基因工程重組蛋白的分離純化放映課件

1、基因工程重組蛋白的分離純化放映1基因工程重組蛋白的分離純化生物工程下游技術(shù)第七組馬夕堯基因工程重組蛋白的分離純化放映2意義？ 生物工程以基因工程為核心，主要產(chǎn)品為蛋白質(zhì)或多肽。通過(guò)多年的努力，我國(guó)基因工程“上游”已與國(guó)外差距縮小，但“下游”技術(shù)，尤其是蛋白質(zhì)純化處理與先進(jìn)國(guó)家相比， 仍有很大差距?；蚬こ讨亟M蛋白的分離純化放映3目錄 一獲得基因工程產(chǎn)品的特點(diǎn)一獲得基因工程產(chǎn)品的特點(diǎn) 二建立蛋白質(zhì)純化工藝的依據(jù)二建立蛋白質(zhì)純化工藝的依據(jù) 三蛋白質(zhì)分離純化應(yīng)遵順的原則三蛋白質(zhì)分離純化應(yīng)遵順的原則 四分離純化的基本過(guò)程四分離純化的基本過(guò)程 五幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的方法優(yōu)缺五幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的

2、方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比點(diǎn)對(duì)比基因工程重組蛋白的分離純化放映4一獲得基因工程產(chǎn)品的特點(diǎn) 目的產(chǎn)物在初始物料中含量低，而且往往在細(xì)胞內(nèi)。含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除了目的產(chǎn)物外，還含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽等，特別是產(chǎn)物降解酶、產(chǎn)物類似物等對(duì)目的產(chǎn)物的分離影響很大。.目的產(chǎn)物一般是大分子物質(zhì)，穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對(duì)ph值、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑等十分敏感，容易失活、變性；.種類繁多，包括有大、中、小分子，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單或復(fù)雜的有機(jī)化合物以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)。對(duì)這些大分子基因工程產(chǎn)品的純化缺乏必要的數(shù)據(jù)，似乎每種蛋白都有其獨(dú)自的純化方案，放大也往往憑經(jīng)驗(yàn)，不像抗生素等

3、小分子物質(zhì)有很多數(shù)據(jù)可指導(dǎo)放大。.應(yīng)用面廣，往往是注射用，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，無(wú)菌、無(wú)病毒、無(wú)熱原。 基因工程重組蛋白的分離純化放映5二建立蛋白質(zhì)純化工藝的依據(jù)2.1目標(biāo)蛋白的各種性質(zhì)目標(biāo)蛋白的各種性質(zhì)分子量大小，大的蛋白質(zhì)先過(guò)凝膠柱；分子形狀，球蛋白易擴(kuò)散人凝膠過(guò)濾柱填料顆粒的小孔內(nèi)，較遲洗脫出來(lái)；電荷與電荷分布，與離子交換緊密相關(guān)；疏水性，與疏水層析、反相高壓色譜有關(guān)；.溶解度，影響因素有ph值、離子強(qiáng)度、離子的性質(zhì)、濕度和溶劑極性等，可用于沉淀分離；密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法分離；配體結(jié)合能力，用于親和層析；金屬結(jié)合能力，用于鰲合有金屬離子的親和柱；翻譯后修飾，如連有糖基的蛋

4、白可用于含有外源凝集的親和柱，磷蛋白質(zhì)在某些糖基下能與鰲合有fez的柱子結(jié)合。基因工程重組蛋白的分離純化放映62. 2物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì) 包括雜質(zhì)的種類和含量、化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子量、電荷性及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性(對(duì)于熱、ph值、鹽、有機(jī)溶劑等)、溶解度、吸附性能等。基因工程重組蛋白的分離純化放映72. 3初始物料的特點(diǎn)初始物料的特點(diǎn)菌種類型及其代謝特性，包括菌種表達(dá)方式(是否以包含體形式)、副產(chǎn)物種類、產(chǎn)物類似毒素、蛋白酶種類、原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量；生產(chǎn)工藝和條件，包括滅菌方法和條件、生產(chǎn)方式(連續(xù)、批式、半連續(xù))、生產(chǎn)周期、生產(chǎn)能力、工藝控制條

5、件、因素及方式等；初始物料的各種性質(zhì)，包括產(chǎn)物濃度、雜質(zhì)種類、濃度變化、鹽的種類、濃度、溶解度、ph值、粘度等。基因工程重組蛋白的分離純化放映82.4產(chǎn)品質(zhì)量的要求產(chǎn)品質(zhì)量的要求 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用途對(duì)產(chǎn)品純度、生物活性、比活的要求。 包括允許雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì)種類和最大允許量。 以及雜質(zhì)對(duì)使用的影響、產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。 基因工程重組蛋白的分離純化放映9三蛋白質(zhì)分離純化應(yīng)遵順的原則具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。盡量不變或少受發(fā)酵工藝、條件及原材料來(lái)源的影響，使產(chǎn)品規(guī)格統(tǒng)一。必須明確嚴(yán)格控制的步驟和技術(shù)，以及允許的變化范圍。步驟之間盡量能銜接，減少工藝的步驟，同時(shí)工藝與設(shè)備也要相互

6、適應(yīng)，一般分離原理相同的技術(shù)在工藝中不要重復(fù)使用，既可減少周期，又能提高純度和得率。技術(shù)條件要溫和，溫度低，ph值適中，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。工藝過(guò)程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟或干擾產(chǎn)品質(zhì)盆。周期盡量短，因穩(wěn)定性差的產(chǎn)物隨工藝時(shí)間增加，收率、質(zhì)量會(huì)下降。目的蛋白質(zhì)選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中將目的產(chǎn)物有效地分離出來(lái)，達(dá)到較高純化倍數(shù)。工藝和技術(shù)必須快速高效、收率高、易操作、對(duì)設(shè)備條件要求低、能耗低。具有較高的安全性。在選擇處理技術(shù)，工藝和操作條件時(shí)，要確保去除有危險(xiǎn)的雜質(zhì)，保證產(chǎn)品質(zhì)量和作用安全以及生產(chǎn)過(guò)程的安全，藥品生產(chǎn)必須保證安全、無(wú)菌、病毒、熱原。基因工程重組蛋白的分離

7、純化放映10四分離純化的基本過(guò)程 樣品的固液分離與預(yù)處理樣品的固液分離與預(yù)處理基因工程藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物，分離提取這類物質(zhì)時(shí)，需要經(jīng)細(xì)胞收集細(xì)胞破碎細(xì)胞碎片分離等步驟 層析純化層析純化基因工程重組蛋白的分離純化放映11細(xì)胞破碎針對(duì)這種結(jié)構(gòu)，細(xì)胞破碎方法有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法，可以根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和活性蛋白在細(xì)胞中的位置，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?機(jī)械破碎法是常用的方法，速度快，處理量較大，不會(huì)帶人其他化學(xué)物質(zhì)，但在處理過(guò)程中產(chǎn)生熱量，必要時(shí)要采取冷卻措施，以防止目的產(chǎn)物失活?，F(xiàn)常用方法有高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法。 非機(jī)械破碎法包括酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法。酶溶法就

8、是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、膚鏈內(nèi)切酶、殼多糖酶等。溶菌酶對(duì)細(xì)菌類作用效果好，其他酶對(duì)酵母作用效果好。利用酶溶法處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇合適的酶.并確定相應(yīng)的使用次序，控制好溫度、ph值和酶量?；瘜W(xué)滲透法利用一些有機(jī)溶劑(苯、甲苯)等可以改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，從而使內(nèi)含目的產(chǎn)物有選擇地滲透出來(lái)。細(xì)胞壁是由堅(jiān)固的多聚糖、乙酸葡萄糖胺和乙酞胞壁酸所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有一定的韌性?；蚬こ讨亟M蛋白的分離純化放映12分離細(xì)胞碎片分離細(xì)胞碎片是比較困難的，可以用離心、膜過(guò)濾或雙水相分配的方法，使細(xì)胞碎片分配在一相(

9、通常為下相)而分離，同時(shí)也起部分純化作用；得到的上清液可以通過(guò)硫酸氨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀、超濾濃縮脫鹽等進(jìn)行預(yù)處理，有些可以進(jìn)行特殊處理，如加熱、三氯乙酸處理等除去雜蛋白。以枯草桿菌、畢赤酵母等作為基因工程菌的話，由于都是外分泌，直接用離心、過(guò)濾等方法進(jìn)行分離，可以加人一些助濾劑等利于分離?；蚬こ讨亟M蛋白的分離純化放映13層析純化層析純化預(yù)處理的產(chǎn)物可能仍與大量的雜質(zhì)混合在一起，這類雜質(zhì)可能有病毒、熱原質(zhì)、氧化產(chǎn)物、核酸、多聚體、雜蛋白、與目的物類似的異構(gòu)體等。進(jìn)一步純化主要依賴色譜分離方法，其優(yōu)點(diǎn)是具有多種多樣的分離機(jī)制，便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。層析純化方

10、法設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)目的蛋白和雜蛋白的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異，尤其重要的是表面性質(zhì)差異，例如表面電荷密度、對(duì)一些配基的生物學(xué)特異性、表面疏水性、表面金屬離子、糖含量、自由疏基數(shù)目、分子大小和形狀(相對(duì)分子質(zhì)量)，pl，和穩(wěn)定性等。選用的方法應(yīng)能充分利用目的蛋白和雜蛋白間上述差異離子交換色譜離子交換色譜(ion exchange chromatography , iec )疏水色譜疏水色譜(hydrophobic interaction chromatography,hic)親和色譜親和色譜(affinity chromatography, ac )。凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾色譜基因工程重組蛋白的

11、分離純化放映14五五.幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的方法幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比基因工程重組蛋白的分離純化放映15方法方法原理原理優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)特點(diǎn)特點(diǎn)基于分子大小差基于分子大小差異的分離技術(shù)異的分離技術(shù)凝膠層析（又稱凝膠過(guò)濾、分子篩層析或排阻凝膠層析（又稱凝膠過(guò)濾、分子篩層析或排阻層析）層析）利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小差異分離混合物的方法。條件溫和、簡(jiǎn)便、分離范圍廣、回收率高,對(duì)生化物質(zhì)的分離十分適宜該法上樣量有限常用在純化的最后一步，與其他分離方法( 如離子交換) 組合使用超濾超濾利用加壓膜分離技術(shù)，在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制薄膜，大分子

12、溶質(zhì)滯留，從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化超濾技術(shù)作為一種典型的膜分離技術(shù)，則具有高效率、低能耗、無(wú)相變、無(wú)需添加任何化學(xué)試劑、操作簡(jiǎn)便、條件溫和等諸多優(yōu)點(diǎn)超濾膜缺乏選擇性以及在超濾過(guò)程中易產(chǎn)生濃差極化與膜污染在超濾過(guò)程中，所用超濾膜的孔徑約為1 100 nm，截留相對(duì)分子質(zhì)量( molecular weight為 3105 1106，能用于蛋白質(zhì)、細(xì)菌、膠體、病毒、熱原、多糖等的分離透析透析透析是利用小分子經(jīng)過(guò)半透膜擴(kuò)散到水( 或緩沖液) 的原理，將無(wú)機(jī)鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)，常和鹽析、鹽溶等方法聯(lián)合使用透析結(jié)果表明，大的蛋白質(zhì)分子和小的氨基酸分子得到初步分離。必須利用不

13、同型號(hào)透析袋，通用性不好根 據(jù) 目 的 蛋 白 的 分 子 大 小 來(lái) 選擇透析袋的型號(hào)?；谌芙舛炔町惢谌芙舛炔町惖姆蛛x純化技術(shù)的分離純化技術(shù)等電點(diǎn)法等電點(diǎn)法利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低且各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同的特點(diǎn)進(jìn)行分離的方法該法具有操作簡(jiǎn)單，提取率高產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，提取率有時(shí)可達(dá)80%以上不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)可能會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整ph值。為了沉淀目的蛋白，把溶液的ph調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)即可溶劑法溶劑法溶劑提取法包括水溶液提取法和有機(jī)溶劑提取法，其中緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，最為常用; 而乙醇、丁醇和丙酮等有機(jī)溶劑具有一定的親水性

14、和較強(qiáng)的親脂性，主要用于一些脂質(zhì)結(jié)合較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶乙醇提取法溶解性能較好、溶出的水溶性雜質(zhì)少、可回收反復(fù)利用。丁醇在一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶提取中更加優(yōu)越，溶解脂的能力強(qiáng)，兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變性失活。缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性大分子易引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。雙水相萃取法雙水相萃取法它把兩種聚合物與一種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不溶性形成兩相與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有操作條件溫和、處理量大、易連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了常規(guī)萃取有機(jī)溶劑對(duì)生物物質(zhì)的變性作用，

15、在粗提過(guò)程中保持了生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)現(xiàn)已成功地應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)、抗生素微生物離子、電泳分離氨基酸等采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液 ph、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響雙水相萃取技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取指膠團(tuán)內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團(tuán)對(duì)外界有機(jī)溶劑的屏蔽作用，實(shí)現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離具有選擇性高、萃取過(guò)程簡(jiǎn)單，正萃、反萃同時(shí)進(jìn)行，能有效防止大分子失活、變性普通離子型表面活性劑可能對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生污染; 常用的離子型表面活性劑容易造成蛋白質(zhì)的變性和失活，雖然活性損失較少其影響因素主要包括表面活性劑種類以及濃度、離子強(qiáng)度、助表面活性劑、

16、水相 ph 和溫度等。 反膠團(tuán)萃取法還可提取蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和多肽。鹽溶法及鹽析法鹽溶法及鹽析法許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無(wú)機(jī)鹽則溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶，而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)又會(huì)自動(dòng)析出，該現(xiàn)象稱為鹽析。鹽溶和鹽析主要是通過(guò)影響蛋白質(zhì)分子表面的電荷而分離、純化蛋白質(zhì)鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一，常用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽。硫酸鈉具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、溶解度大等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在所指的鹽析法實(shí)際上多為硫酸銨鹽析法該法受蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、鹽的性質(zhì)、ph 及溫度等因素影響上述兩種方法分離純化蛋白質(zhì)后，都要采用凝膠過(guò)濾或透析除鹽基于電荷不同的基

17、于電荷不同的分離技術(shù)分離技術(shù)離子交換層析離子交換層析離子交換層析以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物質(zhì)的衍生物為載體，在某一 ph 條件下，這些載體帶有正電荷或負(fù)電荷，當(dāng)待分離蛋白質(zhì)分子通過(guò)載體時(shí)，離子交換使蛋白質(zhì)分子分離純化機(jī)械強(qiáng)度大、柱效高、孔徑和顆粒大小易于控制，但應(yīng)用范圍窄不能進(jìn)行快速淋洗，且分離時(shí)間長(zhǎng)，易造成生物分子的變性、失活離子交換層析是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，目前已成為蛋白質(zhì)分離純化最常用的手段電泳技術(shù)電泳技術(shù)電泳技術(shù)作為分離純化蛋白質(zhì)的手段之一，可分為變性電泳、常規(guī)電泳、等電聚焦電泳和毛細(xì)管電泳。無(wú)論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，分離度都是極高的。毛細(xì)管電泳中蛋白質(zhì)易被石英毛細(xì)管表

18、面所吸附，且一次只能測(cè)一個(gè)試樣。獲得分離的蛋白質(zhì)，均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進(jìn)行序列分析基于對(duì)配體親和基于對(duì)配體親和力差異的分離技力差異的分離技術(shù)術(shù)親和層析親和層析親和層析是一種以樣品的生物活性為依據(jù)的分離技術(shù)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過(guò)層析柱時(shí)，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結(jié)合，不被吸附的無(wú)關(guān)成分則可隨流出液通過(guò)柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開，而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強(qiáng)的底物衍生溶液洗脫目標(biāo)蛋白，即可脫離層析柱上的載體只需要一步處理即可使某種待分離的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),達(dá)到千倍以上的純化,并保持較高的活性如果目的蛋白作為藥品，處理后的產(chǎn)品中

19、存在微量染料或金屬都會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害親和層析技術(shù)是基于蛋白質(zhì)可與另一種稱做配體的分子能發(fā)生特異的可逆結(jié)合基于選擇性吸附基于選擇性吸附差異的分離方法差異的分離方法疏水層析疏水層析利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特性進(jìn)行分離。在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合，其他的雜質(zhì)蛋白則無(wú)此種性質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)初步分離與離子交換層析應(yīng)用互補(bǔ)，可以作用于分離離子交換很難或不能分離的物質(zhì)。該方法具有使蛋白質(zhì)變性、僅適合部分蛋白質(zhì)等缺點(diǎn)疏水作用層析多用于大分子蛋白質(zhì)的分離純化其他方法其他方法反相高效液相色譜法反相高效液相色譜法一種以疏水作用為基礎(chǔ)的色譜分離法具有分辨率高

20、、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)操作繁瑣、難放大、成本高，在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制分子印跡分子印跡一種識(shí)別聚合物特殊結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)，是將生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)的過(guò)程。制備容易，成本低廉，強(qiáng)穩(wěn)定性模板易流失隨著分離蛋白質(zhì)印跡聚合物的成功合成，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳是 20 世紀(jì) 80 年代問(wèn)世的一種高效液相分離技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，它已成為分析科學(xué)中最具活力的方法之一其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強(qiáng)和易自動(dòng)化等特點(diǎn)儀器設(shè)備精密，成本高被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及高分子等多個(gè)領(lǐng)域柱層析柱層析通常采用

21、固定床間歇操作方式柱層析具有很高的分離效率，且操作簡(jiǎn)單但存在著載體利用率低和過(guò)程效率低的問(wèn)題是蛋白質(zhì)產(chǎn)品分離純化的主流技術(shù)之一連續(xù)逆流操作層析連續(xù)逆流操作層析基于液液分配機(jī)理，可采用專門的逆流層析裝置。分離效率和產(chǎn)率均有提高操作量不大，過(guò)程慢對(duì)于難分離體系，逆流層析過(guò)程是一種有效分離手段基因工程重組蛋白的分離純化放映16基因工程重組蛋白的分離純化放映17基因工程重組蛋白的分離純化放映18基因工程重組蛋白的分離純化放映19基因工程重組蛋白的分離純化放映20基因工程重組蛋白的分離純化放映21基因工程重組蛋白的分離純化放映22基因工程重組蛋白的分離純化放映23基因工程重組蛋白的分離純化放映24基因工程重組蛋白的分離純化放映25基因工程