課程論文翻譯

1、使用超聲共振技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的非離子表面活性劑CMC的配方（藥劑學(xué)課程論文翻譯）2015年 5月2日使用超聲共振技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的非離子表面活性劑CMC的配方Shohei Horiuchi ,Gerhard Winter摘要：生物制品通常含有表面活性劑配方中的穩(wěn)定劑,以避免表面吸附的蛋白質(zhì)藥物，和界面的變性、聚集從而提高產(chǎn)品的整體質(zhì)量。另一方面，在蛋白制劑中當(dāng)表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度（CMC）時(shí)，蛋白膠束的形成可能是免疫原性的原因。 因此,實(shí)際的CMC和膠團(tuán)的存在通常需要確認(rèn)每個(gè)蛋白質(zhì)配方,因?yàn)镃MC影響了蛋白質(zhì)和其他配方因素。 在這項(xiàng)研究中，超聲波共振技術(shù)（URT）用于測(cè)定與比較

2、CMC中藥物蛋白質(zhì)溶液的表面活性張力（TE）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）。結(jié)果表明，超聲波共振技術(shù)可以很容易地和精確地提供蛋白制劑中表面活性劑CMC，而無(wú)蛋白制劑卻測(cè)不出來(lái)。這表明，信號(hào)測(cè)量出的超聲波速度來(lái)自膠束組成的表面活性劑和蛋白質(zhì)分子。 DLS沒(méi)有為蛋白質(zhì)/表面活性劑系統(tǒng)提供可靠的數(shù)據(jù)。 有趣的是，與精氨酸和聚山梨酯20蛋白配方不同的表現(xiàn)時(shí)，TE和URT的研究讓我們看到，精氨酸蛋白結(jié)合的復(fù)合物與表面活性劑的相互作用。關(guān)鍵詞：蛋白表達(dá)；表面活性劑；超聲波共振技術(shù)；臨界膠束濃度；動(dòng)態(tài)光散射1. 介紹 在過(guò)去幾十年中制藥公司已經(jīng)開發(fā)出許多生物藥品以治療糖尿病、貧血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥等嚴(yán)重疾病1。生

3、物制劑通常有高效力和毒性較低的選擇性。 因此,生物制劑在市場(chǎng)中所占的百分比正逐漸擴(kuò)大。為了生物制藥的供應(yīng)，藥廠在開發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中必須克服許多障礙2。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在人體中通常是不能長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存的，蛋白質(zhì)制藥的穩(wěn)定劑要在一個(gè)合適的PH值下模擬藥物配方中含有非離子表面活性劑的穩(wěn)定性，并且一些重要的銷售產(chǎn)品需通過(guò)發(fā)表論文研究告知3。眾所周知,表面活性劑可以降低蛋白質(zhì)的聚合,從而降低免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。 同時(shí),輔料可以減少機(jī)械應(yīng)力,提高長(zhǎng)期穩(wěn)定性和溶解蛋白低溶解度的分子。因此可以添加表面活性劑的一個(gè)重要方面是配方的開發(fā)和后期的生產(chǎn)工藝驗(yàn)證。另一方面，表面活性劑能形成超過(guò)其CMC的膠束，并在某些情況下蛋白膠束能

4、像異物一樣引起免疫原性8,9，10。 我們可以假設(shè)在病毒樣顆粒的典型尺寸范圍的膠束，承載在其表面上的蛋白質(zhì)或多或少是''ordered”方式，是一種類型的顆粒疫苗制劑的進(jìn)展 11 。這使得配方專家處在兩難的境地，一方面需要確保足夠的表面活性劑來(lái)避免或至少減少表面變性和聚合,另一方面排除過(guò)多的膠團(tuán)的存在。 因此,科學(xué)家必須精確的決定是否可用表面活性劑膠束配制特定的蛋白質(zhì)制劑。幾乎所有的表面活性劑的CMC都在文獻(xiàn)中列出，但這些數(shù)據(jù)的溶劑是純水，眾所周知，CMC可通過(guò)不同溶劑改變蛋白質(zhì)的濃度12。 因此不可能只從CMC數(shù)據(jù)表計(jì)算它，但至關(guān)重要的是確定表面活性劑的CMC(或更好的膠團(tuán)的

5、存在):可以更好的開發(fā)每個(gè)蛋白質(zhì)制劑配方。 有許多方法可用于CMC的測(cè)定,但表面張力測(cè)量學(xué)(TE)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)是最受歡迎的13,14,15和16。這種方法和容易是因?yàn)榇蠖鄶?shù)制藥實(shí)驗(yàn)室都有這些設(shè)備。,然而,這些方法有一定的缺點(diǎn)。DLS是一個(gè)光學(xué)方法,通過(guò)粒子，存在干擾雜質(zhì)，影響了蛋白質(zhì)聚集體和濁度。并且它不能區(qū)分粒子的表面活性劑膠束和蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)總量大約相同的問(wèn)題。另一方面,DLS法是唯一的標(biāo)準(zhǔn)方法,觀察其大量的解決方案,DLS并不是表面上直接檢測(cè)膠束。表面張力的測(cè)量是最常用的CMC測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的方法，但它只是剔除表面活性劑膠束與單體之間的飽和度數(shù)據(jù)。它不能提供膠束存在的直接信息，

6、也不與本體溶液的表面活性蛋白存在相互作用。更多的,我們看到的表面上的蛋白質(zhì)作用，即其表面位移或者與表面活性劑競(jìng)爭(zhēng),不直接與膠束作用。 為了克服這些問(wèn)題，我們提出了超聲波共振技術(shù)（URT），在這項(xiàng)技術(shù)中存在額外的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。此外,我們希望提供一些新的、關(guān)于大多數(shù)常用表面活性劑用于胃腸道藥物蛋白的CMC數(shù)據(jù)(EPO(促紅細(xì)胞生成素)hGH,抗體)。因?yàn)槟壳盀橹?，文獻(xiàn)中沒(méi)有提供出這樣的數(shù)據(jù)。 超聲波共振技術(shù)是很多年前開發(fā)的精確測(cè)量超聲波的速度的一種技術(shù)，通過(guò)運(yùn)行駐波超聲波發(fā)生器和一個(gè)反射器來(lái)實(shí)行17。該方法的物理基礎(chǔ)和應(yīng)用程序所引用的文獻(xiàn)是可用的18,17和19。超聲波速度具有壓縮性,“ha

7、rdness”材料的測(cè)量元件可以超聲穿透。水溶液的硬度不僅存在自由水的量的復(fù)雜關(guān)系，溶質(zhì)和水也是一種溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是在溶解蛋白的情況下。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些調(diào)查，使用超聲波速度測(cè)量研究蛋白質(zhì)壓縮體積穩(wěn)定性的解決方法19,20,21,22,23,2425。即使此種方法確定CMC的原理存在很久26,(27),2829，然而,沒(méi)有任何出版物發(fā)表關(guān)于應(yīng)用URT去測(cè)定表面活性劑CMC的蛋白質(zhì)含量配方的文章。 這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是,(1)這是一個(gè)體積法,可以直接檢測(cè)表面活性劑膠束的存在(2)它可以適用于高濃度蛋白質(zhì)溶液(3)這不是一個(gè)光學(xué)方法,因此不受溶液濁度的影響，等等。另一方面，URT有一些局限性因?yàn)殡s

8、質(zhì)的高靈敏度,如更大的粒子。同時(shí)，應(yīng)該小心溶液溫度和測(cè)量諧振器細(xì)胞的有機(jī)溶劑的腐蝕。此外,因?yàn)檫@種方法是以本體溶液為象征，所以我們不能區(qū)分與本體溶液同時(shí)發(fā)生的不同的現(xiàn)象。 在這項(xiàng)研究中,確定超聲波速度與表面活性劑的濃度,對(duì)于一個(gè)典型的CMC，其他方法測(cè)定都不如URT。希望看到壓縮系數(shù)的改變和水化膠團(tuán)形成時(shí),蛋白質(zhì)與表面活性劑形成膠束。令人驚訝的是,我們不僅能夠從數(shù)據(jù)中確定蛋白質(zhì)CMC /表面活性劑系統(tǒng),當(dāng)超過(guò)CMC時(shí)也可除去連接和結(jié)合蛋白的存在。但另一方面我們依然不能確定在純水中表面活性劑的cmc是否會(huì)影響表面活性劑的靈敏度。2. 材料和方法2.1 蛋白質(zhì) 單克隆抗體A IgG1（Mab A）

9、，人體生長(zhǎng)激素(hGH)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)是被羅氏(潘茨堡,德國(guó))和山德士(Kundl、奧地利)發(fā)明的。牛血清白蛋白是購(gòu)自西格瑪奧德里奇化學(xué)GmbH(Taufkirchen,德國(guó))。Omalizumab是從市場(chǎng)購(gòu)買的Xolair®注射器產(chǎn)品。 常用蛋白質(zhì)配制方案制定如下:45毫克/毫升單克隆抗體在20毫升的組氨酸緩沖液中pH值為5.5，8毫克/毫升hGH 在10毫升磷酸緩沖液中pH值為7.0，9毫克/毫升EPO在7.5毫升的磷酸鹽緩沖劑中pH值為7.0，150毫克/毫升omalizumab 在20毫升緩沖液中與200毫升0.04 重量 / 體積 %的精氨酸和組氨酸混合液合成聚

10、山梨酯20。20毫克/毫升的100毫升的檸檬酸鹽緩沖液溶解粉末白蛋白BSA原液使之pH為6.1。2.2 化學(xué)物質(zhì) 聚聚山梨醇酯80（PS80），HLB為15.0，自Fluka化學(xué)有限責(zé)任公司（Buchs，德國(guó)）購(gòu)買。聚山梨酯20（PS20），HLB為16.7，經(jīng)過(guò)超級(jí)精煉的吐溫20 LQ-（MH）由Croda公司（Columbus Circle Edison，NJ，美國(guó)）購(gòu)買。其他化學(xué)品，包括泊洛沙姆188（PX188），HLB為29，自Sigma Aldrich公司化學(xué)有限責(zé)任公司（Taufkirchen的，德國(guó)）購(gòu)買。2.3 樣品制備 對(duì)于URT和DLS，蛋白質(zhì)樣品溶液稀釋儲(chǔ)備液用水或緩沖

11、劑制成，稀釋過(guò)程中加入的表面活性劑是以獲得蛋白質(zhì)溶液與表面活性劑的目的濃度。對(duì)于TE，蛋白儲(chǔ)備溶液首先稀釋，被稀釋的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)每次測(cè)量結(jié)束后加入的表面活性劑滴定。2.4 超聲共振技術(shù) 超聲波速度測(cè)量是儀器TF公司（海德堡，德國(guó)）生產(chǎn)的ResoScan儀器。該儀器具有兩個(gè)圓筒型電池應(yīng)用于樣品和參考溶液。當(dāng)本研究為無(wú)蛋白制劑時(shí)，樣品和參考細(xì)胞充滿水（或緩沖液）和表面活性劑/水（或緩沖液）溶液，而對(duì)于蛋白質(zhì)制劑，樣品和參考細(xì)胞則充滿了蛋白質(zhì)/表面活性劑/緩沖溶液。對(duì)這兩種物質(zhì)的超聲波速度同時(shí)進(jìn)行測(cè)量，分別記錄為U1和U2，以及U（= U 2-U1，它是減去由參考細(xì)胞樣品單元的值）用于我們的評(píng)估。

12、在CMC測(cè)量，該儀器理論上檢測(cè)表面活性劑，在與上述的CMC以及用于蛋白質(zhì)制劑的關(guān)聯(lián)捕捉變動(dòng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和水合狀態(tài)圍繞該蛋白質(zhì)的信號(hào)。在測(cè)量前，都將細(xì)胞充滿溶液，以沖洗細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。然后將漂洗溶液完全抽出與樣品和參比溶液的180微升注入細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，小心地避免溶液出氣泡30。2.5 表面張力測(cè)量 Wilhelmy法是用來(lái)自Kruss GmbH(德國(guó)漢堡)的K100張力儀來(lái)測(cè)量表面張力的，它的棒狀探針PL03被用于所有的分析。每次測(cè)量前,探測(cè)器被純凈水和氣體燃燒器燃燒去除水和潛在的污染物。約2毫升樣品溶液置于一個(gè)小的金屬容器中，并使之保持在預(yù)先設(shè)定的溫度10分鐘以上。在開始測(cè)量之前，張力計(jì)通過(guò)測(cè)量表

13、面張力相比純?nèi)軇?，即水監(jiān)測(cè)表面活性劑對(duì)液體樣品的頂部表面上的積累。當(dāng)空氣/液體和液體/固體的界面充滿飽和表面活性劑，此時(shí)溶液中表面張力達(dá)到平臺(tái)期并且膠束形成2.6 動(dòng)態(tài)光散射(DLS) 顆粒大小和派生的計(jì)數(shù)率在膠束形成時(shí)受到Zetasizer Nano-ZS莫爾文儀器GmbH(Herrenberg,德國(guó))的影響。將430L的樣品溶液放入一個(gè)GmbH(韋特海姆,德國(guó))生產(chǎn)的一次性塑料試管中，確認(rèn)沒(méi)有氣泡， 然后測(cè)量所有的樣品。在這項(xiàng)研究中有一個(gè)低粘度數(shù)值接近于水，折射指數(shù)用PS20 PS80 PX188分別表示為1.469,1.472和1.466。平均每個(gè)測(cè)量時(shí)間間隔是120秒,其他所有參數(shù)DL

14、S自動(dòng)設(shè)置。2.7 CMC的計(jì)算TE中的CMC通過(guò)DLS和URT數(shù)據(jù)圖表的直線拐點(diǎn)來(lái)確定。3 結(jié)果與討論3.1 CMC評(píng)估無(wú)蛋白配方 首先，無(wú)蛋白質(zhì)制劑進(jìn)行了測(cè)試，以確定由TE，DLS和URT等方法所測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)表面活性劑的CMC，然后，將不同量的PS20，PS80和PX188加入到水中并過(guò)濾，用0.22m過(guò)濾器與周圍0.1-10w/ v的設(shè)備做成儲(chǔ)備溶液。之后，稀釋這些已過(guò)濾的作為儲(chǔ)備溶液的水，以獲得樣品的各濃度。PS80在水溶液中的結(jié)果如圖1所示，所有的CMC數(shù)據(jù)如表1所示。TE和DLS所測(cè)得的CMC值是相同的，但是URT對(duì)蛋白制劑無(wú)效。 這里提到的數(shù)值是很重要的，因?yàn)樗羌磳l(fā)表的關(guān)于設(shè)備

15、如何正常工作的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。當(dāng)將溶劑從水改為10mM磷酸鹽和20mM組氨酸緩沖液時(shí)，CMC沒(méi)有受到很大影響。URT無(wú)法確定CMC的值顯然是因?yàn)橛捎谛盘?hào)太弱的原因以及受到表面活性劑分子在接近低濃度CMC水和緩沖區(qū)中水結(jié)構(gòu)變化的影響。小分子或緩沖鹽的存在不能放大超聲波信號(hào)使表面活性劑膠束化。事實(shí)上PX188其中的CMC值是聚山梨醇酯的大約10倍，非常輕微的U可以通過(guò)URT來(lái)檢測(cè)，但是在圖S1中卻沒(méi)有跡象顯示出CMC值。另一方面，TE和DLS可檢測(cè)CMC。對(duì)于TE，它的監(jiān)測(cè)屬性為液體樣品，其中所述表面活性劑性質(zhì)是由它的兩親性質(zhì)所決定。因此,如果連CMC值都相當(dāng)?shù)?，那么TE就很容易影響到表面張力。對(duì)于DL

16、S，毫無(wú)疑問(wèn)該儀器是公知的一個(gè)強(qiáng)大的工具，即使對(duì)于低濃度的樣品，也可判定無(wú)蛋白質(zhì)制劑的CMC。（見(jiàn)由Malvern發(fā)出例如應(yīng)用說(shuō)明31）。圖1表1 總結(jié)cmc由URT相比TE和DLS。蛋白質(zhì)表面活性劑CMC(w / v %)從文學(xué)表面張力測(cè)量學(xué)DLS超聲共振N / A(水)PS200.00740.0040.007N / DN / A(水)PS800.00160.0020.0015N / DN / A(水)PX1880.03340.040.04N / DN / A(磷酸鹽緩沖劑)PS20N /0.0080.007N / DN / A(組氨酸緩沖區(qū))PS20N /0.0040.005N / D麥布

17、(10毫克/毫升)PS20N /0.008N / D0.008麥布(10毫克/毫升,蔗糖)PS20N /0.002N / D0.002麥布(10毫克/毫升,用生理鹽水)PS20N /0.006N / D0.006麥布(40毫克/毫升)PS20N /0.007N / D0.008麥布(10毫克/毫升)PS80N /0.01N / D0.009促紅細(xì)胞生成素PS20N /0.1N / D0.1促紅細(xì)胞生成素PS80N /0.7N / D0.7促紅細(xì)胞生成素PX188N /0.6N / D0.4人體生長(zhǎng)激素PS20N /0.4N / D0.3人體生長(zhǎng)激素PS80N /1N / D0.9BSAPS20

18、N /0.007N / D0.008BSAPS80N /N / DN / D0.04BSAPX188N /N / DN / D0.05OmalizumabPS20N /0.0080.0080.008N / A:不適用,N / D:不檢測(cè)。3.2 CMC評(píng)估蛋白質(zhì)配方 非離子表面活性劑通常用于蛋白制劑，以防止蛋白質(zhì)從空氣 - 液體界面以及液 - 固界面聚集并變性。為了保證表面活性劑有足夠的可用表面用于蛋白質(zhì)取代，所以該制劑必須具有足夠高的濃度。另一方面，我們要避免潛在的免疫原性，因此，CMC測(cè)定中的非離子表面活性劑的許多微膠粒是用于蛋白質(zhì)制劑的。由圖2可知，我們繪制的CMC測(cè)定的代表性實(shí)例為3個(gè)

19、不同的模型蛋白素（EPO，hGH單克隆抗體A）和3個(gè)共同的表面活性劑（PS20，PS80，PX188）。 CMC的完整數(shù)據(jù)如表1所示。觀察所有收集到的數(shù)據(jù)，顯而易見(jiàn)的是，DLS不允許所選擇的蛋白質(zhì)模型存在CMC，而TE和URT在所有情況下那樣。如圖2所示，通過(guò)TE和URT對(duì)PS20的實(shí)驗(yàn)，使CMC的值為0.008 w/v%。從而發(fā)現(xiàn)Mab A中相同的拐點(diǎn)。如圖2所示,U每個(gè)樣品在低濃度PS20時(shí)保持不變,然后突然變大甚至超出0.008 w / v %。這表明，PS20膠束的形成必須具有蛋白質(zhì)存在下擴(kuò)增的超聲波信號(hào)，所以迄今為止認(rèn)為膠束是可檢測(cè)的。我們應(yīng)該記得，沒(méi)有PS20形成的蛋白質(zhì)微膠粒，U

20、RT就檢測(cè)不到。因此，我們可以假設(shè)，該單克隆抗體與表面活性劑的CMC一定存在相互作用。這不僅使得CMC可用URT法測(cè)定，也直接表明，這種膠束將結(jié)合蛋白藥物無(wú)論是在表面還是在核心。在蛋白質(zhì)制劑的進(jìn)一步研究中，以上CMC的情況還需要進(jìn)行更加詳細(xì)認(rèn)真的研究。DLS不能在蛋白質(zhì)存在時(shí)測(cè)量的一個(gè)原因是，Mab A和PS20膠束的粒徑分別為6納米和7納米，（數(shù)據(jù)未示出）。這些尺寸是如此之近，使DLS不能明確區(qū)分,也不能檢測(cè)出PS20膠束的形成。同時(shí), 10毫克/毫升的Mab溶液的計(jì)數(shù)率在約6500 KCPS，而誤差卻有約100 KCPS，所以形成膠束的計(jì)數(shù)率的變化無(wú)法通過(guò)DLS檢測(cè)的計(jì)數(shù)率。 圖2代表數(shù)據(jù)

21、CMC測(cè)定研究了麥布/ PS20(得了),人體生長(zhǎng)激素/ PS80(D-F),促紅細(xì)胞生成素/ PS80(我的)和促紅細(xì)胞生成素/ PX188(J-L)配方。 左(A、D、G J),中心(B,E、H、K)和右(C、F、我,L)顯示為TE的數(shù)據(jù),分別DLS和軌道交通。 蛋白質(zhì)測(cè)試解決方案如下,麥布:10毫克/毫升麥布在20毫米組氨酸緩沖區(qū)在pH值為5.5,hGH:6毫克/毫升hGH在pH值7.0,7.5毫米磷酸鹽緩沖劑EPO:0.5毫克/毫升EPO在2毫米磷酸鹽緩沖pH值7.0。 每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都平均有超過(guò)重復(fù)分析。 通過(guò)數(shù)據(jù)表一我們可以了解到，TE和URT所確定的CMC值相當(dāng)接近。 隨著幾十年來(lái)t

22、ensiometric方法的不斷驗(yàn)證,我們可以得出這樣的結(jié)論:URT方法提供了更加合理的和可信的數(shù)據(jù)。此外，用此方法尋找到測(cè)量細(xì)節(jié)時(shí)的拐點(diǎn)似乎更加容易，換句話說(shuō)這是一個(gè)更為精確的確定各自的cmc值得方法(圖S2)。 由文獻(xiàn)可知蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移使蛋白質(zhì)含量增高會(huì)影響表面活性劑的CMC值11。 因此，我們制備的10毫克/毫升和40毫克/毫升的MabA在20mM組氨酸緩沖液中測(cè)試CMC值。其結(jié)果是，TE和URT所測(cè)的CMC值分別為0.007和0.008 w/v%（見(jiàn)表1）。所以當(dāng)我們觀察到蛋白質(zhì)濃度越來(lái)越高時(shí)CMC不得不發(fā)生轉(zhuǎn)變。然而，如果我們比較在水中表面活性劑的CMC與在蛋白質(zhì)溶液中的CMC，我們可

23、以看到CMC向著更高的趨勢(shì)發(fā)展。這種現(xiàn)象可能與兩個(gè)聚山梨醇的研究，及here.hGH和EPO制劑與聚山梨醇在0.1-0.9w/v%時(shí)反應(yīng)顯示的CMC值（用TE以及與URT）有關(guān)，這是該單抗制劑與無(wú)蛋白質(zhì)溶液的比較結(jié)果（圖2）。假設(shè)這些蛋白質(zhì)相互作用比單克隆抗體與表面活性劑的作用更強(qiáng)烈。事實(shí)上，盡管在溶液中的總絕對(duì)蛋白質(zhì)濃度偏低，但相對(duì)于被從本體溶液中抽出的用于形成膠束的游離PS分子還是偏高。從文獻(xiàn)中查到一些研究表明蛋白質(zhì)和表面活性劑的相互作用，例如，作用于hGH和EPO的衍生物之間，作用于單克隆抗體4,32-35。此外，對(duì)于EPO我們使用PX188相同的研究和相同的趨勢(shì)，用三種方法證實(shí)聚山梨醇

24、（圖2和表1）。 BSA是一種獨(dú)特的蛋白，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)存在疏水口袋，并且有許多報(bào)告證實(shí)了血清白蛋白和表面活性劑12,35-38之間的相互作用。對(duì)于BSA的制劑與PS20我們通過(guò)TE和URT測(cè)量出幾乎相同的CMC值（圖3）。因?yàn)镃MC值非常相似，所以確定PS20存在MAB A.一個(gè)值得注意的地方是，CMC的核心是非常明確的，易于使用URT，而TE則顯示出一個(gè)彎曲的圖，很難用表面張力/濃度曲線來(lái)表示。這樣非典型，非線性曲線已在文獻(xiàn)中被描述為張力測(cè)量13。對(duì)于PS80和PX188 來(lái)說(shuō)URT是判定一個(gè)獨(dú)特的CMC值唯一的方法，因?yàn)門E法失敗，DLS法不能提供任何有用的信號(hào)（圖S3）。圖3滴定研究BSA

25、 / PS20配方使用TE,DLS和URT。 BSA濃度每個(gè)樣本被調(diào)整為10毫克/毫升在100毫米檸檬酸緩沖pH值6.1與PS20樣品制備過(guò)程中。 每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都平均有超過(guò)重復(fù)分析。3.3 輔料對(duì)超聲共振技術(shù)的性能的影響 通常,我們會(huì)在生物制劑的配方中加入緩沖液和其他輔料，如糖，鹽和表面活性劑，以確認(rèn)糖或鹽是否干擾了URT的性能。CMC測(cè)定研究用單克隆抗體A和5蔗糖100mM氯化鈉的混合液反應(yīng)。從而用TE和URT分析,PS20的CMC中，Mab A與蔗糖和氯化鈉的存在為0.0020.006 w / v的，分別用圖4和表1表示（用兩種方法表示完全相同的值）。總而言之，糖和鹽的存在對(duì)URT不能形成干

26、擾作用。圖4。調(diào)查的影響存在5%的蔗糖在10 mg / mL麥布解決方案制定與20毫米組氨酸在pH值5.5和PS20緩沖區(qū)。 平均數(shù)據(jù)顯示為一式三份分析。3.4 CMC評(píng)估omalizumab Xolair配方 Omalizumab(Xolair®)作為在市場(chǎng)上可用的模型蛋白。 omalizumab的樣本是由Xolair制劑用精制水稀釋，獲得10毫克/毫升omalizumab溶液。如圖5，CMC值被0.008 w / v % 的TE和URT所決定。然而，超聲波速度增量使CMC急劇下降，相比于其他蛋白質(zhì)制劑的效力是完全不同的。此外，通過(guò)DLS所導(dǎo)出的計(jì)數(shù)率，也可用其他兩個(gè)方法確定相同的CMC值。圖5滴定研究使用10毫克/毫升omalizumab解決方案制定與1.3毫米組氨酸緩沖區(qū),精氨酸和PS20 13毫米。 每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)平均一式三份分析。 omalizumab的配制用已知蛋白質(zhì)精氨酸39的疏水區(qū)域相互作用。通過(guò)對(duì)于超聲波速度上精氨酸的效果調(diào)查，使用單克隆抗體與精氨酸的溶液來(lái)檢查這種現(xiàn)象，以及其他抗體進(jìn)行額外的滴定研究。通過(guò)滴定精氨酸到10毫克/毫升的Mab溶液中，精氨酸濃度隨著超聲波速度的增加而增加（圖6）。這表明，Mab A和精氨酸之間的相互作用可以用URT法進(jìn)行檢測(cè)。此外，將聚山梨酯20加入到10mg / mL的Mab溶液及100mM