì)）、紫外光照射，采用含熒光素的直觀（有色物質(zhì)）、紫外光照射，采用含熒光素的吸附劑，用顯色劑顯色。吸附劑，用顯色劑顯色。l 大孔樹脂大孔樹脂l 分離中藥水溶性成分的優(yōu)勢：分離中藥水溶性成分的優(yōu)勢：l （1）吸附容量大、選擇性好；）吸附容量大、選擇性好；l （2）再生簡單，可重復(fù)使用；）再生簡單，可重復(fù)使用；11三紙色譜法的應(yīng)用三紙色譜法的應(yīng)用 l R 值的定義值的定義 （Rst）l 影響影響

12、R 值的因素：值的因素：l 如色譜層析條件中的流動相組成，展開時的溫度，如色譜層析條件中的流動相組成，展開時的溫度，流動相蒸氣的飽和程度等，都將影響物質(zhì)的流動相蒸氣的飽和程度等，都將影響物質(zhì)的R 值。值。l 而決定物質(zhì)在一定的色譜條件時的而決定物質(zhì)在一定的色譜條件時的R 值，主要是值，主要是物質(zhì)本身的極性。一般來說，化合物極性大（或親物質(zhì)本身的極性。一般來說，化合物極性大（或親水性強(qiáng)）在水中分配量就多，在紙色譜上水性強(qiáng)）在水中分配量就多，在紙色譜上R 值就小。值就小。相反親脂性強(qiáng)的化合物，在紙色譜中的相反親脂性強(qiáng)的化合物，在紙色譜中的R 值就大。值就大。 12第二節(jié)第二節(jié) 薄層色譜法的應(yīng)用薄層

13、色譜法的應(yīng)用 l 目前薄層色譜法已進(jìn)入分離高效化、定量儀器化、數(shù)據(jù)處理目前薄層色譜法已進(jìn)入分離高效化、定量儀器化、數(shù)據(jù)處理自動化階段，與氣相色譜法、高效液相色譜法并列為三種最常自動化階段，與氣相色譜法、高效液相色譜法并列為三種最常用的色譜分析方法。用的色譜分析方法。l l 吸附薄層的分離原理是將吸附薄層的分離原理是將A、B兩組分的混合試樣溶液，點(diǎn)兩組分的混合試樣溶液，點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中，用適當(dāng)?shù)恼归_劑在薄層板的一端，在密閉的容器中，用適當(dāng)?shù)恼归_劑（developer）展開。此時）展開。此時A、B組分不斷地被吸附劑所吸附，組分不斷地被吸附劑所吸附，又被展開劑所溶解而解吸，且隨之向前

14、移動。由于吸附劑對又被展開劑所溶解而解吸，且隨之向前移動。由于吸附劑對A、B具有不同的吸附能力，展開劑對具有不同的吸附能力，展開劑對A、B也有不同的溶解、解吸也有不同的溶解、解吸能力，因此當(dāng)展開劑不斷展開，能力，因此當(dāng)展開劑不斷展開，A、B會在吸附劑和展開劑之會在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸附，從而產(chǎn)生差速遷移得到分離。間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸附，從而產(chǎn)生差速遷移得到分離。l l 13l 薄層色譜的優(yōu)點(diǎn)是：薄層色譜的優(yōu)點(diǎn)是：l （1）設(shè)備簡單；）設(shè)備簡單；l （2）展開時間短；）展開時間短；l （3）分離效果好；）分離效果好；l （4）顯色方便，也可噴灑腐蝕性顯色劑、）顯色方便

15、，也可噴灑腐蝕性顯色劑、加熱等；加熱等；l （5）靈敏度高。）靈敏度高。 14薄層色譜法按分離機(jī)理分類可有五種形式薄層色譜法按分離機(jī)理分類可有五種形式l （1）吸附薄層色譜；常用硅膠、硅藻土、氧化鋁為）吸附薄層色譜；常用硅膠、硅藻土、氧化鋁為吸附劑；吸附劑；l （2）分配薄層色譜；常用纖維素、硅藻土、或硅膠）分配薄層色譜；常用纖維素、硅藻土、或硅膠為載體，在載體上吸附一定量的水或其它溶劑（如為載體，在載體上吸附一定量的水或其它溶劑（如緩沖液、酸溶液、甲酰胺、丙二醇等）為固定相，緩沖液、酸溶液、甲酰胺、丙二醇等）為固定相，另以與固定相不相混溶（或部分混溶）的展開劑作另以與固定相不相混溶（或部分混

16、溶）的展開劑作為流動相。為流動相。l （3）離子交換薄層色譜：用離子交換劑制作薄層。）離子交換薄層色譜：用離子交換劑制作薄層。l （4）排阻薄層色譜：用葡聚糖凝膠制作薄層。當(dāng)展）排阻薄層色譜：用葡聚糖凝膠制作薄層。當(dāng)展開劑流過薄層時，混合組分按分子大小的不同，在開劑流過薄層時，混合組分按分子大小的不同，在葡聚糖凝膠薄層上反復(fù)進(jìn)行擴(kuò)散和排阻，從而使混葡聚糖凝膠薄層上反復(fù)進(jìn)行擴(kuò)散和排阻，從而使混合物達(dá)到分離。合物達(dá)到分離。l （5）親和色譜。）親和色譜。15l 應(yīng)用最廣泛的是吸附薄層色譜，主要是利用應(yīng)用最廣泛的是吸附薄層色譜，主要是利用吸附過程的兩個規(guī)律：吸附過程的兩個規(guī)律：l （1）吸附是可逆的

17、、吸附與解吸附處于一）吸附是可逆的、吸附與解吸附處于一個動態(tài)平衡中；個動態(tài)平衡中；l （2）吸附劑對不同物質(zhì)的吸附行為有差異。）吸附劑對不同物質(zhì)的吸附行為有差異。l 主要的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺等。主要的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺等。被吸附物與吸附劑之間的作用力包括色散力、被吸附物與吸附劑之間的作用力包括色散力、靜電力、誘導(dǎo)力和氫鍵作用力等。靜電力、誘導(dǎo)力和氫鍵作用力等。l 強(qiáng)弱順序是：強(qiáng)弱順序是：l 氫鍵作用力氫鍵作用力靜電力靜電力誘導(dǎo)力誘導(dǎo)力色散力色散力16l 含單官能團(tuán)的化合物與硅膠或氧化鋁親和力大小次序：含單官能團(tuán)的化合物與硅膠或氧化鋁親和力大小次序：l 羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛

18、、酮腈、叔胺、硝基化合羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛、酮腈、叔胺、硝基化合物醚烯鹵化烴烷物醚烯鹵化烴烷l （1）分子中雙鍵數(shù)目增加，吸附力也增大，特別是當(dāng)雙鍵處）分子中雙鍵數(shù)目增加，吸附力也增大，特別是當(dāng)雙鍵處于共軛時更是如此；芳環(huán)的影響比雙鍵大；于共軛時更是如此；芳環(huán)的影響比雙鍵大；l （2）芳香化合物隨著環(huán)的數(shù)目增加，吸附力增大；）芳香化合物隨著環(huán)的數(shù)目增加，吸附力增大；l （3）同系物中分子量愈大，吸附力也愈強(qiáng)。）同系物中分子量愈大，吸附力也愈強(qiáng)。l （4）分子中極性官能團(tuán)數(shù)目增大，一般情況下吸附力增加，）分子中極性官能團(tuán)數(shù)目增大，一般情況下吸附力增加，但是若兩個官能團(tuán)處于鄰位，能發(fā)生分子內(nèi)氫鍵

19、締合時，則它但是若兩個官能團(tuán)處于鄰位，能發(fā)生分子內(nèi)氫鍵締合時，則它們與吸附劑形成氫鍵的能力削弱。們與吸附劑形成氫鍵的能力削弱。l 在薄層色譜中，就是憑借上述基本概念來選擇吸附劑、展開在薄層色譜中，就是憑借上述基本概念來選擇吸附劑、展開劑和估定劑和估定R值順序的。值順序的。 17一薄層色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)一薄層色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù) l （一）吸附劑的選擇（一）吸附劑的選擇 在薄層色譜中吸附劑與展開劑的選擇，是色譜分離能否獲得在薄層色譜中吸附劑與展開劑的選擇，是色譜分離能否獲得成功的關(guān)鍵。成功的關(guān)鍵。 l 1.硅膠略帶酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，商品硅膠分為硅膠略帶酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，商品硅膠分為

20、兩類：硅膠兩類：硅膠H（不加石膏），硅膠（不加石膏），硅膠G（加石膏）；（加石膏）；l 2.氧化鋁略帶堿性，適用于分離堿性和中性物質(zhì)；氧化鋁略帶堿性，適用于分離堿性和中性物質(zhì)；l 3.聚酰胺多用于分離黃酮類成分。聚酰胺多用于分離黃酮類成分。l 應(yīng)該根據(jù)被分離物質(zhì)的極性大小來選擇吸附活度合適的吸附應(yīng)該根據(jù)被分離物質(zhì)的極性大小來選擇吸附活度合適的吸附劑，對極性小的試樣可選擇吸附活性較高的吸附劑，對極性大劑，對極性小的試樣可選擇吸附活性較高的吸附劑，對極性大的試樣，選擇活度較低的吸附劑。的試樣，選擇活度較低的吸附劑。 l 吸附劑的活化主要是通過一定溫度烘烤，除去顆粒中的水分吸附劑的活化主要是通過一定

21、溫度烘烤，除去顆粒中的水分 18l 吸附劑的粒度大小，對層析速度、分離效果及吸附劑的粒度大小，對層析速度、分離效果及R 值均有明顯影響，顆粒太大，則其總面積相對減小值均有明顯影響，顆粒太大，則其總面積相對減小 ，吸附量降低，展開速度快，層析后組分的斑點(diǎn)擴(kuò)散，吸附量降低，展開速度快，層析后組分的斑點(diǎn)擴(kuò)散，使分離效果變差。顆粒較小，層析速度較慢，但顆使分離效果變差。顆粒較小，層析速度較慢，但顆粒太小，不易于干法鋪板，一般顆粒以粒太小，不易于干法鋪板，一般顆粒以150200目目比較合適，濕法鋪板以比較合適，濕法鋪板以250300目為好。目為好。l 根據(jù)薄層分離的需要，還可制成酸性，堿性或根據(jù)薄層分離

22、的需要，還可制成酸性，堿性或pH緩沖薄層和熒光薄層等。緩沖薄層和熒光薄層等。 19（二）薄層板的制備（二）薄層板的制備 l 1干法干法l l 2濕法濕法 l 常用粘合劑有煅石膏、羧甲基纖維素鈉（常用粘合劑有煅石膏、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和淀粉。煅石膏用量一般為吸附劑的和淀粉。煅石膏用量一般為吸附劑的10 % 20 %；CMC-Na溶液一般配成溶液一般配成0.3 % 1.0 %；淀粉為；淀粉為5 % ，可用于鋪制不同需求的薄層板。鋪好的薄層板在室可用于鋪制不同需求的薄層板。鋪好的薄層板在室溫下晾干后，再入烘箱內(nèi)活化溫下晾干后，再入烘箱內(nèi)活化 20（三）上樣方式（三）上樣方式 l 樣品溶于

23、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，如甲醇、乙醇、樣品溶于易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮等，盡量不用水，否則會降低吸附劑活氯仿、丙酮等，盡量不用水，否則會降低吸附劑活性。用毛細(xì)管、微量注射器、微量點(diǎn)樣器（定量毛性。用毛細(xì)管、微量注射器、微量點(diǎn)樣器（定量毛細(xì)管）、微量吸管等將樣品液滴加在薄層板上，注細(xì)管）、微量吸管等將樣品液滴加在薄層板上，注意展開劑不能浸過起始線。意展開劑不能浸過起始線。l 接觸上樣接觸上樣 l TAS法法 21（四）展開（四）展開 l 1.展開劑的基本要求展開劑的基本要求l 1）能使待測組分很好的溶解）能使待測組分很好的溶解l 2）使待測組分與雜質(zhì)分開，而待測各組分之間能達(dá)）使

24、待測組分與雜質(zhì)分開，而待測各組分之間能達(dá)到基線分離，到基線分離，R1.5l 3）使展開后的組分斑點(diǎn)圓而集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象）使展開后的組分斑點(diǎn)圓而集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象l 4）使待測組分的）使待測組分的Rf值最好在值最好在0.4 0.6；組分多，也；組分多，也可在可在0.2 0.8之間之間l 5）混合溶劑應(yīng)臨時新配，一般只能使用一次）混合溶劑應(yīng)臨時新配，一般只能使用一次l a.低沸點(diǎn)的溶劑容易揮發(fā)低沸點(diǎn)的溶劑容易揮發(fā)l b.極性大的溶劑優(yōu)先被吸附劑吸附，使比例變小極性大的溶劑優(yōu)先被吸附劑吸附，使比例變小l c.在第一次展開后，吸附劑的雜質(zhì)可能被帶入在第一次展開后，吸附劑的雜質(zhì)可能被帶入22l 6

25、）與組分能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或在某些吸附劑上能聚合）與組分能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或在某些吸附劑上能聚合的溶劑不宜用的溶劑不宜用l 有些有機(jī)溶劑含有少量或微量雜質(zhì)，會影響色譜有些有機(jī)溶劑含有少量或微量雜質(zhì)，會影響色譜行為行為l 7）具有適中的沸點(diǎn)和小的粘度）具有適中的沸點(diǎn)和小的粘度23l2展開劑的選擇展開劑的選擇l 在吸附薄層色譜中，理想的分離是得到一在吸附薄層色譜中，理想的分離是得到一組組Rf值在值在0.2 0.8之間的清晰斑點(diǎn)。展開劑之間的清晰斑點(diǎn)。展開劑的極性愈大，則對同一化合物的洗脫能力也的極性愈大，則對同一化合物的洗脫能力也愈大，愈大，Rf值增加。若發(fā)現(xiàn)值增加。若發(fā)現(xiàn)Rf值太小時，可改值太小時，可改

26、用一種極性較大的展開劑，或在原來展開劑用一種極性較大的展開劑，或在原來展開劑中加入一定量另一種極性較大的溶劑。中加入一定量另一種極性較大的溶劑。l 選擇展開劑時一般要考慮吸附活度、被分選擇展開劑時一般要考慮吸附活度、被分離化合物的極性及溶劑的極性這三者的關(guān)系。離化合物的極性及溶劑的極性這三者的關(guān)系。l 24l 選擇展開劑有兩個原則：選擇展開劑有兩個原則：l （1 1）展開劑對被分離物質(zhì)應(yīng)有一定的解吸）展開劑對被分離物質(zhì)應(yīng)有一定的解吸能力，但又不能太大。一般展開劑極性應(yīng)比能力，但又不能太大。一般展開劑極性應(yīng)比被分離物質(zhì)極性略小。被分離物質(zhì)極性略小。l （2 2）展開劑應(yīng)對被分離物質(zhì)有一定的溶解）

27、展開劑應(yīng)對被分離物質(zhì)有一定的溶解度，如被分離的物質(zhì)不能溶解于展開劑中，度，如被分離的物質(zhì)不能溶解于展開劑中，就不能隨展開劑向前移動。就不能隨展開劑向前移動。25l 在硅膠薄層上展開劑洗脫能力遞增順序?yàn)椋涸诠枘z薄層上展開劑洗脫能力遞增順序?yàn)椋簂 石油醚石油醚 四氯化碳四氯化碳 苯苯 氯仿氯仿 二氯甲烷二氯甲烷 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 丙酮丙酮 乙腈乙腈 甲醇。甲醇。l 在氧化鋁薄層上展開劑洗脫能力順序?yàn)椋涸谘趸X薄層上展開劑洗脫能力順序?yàn)椋簂 異辛烷異辛烷 石油醚石油醚 環(huán)己烷環(huán)己烷 四氯化碳四氯化碳 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 二氧甲烷二氧甲烷 二氧乙烷二氧乙烷 丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯

28、乙腈乙腈 異丙醇異丙醇 正丙醇正丙醇 乙醇乙醇 甲醇甲醇 乙酸。乙酸。l 實(shí)際工作中常用兩種或兩種以上混合溶劑作展開劑，有利于實(shí)際工作中常用兩種或兩種以上混合溶劑作展開劑，有利于調(diào)配展開劑的極性。調(diào)配展開劑的極性。l “基礎(chǔ)溶劑基礎(chǔ)溶劑” 、“洗脫溶劑洗脫溶劑”26l 聚酰胺薄層色譜是一種特殊形式的吸附色譜聚酰胺薄層色譜是一種特殊形式的吸附色譜l l 聚酰胺與被分離物質(zhì)形成氫鍵的能力不但決定于樣品成分本聚酰胺與被分離物質(zhì)形成氫鍵的能力不但決定于樣品成分本身，也與溶劑介質(zhì)有關(guān)，一般吸附劑在水中形成氫鍵能力最強(qiáng)，身，也與溶劑介質(zhì)有關(guān)，一般吸附劑在水中形成氫鍵能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中形成氫鍵的能力較弱

29、，在酰胺類中形成氫鍵的能在有機(jī)溶劑中形成氫鍵的能力較弱，在酰胺類中形成氫鍵的能力最弱，力最弱，l 各類展開劑洗脫能力大小的順序大致為：水乙醇甲醇各類展開劑洗脫能力大小的順序大致為：水乙醇甲醇丙酮稀丙酮稀NH4OH（NaOH）溶劑甲酰胺。也可用混合溶劑展）溶劑甲酰胺。也可用混合溶劑展開，如水開，如水- 乙醇（：乙醇（：1）；水）；水- 甲醇（：甲醇（：1）等。）等。 l 3. 展開方式展開方式27（五）顯色（五）顯色l 1. 顯色方式顯色方式l 1）蒸氣顯色）蒸氣顯色 2）噴霧顯色）噴霧顯色 3）紫外光燈顯色）紫外光燈顯色l 2. 顯色劑的種類顯色劑的種類l 1）通用顯色劑）通用顯色劑l A.

30、碘碘l B. 碳化試劑碳化試劑l C. 磷鉬酸磷鉬酸l D. 三氯化銻或五氯化銻三氯化銻或五氯化銻l E. 水水l 2）專屬性顯色劑）專屬性顯色劑28二二. 薄層掃描法薄層掃描法 l （一）測定原理（一）測定原理l 薄層掃描儀的單色光透過薄層板上的斑點(diǎn)，此時部薄層掃描儀的單色光透過薄層板上的斑點(diǎn)，此時部分單色光被斑點(diǎn)吸收，使透射光的強(qiáng)度減弱，通過分單色光被斑點(diǎn)吸收，使透射光的強(qiáng)度減弱，通過直接測量透射光的強(qiáng)度來測定的方法稱為透射法。直接測量透射光的強(qiáng)度來測定的方法稱為透射法。l 而使單色光從薄層板上的斑點(diǎn)表面反射出來，此時而使單色光從薄層板上的斑點(diǎn)表面反射出來，此時部分單色光被斑點(diǎn)吸收，使反射

31、光的強(qiáng)度減弱，通部分單色光被斑點(diǎn)吸收，使反射光的強(qiáng)度減弱，通過直接測量反射光的強(qiáng)度來測定的方法則稱為反射過直接測量反射光的強(qiáng)度來測定的方法則稱為反射法。法。l 若利用兩束不同波長的單色光若利用兩束不同波長的單色光S和和 R交替照射交替照射在同一位置上，測定其吸收值差在同一位置上，測定其吸收值差A(yù)來計算樣品含量來計算樣品含量的方法稱為雙波長測定法。的方法稱為雙波長測定法。 29（二）測量方法（二）測量方法 l 1透射法透射法 l 一般薄層用的玻璃板，能吸收一般薄層用的玻璃板，能吸收200300nm波長的光，因此應(yīng)波長的光，因此應(yīng)采用石英板制備薄層，或只用于測定可見光區(qū)域采用石英板制備薄層，或只用

32、于測定可見光區(qū)域（300700nm）。）。l 2反射法反射法 l 反射法測量時，薄層厚度對測定結(jié)果的影響較透射法為小，反射法測量時，薄層厚度對測定結(jié)果的影響較透射法為小，但薄層表面狀況影響較大。但薄層表面狀況影響較大。l 3熒光法熒光法l 是以能激發(fā)熒光的物質(zhì)為對象，基線穩(wěn)定，峰面積與濃度在是以能激發(fā)熒光的物質(zhì)為對象，基線穩(wěn)定，峰面積與濃度在比較大的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系比較大的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系 l 若化合物本身無熒光，但含有與熒光試劑反應(yīng)的官能基團(tuán)，若化合物本身無熒光，但含有與熒光試劑反應(yīng)的官能基團(tuán)，經(jīng)熒光基團(tuán)處理后可生成熒光化合物也可用熒光法測定；經(jīng)熒光基團(tuán)處理后可生成熒光化合物也可用熒光法測定

33、；l 對無熒光化合物也可采用熒光熄滅法對無熒光化合物也可采用熒光熄滅法 l 30（三）光源的選擇（三）光源的選擇 l 1可見光可見光l 薄層展開后的斑點(diǎn)本身有顏色，或噴以顯色劑使斑點(diǎn)顯色，薄層展開后的斑點(diǎn)本身有顏色，或噴以顯色劑使斑點(diǎn)顯色，斑點(diǎn)的吸收曲線在可見光區(qū)。以鎢燈為光源。斑點(diǎn)的吸收曲線在可見光區(qū)。以鎢燈為光源。l 2紫外光紫外光l 薄層斑點(diǎn)中的物質(zhì)對紫外光有吸收，用紫外光掃描。這樣可薄層斑點(diǎn)中的物質(zhì)對紫外光有吸收，用紫外光掃描。這樣可不經(jīng)顯色，避免了顯色引起的誤差，方法簡便，靈敏度高。但不經(jīng)顯色，避免了顯色引起的誤差，方法簡便，靈敏度高。但只適用于反射法。只適用于反射法。l 值得注意的

34、是，化合物斑點(diǎn)在薄層上的值得注意的是，化合物斑點(diǎn)在薄層上的 max與其在溶液中與其在溶液中的可能不同。以氘燈為光源。的可能不同。以氘燈為光源。l 3熒光熒光l 利用在紫外光下物質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生熒光強(qiáng)弱來測定化合物含量。利用在紫外光下物質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生熒光強(qiáng)弱來測定化合物含量。一般以高壓汞燈或氙燈為光源。一般以高壓汞燈或氙燈為光源。31（四）掃描方式（四）掃描方式 l 1線性掃描線性掃描 線性掃描對斑點(diǎn)的要求高，最好是理想的圓形斑線性掃描對斑點(diǎn)的要求高，最好是理想的圓形斑點(diǎn)，濃度分布成同心圓狀。點(diǎn)，濃度分布成同心圓狀。l 這樣掃描得到的輪廓曲線可成對稱的峰形，同時這樣掃描得到的輪廓曲線可成對稱的峰形，同

35、時要求狹縫光束的長度必須大于斑點(diǎn)的直徑，且光束要求狹縫光束的長度必須大于斑點(diǎn)的直徑，且光束的中心與斑點(diǎn)的中心在一條線上。的中心與斑點(diǎn)的中心在一條線上。l 2鋸齒形掃描鋸齒形掃描l 鋸齒掃描的優(yōu)點(diǎn)是對于非對稱性斑點(diǎn)從不同方向鋸齒掃描的優(yōu)點(diǎn)是對于非對稱性斑點(diǎn)從不同方向掃描所的積分值相似，且精密度比線性掃描高。掃描所的積分值相似，且精密度比線性掃描高。 l 32三薄層色譜定性分析三薄層色譜定性分析 l （一）薄層色譜定性分析（以（一）薄層色譜定性分析（以Rf值為基準(zhǔn)）值為基準(zhǔn)）l 薄層色譜中的薄層色譜中的值可作為定性鑒別的依據(jù)。應(yīng)用值可作為定性鑒別的依據(jù)。應(yīng)用定性，一般用待測化合物的純品作對照，在兩

36、種定性，一般用待測化合物的純品作對照，在兩種或兩種以上展開劑系統(tǒng)中展開，若樣品中斑點(diǎn)的或兩種以上展開劑系統(tǒng)中展開，若樣品中斑點(diǎn)的值與純品值與純品值都相同，可肯定兩者為同一化合物。值都相同，可肯定兩者為同一化合物。 但在中藥鑒定中也常用標(biāo)準(zhǔn)藥材為對照品，用以鑒但在中藥鑒定中也常用標(biāo)準(zhǔn)藥材為對照品，用以鑒別藥材的真?zhèn)?。別藥材的真?zhèn)?。l 為消除實(shí)驗(yàn)中難以避免的誤差，提高為消除實(shí)驗(yàn)中難以避免的誤差，提高值的重現(xiàn)值的重現(xiàn)性，可采用相對比移值性，可采用相對比移值st定性，即用一個待測化定性，即用一個待測化合物相近的已知化合物做相對標(biāo)準(zhǔn)，在同一條件下合物相近的已知化合物做相對標(biāo)準(zhǔn)，在同一條件下平行展開測定，

37、求兩者平行展開測定，求兩者值的比值作為鑒定的依據(jù)值的比值作為鑒定的依據(jù)（同紙色譜）（同紙色譜） 33影響薄層色譜分析的主要因素： l 1樣品的預(yù)處理及供試液的制備樣品的預(yù)處理及供試液的制備l 一般認(rèn)為薄層色譜所用固定相（薄層板）可即用即棄，不怕一般認(rèn)為薄層色譜所用固定相（薄層板）可即用即棄，不怕供試液中雜質(zhì)的污染，因而樣品無需凈化精制。但在實(shí)踐中，供試液中雜質(zhì)的污染，因而樣品無需凈化精制。但在實(shí)踐中，由于中藥的成分復(fù)雜，未知成分多，供試液中溶出的物質(zhì)較多，由于中藥的成分復(fù)雜，未知成分多，供試液中溶出的物質(zhì)較多，其中有欲測成分也有其他其中有欲測成分也有其他“雜質(zhì)雜質(zhì)”，常常由于相互干擾或背景，常

38、常由于相互干擾或背景污染而難以得到滿意的分離效果，甚至難以辨認(rèn)，尤其成方制污染而難以得到滿意的分離效果，甚至難以辨認(rèn)，尤其成方制劑更是如此。劑更是如此。l 所以在許多情況下為了得到一個較為清晰的色譜，樣品提取所以在許多情況下為了得到一個較為清晰的色譜，樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試液得以凈化，往往是一個重要的有時甚至物經(jīng)預(yù)處理，使供試液得以凈化，往往是一個重要的有時甚至是關(guān)鍵的步驟，制備樣品供試液所用的溶劑一般要求溶解度不是關(guān)鍵的步驟，制備樣品供試液所用的溶劑一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸點(diǎn)適中；但中藥制劑往往希望各成宜太大，粘度不宜太高，沸點(diǎn)適中；但中藥制劑往往希望各成分盡量多地提取出

39、來，最常被選用的是甲醇或乙醇，欲測成分分盡量多地提取出來，最常被選用的是甲醇或乙醇，欲測成分和許多其他和許多其他“雜質(zhì)雜質(zhì)”均可能被提取出來，因此供試液的凈化就均可能被提取出來，因此供試液的凈化就顯得更為必要。顯得更為必要。 34l樣品供試液凈化的方法通常有：樣品供試液凈化的方法通常有： l 單一溶劑萃取法；單一溶劑萃取法；l 分段萃取法；分段萃取法；l 液液萃取法；液液萃取法；l 固液萃取法。固液萃取法。 35l 2薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)l 點(diǎn)樣是薄層色譜的第一步，也是關(guān)鍵的一步，它既關(guān)系到能點(diǎn)樣是薄層色譜的第一步，也是關(guān)鍵的一步，它既關(guān)系到能否得到可以重現(xiàn)的薄層色譜，也關(guān)系到

40、定量測定結(jié)果的準(zhǔn)確與否得到可以重現(xiàn)的薄層色譜，也關(guān)系到定量測定結(jié)果的準(zhǔn)確與否，因?yàn)椴涣嫉狞c(diǎn)樣是測定誤差的最主要的來源。一般在常規(guī)否，因?yàn)椴涣嫉狞c(diǎn)樣是測定誤差的最主要的來源。一般在常規(guī)薄層板上原點(diǎn)的直徑不大于薄層板上原點(diǎn)的直徑不大于3mm，高效薄層板要求原點(diǎn)直徑，高效薄層板要求原點(diǎn)直徑不大于不大于2mm。l 點(diǎn)樣量不宜過大，最好控制在點(diǎn)樣量不宜過大，最好控制在10l以下，如在一個位置重復(fù)以下，如在一個位置重復(fù)多次點(diǎn)樣時，須注意盡量不要將原點(diǎn)點(diǎn)成一個空心圈。選用溶多次點(diǎn)樣時，須注意盡量不要將原點(diǎn)點(diǎn)成一個空心圈。選用溶劑沸點(diǎn)不宜太高（如正丁醇）或太低（如乙醚）。劑沸點(diǎn)不宜太高（如正丁醇）或太低（如乙

41、醚）。l 點(diǎn)樣時需注意盡量不要損傷薄層板表面。點(diǎn)樣時需注意盡量不要損傷薄層板表面。 36l 3吸附劑的活性與相對濕度的影響吸附劑的活性與相對濕度的影響l 吸附劑的活性是由吸附劑如硅膠的表面能和表面積決定的。吸附劑的活性是由吸附劑如硅膠的表面能和表面積決定的。硅膠的硅醇是親水性基因，很易吸附水分子而成為水合硅醇基硅膠的硅醇是親水性基因，很易吸附水分子而成為水合硅醇基而失去活性。而失去活性。l 日常操作時，當(dāng)活化后硅膠（或氧化鋁）薄層板從干燥器中日常操作時，當(dāng)活化后硅膠（或氧化鋁）薄層板從干燥器中取出，自開始點(diǎn)樣到展開前，薄層板一般是暴露在實(shí)驗(yàn)室的大取出，自開始點(diǎn)樣到展開前，薄層板一般是暴露在實(shí)驗(yàn)

42、室的大氣中，其活性取決于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的相對濕度。氣中，其活性取決于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的相對濕度。l 在其他條件相同的情況下，相對濕度對許多樣品色譜質(zhì)量的在其他條件相同的情況下，相對濕度對許多樣品色譜質(zhì)量的影響是明顯的。通常認(rèn)為薄層色譜重現(xiàn)性差，在不同的相對濕影響是明顯的。通常認(rèn)為薄層色譜重現(xiàn)性差，在不同的相對濕度下點(diǎn)樣和展開是其原因之一。度下點(diǎn)樣和展開是其原因之一。l 控制相對濕度可在雙槽展開缸的一側(cè)用一定濃度的硫酸溶液，控制相對濕度可在雙槽展開缸的一側(cè)用一定濃度的硫酸溶液，密閉放置一定時間（如密閉放置一定時間（如1530min），再加入展開劑于另一側(cè)），再加入展開劑于另一側(cè)展開。也可將點(diǎn)樣后的薄層板放

43、入一定的容器中內(nèi)有一定濃度展開。也可將點(diǎn)樣后的薄層板放入一定的容器中內(nèi)有一定濃度的硫酸溶液或其他調(diào)節(jié)相對濕度的無機(jī)鹽水溶液，密閉旋轉(zhuǎn)一的硫酸溶液或其他調(diào)節(jié)相對濕度的無機(jī)鹽水溶液，密閉旋轉(zhuǎn)一定時間后，取出，立即在箱中展開。定時間后，取出，立即在箱中展開。l 37l4溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用l 薄層色譜與柱色譜的區(qū)別之一就是溶劑的蒸氣相薄層色譜與柱色譜的區(qū)別之一就是溶劑的蒸氣相在展開缸中也參與色譜的展開而形成三維的層析過在展開缸中也參與色譜的展開而形成三維的層析過程。展開缸的空間氣體在薄層層析過程中起著重要程。展開缸的空間氣體在薄層層析過程中起著重要的作用。的作用。l

44、在常規(guī)薄層色譜分析中，層析過程是很復(fù)雜的，在常規(guī)薄層色譜分析中，層析過程是很復(fù)雜的，特別是使用多元又能形成兩相的展開劑時，即有吸特別是使用多元又能形成兩相的展開劑時，即有吸附行為也有分配行為。這時，對薄層色譜的層析過附行為也有分配行為。這時，對薄層色譜的層析過程和結(jié)果有很大的影響。程和結(jié)果有很大的影響。l 38l 5溫度的影響溫度的影響l 溫度也是影響層析行為的因素之一。溫度也是影響層析行為的因素之一。l 最直觀的影響是被分離物質(zhì)的最直觀的影響是被分離物質(zhì)的Rf值和物質(zhì)的相互值和物質(zhì)的相互分離度以及斑點(diǎn)的擴(kuò)散等，在溫差較大的不同地點(diǎn)分離度以及斑點(diǎn)的擴(kuò)散等，在溫差較大的不同地點(diǎn)或時間，其它條件相

45、同展開同樣的樣品，所得色譜或時間，其它條件相同展開同樣的樣品，所得色譜可能會有差異。可能會有差異。39（二）薄層掃描定性分析（二）薄層掃描定性分析 l 薄層掃描定性分析即在薄層色譜的基礎(chǔ)上，通過薄層掃描儀薄層掃描定性分析即在薄層色譜的基礎(chǔ)上，通過薄層掃描儀將色譜斑點(diǎn)轉(zhuǎn)換成色譜峰，進(jìn)而利用對特征峰的確認(rèn)來進(jìn)行鑒將色譜斑點(diǎn)轉(zhuǎn)換成色譜峰，進(jìn)而利用對特征峰的確認(rèn)來進(jìn)行鑒別。別。l 1. 薄層掃描薄層掃描l （1）根據(jù)分析樣品中所含化學(xué)成分的特性選擇測定方法，如）根據(jù)分析樣品中所含化學(xué)成分的特性選擇測定方法，如樣品中的化學(xué)組分有熒光，樣品中的化學(xué)組分有熒光，l 則可選擇熒光法測定，一般以反射法和熒光法較

46、為常用。則可選擇熒光法測定，一般以反射法和熒光法較為常用。l （2）測定波長的選擇，一般需選擇最大吸收波長）測定波長的選擇，一般需選擇最大吸收波長s或次強(qiáng)吸或次強(qiáng)吸收波長作為測定波長，若選用雙波長測定，收波長作為測定波長，若選用雙波長測定，s同前述，同前述，R應(yīng)應(yīng)選擇吸收較小或無吸收的波長作為參比波長。選擇吸收較小或無吸收的波長作為參比波長。 l （3）掃描方式，根據(jù)薄層斑點(diǎn)的形狀，若為對稱性好的圓形）掃描方式，根據(jù)薄層斑點(diǎn)的形狀，若為對稱性好的圓形斑點(diǎn)可選用線性掃描，這樣掃描可得到對稱的色譜峰；若薄層斑點(diǎn)可選用線性掃描，這樣掃描可得到對稱的色譜峰；若薄層斑點(diǎn)不規(guī)則，可選用鋸齒形掃描斑點(diǎn)不規(guī)則

47、，可選用鋸齒形掃描 l 40l 2特征色譜峰的確認(rèn)特征色譜峰的確認(rèn)l （1）對已知樣品可根據(jù)文獻(xiàn)記載，進(jìn)行?。σ阎獦悠房筛鶕?jù)文獻(xiàn)記載，進(jìn)行薄層掃描及薄層掃描圖譜分析。層掃描及薄層掃描圖譜分析。l （2）對未知樣品應(yīng)在了解樣品來源、被分）對未知樣品應(yīng)在了解樣品來源、被分析組成的性質(zhì)等情況，設(shè)計鑒定方案。析組成的性質(zhì)等情況，設(shè)計鑒定方案。l （3）對色譜峰的化學(xué)成分歸屬，則需有標(biāo)）對色譜峰的化學(xué)成分歸屬，則需有標(biāo)準(zhǔn)對照品對照，為使鑒定結(jié)果可靠，通常需準(zhǔn)對照品對照，為使鑒定結(jié)果可靠，通常需兩個以上不同的展開系統(tǒng)驗(yàn)證。兩個以上不同的展開系統(tǒng)驗(yàn)證。41四四. 薄層色譜定量分析薄層色譜定量分析 l（一）

48、洗脫法（一）洗脫法l 將待測化合物從薄層吸附劑中提取出來，用分光光將待測化合物從薄層吸附劑中提取出來，用分光光度法定量。共分三步：度法定量。共分三步：l 1斑點(diǎn)定位斑點(diǎn)定位l 1）選擇不影響下一步測定的顯色方法，如置紫外）選擇不影響下一步測定的顯色方法，如置紫外燈光下照射或置碘蒸氣中顯色。燈光下照射或置碘蒸氣中顯色。l 2）必須用顯色劑時，可用對照顯色法，即在同一薄）必須用顯色劑時，可用對照顯色法，即在同一薄層板上將標(biāo)準(zhǔn)品及部分待測樣品，噴顯色劑。其它層板上將標(biāo)準(zhǔn)品及部分待測樣品，噴顯色劑。其它部分用玻璃板蓋住，待顯色后，將未顯色的相應(yīng)位部分用玻璃板蓋住，待顯色后，將未顯色的相應(yīng)位置的吸附劑畫

49、出，以備洗脫。置的吸附劑畫出，以備洗脫。42l 2洗脫洗脫l 斑點(diǎn)位置確定后，用吸集器收集或用小刀將斑點(diǎn)位斑點(diǎn)位置確定后，用吸集器收集或用小刀將斑點(diǎn)位置的吸附劑刮下，刮取時要仔細(xì)地、定量地將斑點(diǎn)置的吸附劑刮下，刮取時要仔細(xì)地、定量地將斑點(diǎn)上吸附劑完全刮下，然后用溶劑洗脫，或刮入離心上吸附劑完全刮下，然后用溶劑洗脫，或刮入離心管中，直接加顯色劑及溶劑，一并提取和顯色，離管中，直接加顯色劑及溶劑，一并提取和顯色，離心后取上清液測定。心后取上清液測定。l 3測定測定l 薄層色譜法取樣一般為幾微克至幾十微克，常用薄層色譜法取樣一般為幾微克至幾十微克，常用測定的方法為紫外及可見分光度法。測定中，應(yīng)刮測定

50、的方法為紫外及可見分光度法。測定中，應(yīng)刮取相當(dāng)樣品斑點(diǎn)的空白吸附劑，作同樣洗脫及顯色取相當(dāng)樣品斑點(diǎn)的空白吸附劑，作同樣洗脫及顯色后，作為空白對照液，以消除吸附劑本身的吸收。后，作為空白對照液，以消除吸附劑本身的吸收。l 薄層色譜分離后用分光光度法測定，方法誤差薄層色譜分離后用分光光度法測定，方法誤差2%6%。 43（二）薄層掃描定量法（二）薄層掃描定量法 l 1. 方法學(xué)考察方法學(xué)考察l 新建薄層掃描定量方法必須進(jìn)行方法學(xué)考察，以新建薄層掃描定量方法必須進(jìn)行方法學(xué)考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度、統(tǒng)計檢驗(yàn)等

51、內(nèi)容。定量結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度、統(tǒng)計檢驗(yàn)等內(nèi)容。l 44l （1）工作曲線：對于用）工作曲線：對于用Kubelka- Munk曲線校直法曲線校直法進(jìn)行定量校準(zhǔn)的儀器，如進(jìn)行定量校準(zhǔn)的儀器，如CS系列薄層掃描儀，繪制系列薄層掃描儀，繪制色譜峰峰面積色譜峰峰面積A與純品點(diǎn)樣量（與純品點(diǎn)樣量（g/斑點(diǎn)）間的工作斑點(diǎn)）間的工作曲線，并非直接用于定量，其目的是：曲線，并非直接用于定量，其目的是：l 檢查所選擇的散射參數(shù)檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。值是否適宜。l SX值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調(diào)整值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線成值再校

52、正，直至在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線成直線為止。直線為止。45l 考察工作曲線是否過原點(diǎn)，以便確定采用一點(diǎn)法考察工作曲線是否過原點(diǎn)，以便確定采用一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量。直線過原點(diǎn)，截距為零時，可用外或二點(diǎn)法定量。直線過原點(diǎn)，截距為零時，可用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量；直線不過原點(diǎn)，截標(biāo)或內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量；直線不過原點(diǎn)，截距不為零時，不能用一點(diǎn)法定量，只能用二點(diǎn)法定距不為零時，不能用一點(diǎn)法定量，只能用二點(diǎn)法定量。量。l 確定點(diǎn)樣量的線性范圍。既使采用曲線校直，也確定點(diǎn)樣量的線性范圍。既使采用曲線校直，也只是在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需只是在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定

53、點(diǎn)樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)確定點(diǎn)樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)整點(diǎn)樣量，使供試品與對照品的峰面積相接近。為整點(diǎn)樣量，使供試品與對照品的峰面積相接近。為了克服薄層板間差異，外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法均應(yīng)采用隨了克服薄層板間差異，外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法均應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法即標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液交叉點(diǎn)在同一行標(biāo)準(zhǔn)法即標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液交叉點(diǎn)在同一塊薄層板上。塊薄層板上。46l （2）精密度考察：取同一供試品溶液，在同一塊?。┚芏瓤疾欤喝⊥还┰嚻啡芤海谕粔K薄層板上以相同點(diǎn)樣量平行點(diǎn)層板上以相同點(diǎn)樣量平行點(diǎn)5點(diǎn)以上，展開后測定其點(diǎn)以上，展開后測定其峰面積，求算相對標(biāo)準(zhǔn)差（峰面積，求算相對標(biāo)準(zhǔn)差

54、（RSD），作為衡量定量），作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。RSD應(yīng)小于應(yīng)小于4；有時根據(jù)；有時根據(jù)要求，還要做異板精密度考察。要求，還要做異板精密度考察。l （3）準(zhǔn)確度考察：回收率是衡量定量方法準(zhǔn)確度的）準(zhǔn)確度考察：回收率是衡量定量方法準(zhǔn)確度的指標(biāo)，常用加樣回收率（指標(biāo)，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應(yīng)在）來衡量，其值應(yīng)在95105之間，測量數(shù)據(jù)一般為之間，測量數(shù)據(jù)一般為56個。個。l 將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開后進(jìn)行薄層于同一塊薄層板上，展開后進(jìn)行薄層掃描，測定各斑點(diǎn)的峰面積，計

55、算各溶液小組分的掃描，測定各斑點(diǎn)的峰面積，計算各溶液小組分的量，計算回收率（量，計算回收率（R）。）。 47l （4）統(tǒng)計檢驗(yàn)：）統(tǒng)計檢驗(yàn)：l 統(tǒng)計檢驗(yàn)是檢驗(yàn)兩種方法、兩臺儀器或兩個人測統(tǒng)計檢驗(yàn)是檢驗(yàn)兩種方法、兩臺儀器或兩個人測量的兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度或準(zhǔn)確度（偶然誤差或量的兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度或準(zhǔn)確度（偶然誤差或系統(tǒng)誤差）間是否存在顯著性差異，說明新建定量系統(tǒng)誤差）間是否存在顯著性差異，說明新建定量方法可否代替舊方法或優(yōu)于舊方法。方法可否代替舊方法或優(yōu)于舊方法。l 統(tǒng)計檢驗(yàn)包括統(tǒng)計檢驗(yàn)包括F檢驗(yàn)與檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)。F檢驗(yàn)即精密度差別檢驗(yàn)即精密度差別檢驗(yàn)，用以檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)的精密度或偶然誤差是

56、否檢驗(yàn)，用以檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)的精密度或偶然誤差是否存在顯著性差異，一般為單側(cè)檢驗(yàn)。存在顯著性差異，一般為單側(cè)檢驗(yàn)。t檢驗(yàn)即準(zhǔn)確度檢驗(yàn)即準(zhǔn)確度差別檢驗(yàn)，用以檢驗(yàn)兩組測量數(shù)據(jù)的平均值或系統(tǒng)差別檢驗(yàn)，用以檢驗(yàn)兩組測量數(shù)據(jù)的平均值或系統(tǒng)誤差是否存在顯著性差異。若誤差是否存在顯著性差異。若t檢驗(yàn)證明兩種方法測檢驗(yàn)證明兩種方法測得的均值不存在顯著性差異時，則新方法可以代替得的均值不存在顯著性差異時，則新方法可以代替舊方法，舊方法，t檢驗(yàn)一般為雙側(cè)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)一般為雙側(cè)檢驗(yàn)。 48 2 定量分析定量分析l （1）外標(biāo)法：外標(biāo)法是薄層色譜掃描最常用的定量）外標(biāo)法：外標(biāo)法是薄層色譜掃描最常用的定量方法，方法簡便，但點(diǎn)

57、樣必須準(zhǔn)確。由于薄層板間方法，方法簡便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。由于薄層板間差異較大，為克服這種差異，應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，差異較大，為克服這種差異，應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，即供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液（或?qū)φ杖芤海┙徊纥c(diǎn)在同一即供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液（或?qū)φ杖芤海┙徊纥c(diǎn)在同一塊板上，包括外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法。塊板上，包括外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法。l 外標(biāo)一點(diǎn)法：工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時外標(biāo)一點(diǎn)法：工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量如圖可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量如圖4-4。只需點(diǎn)一種濃度的標(biāo)。只需點(diǎn)一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計算公式為：

58、量，其計算公式為：l C = F1A l 式中，式中，C：組分的重量或濃度；：組分的重量或濃度；A：測得該組分的峰面積；：測得該組分的峰面積；F1：直線的斜率或比例常數(shù)。：直線的斜率或比例常數(shù)。 49圖圖4-4 外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)一點(diǎn)法 圖圖4-5 外標(biāo)二點(diǎn)法外標(biāo)二點(diǎn)法50l 外標(biāo)二點(diǎn)法：工作曲線不通過原點(diǎn)時，只能用外外標(biāo)二點(diǎn)法：工作曲線不通過原點(diǎn)時，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少需點(diǎn)二種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少需點(diǎn)二種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(或一種濃度兩種點(diǎn)樣量或一種濃度兩種點(diǎn)樣量)才能決定一直線，其計算才能決定一直線，其計算公式為：公式為：l C = F1A + F2 l 式中，式中，C：

59、組分的重量或濃度；：組分的重量或濃度；A為測得該組分的為測得該組分的峰面積；峰面積；Fl：直線的斜率或比例常數(shù)；：直線的斜率或比例常數(shù)；F 2：縱坐標(biāo)：縱坐標(biāo)的截距。的截距。F1和和F2值由儀器自動算出值由儀器自動算出。 51l （2）內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)法是選一個純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，）內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)法是選一個純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計算供試品溶液中某組分含量的定量方法。計算供試品溶液中某組分含量的定量方法。l 與外標(biāo)法相似，當(dāng)工作曲線通過原點(diǎn)時采用內(nèi)標(biāo)一與外標(biāo)法相似，當(dāng)工作曲線通過原點(diǎn)時采用內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法，工作曲線不通過原點(diǎn)時

60、必須采用內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法；點(diǎn)法，工作曲線不通過原點(diǎn)時必須采用內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法；并以濃度比及峰面積比代替濃度及峰面積。并以濃度比及峰面積比代替濃度及峰面積。l 內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法公式：內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法公式： C/Cis = F1A/Ais l 內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法公式：內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法公式： C/Cis = F1A/Ais + F2 l 式中，式中，C、Cis：分別為組分及內(nèi)標(biāo)物的濃度或重量；：分別為組分及內(nèi)標(biāo)物的濃度或重量；A、Ais：分別為測得組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積；：分別為測得組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積；F1：直線的斜率或：直線的斜率或比例常數(shù)，比例常數(shù)，F(xiàn)2：截距。：截距。F1和和F2由儀器自動計算并內(nèi)存，可直由儀器自動計算并內(nèi)存，可直