二代測(cè)序(NGS)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和應(yīng)用

1、這里為您介紹二代測(cè)序的相關(guān)流程和應(yīng)用。隨著人類基因組工程的完成，對(duì)于低花費(fèi)的測(cè)序技術(shù)的需求促進(jìn)了高通量二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。這些新的測(cè)序平臺(tái)允許進(jìn)行高通量測(cè)序， 具有廣泛的應(yīng)用：全基因組從頭測(cè)序或者重測(cè)序目標(biāo)序列重測(cè)序轉(zhuǎn)錄組分析微生物組研究基因調(diào)控研究NGS序歹y二代測(cè)序儀器有很多種組合，在通量、片段長(zhǎng)度、準(zhǔn)確度、每一輪測(cè)序成本、每百萬堿基對(duì)測(cè)序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在存在差異。從規(guī)格和初始成本的角度而言，二代測(cè)序儀器可輕松地分類為更窄的范圍，也就是所謂的“臺(tái)式測(cè)序儀”和高通量?jī)x器。臺(tái)式測(cè)序儀使得任何實(shí)驗(yàn)室都可以像使用real-time PCR 樣，自己進(jìn)行測(cè)序。這些儀器可以和一些靶標(biāo)

2、序列富集技術(shù)相結(jié)合，用在一些臨床的應(yīng)用中，其中：選定的靶標(biāo)基因用于深度分析，以檢測(cè)稀有的突變，或者檢測(cè)多樣樣本中（比如癌癥樣本）中的突變。目前，這些儀器的通量在10 Mb到7.5 Gb之間，但是隨著硬件，軟件和試劑的持續(xù)改善，通量也在穩(wěn)步增加。高通量測(cè)序儀非常適合于大量的，基因組范圍的研究，每次測(cè)序能測(cè)定600 Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺(tái)，能測(cè)定的片段長(zhǎng)度相對(duì)較短，這對(duì)于高重復(fù)性的序列和未知基因組的從頭測(cè)序就可能成為問題。與此相反，也有一些儀器能測(cè)序的片段較長(zhǎng)（達(dá)到2500 bp ），但是其精度和測(cè)序能力（90 Mb）要低很多。還有一些測(cè)序能力位于兩者之間的儀器（800 bp，

3、700 Mb）。因此，應(yīng)用決定了哪一種儀器是最合適的。有一種新的方法被稱作“納米孔測(cè)序”。這種技術(shù)中，根據(jù)一個(gè)DNA鏈通過一個(gè)合成的或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變，可以確定通過這個(gè)孔道的堿基。這理論上可以僅用一步就測(cè)序一個(gè)完整的染色體，而不需要生成新的DNA鏈。DNA測(cè)序二代DNA測(cè)序的工作流程如下：DNA樣本制備文庫構(gòu)建和驗(yàn)證文庫分子大規(guī)模平行克隆擴(kuò)增測(cè)序二代測(cè)序DNA羊本的質(zhì)量控制首先，評(píng)價(jià)基因組 DNA勺質(zhì)量是非常必要的（完整性和純度）。凝膠電泳法基因組DNA勺完整性和大小，可以用常規(guī)或者脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳（PFGE）來檢測(cè)。常規(guī)的凝膠電泳的精確度不高，這是因?yàn)榇蟮腄NA分子在凝膠

4、中移動(dòng)的時(shí)候，本質(zhì)上是用一種與尺寸無關(guān)的方式一起移動(dòng)的。但是，它仍然能夠提供完整性（大小范圍）和純度（RNA污染物在凝膠底部形成脫尾條帶）方面的有效信息。因此，它仍然是評(píng)價(jià)基因組DNA質(zhì)量的有效方法之一。注：RNA污染會(huì)導(dǎo)致DNA濃度高估，并且抑制一些下游步驟。如果能肯定有RNA虧染，則可使用去 DNase的RNase I處理樣本。分光光度測(cè)定法分光光度儀在260 nm和280 nm處讀數(shù)的比例（Ac/As。）可以用來估計(jì) DNA相對(duì)于一些吸收紫外光的雜質(zhì)（比如蛋白）的純度。純凈的DNA的 A26c/ A28c 比例大約為 1.7 - 1.9。注：想要獲得精確的 A260/A280 值，需要在

5、弱堿性的緩沖溶液中測(cè)定吸光度 （比如, 10 mM Tris ? Cl, pH 7.5）。第二個(gè)步驟是測(cè)定基因組 DNA的濃度。分光光度法DNA的濃度可以通過使用分光光度儀測(cè)定其在260 nm波長(zhǎng)的吸光度來確定。Nanodrop目前被廣泛使用，因?yàn)樗枰臉颖玖可伲? g l），并且使用方便（不需要比色皿）。為了確保結(jié)果的可靠性，讀數(shù)應(yīng)該在0.1 到 1.0 之間。注：吸光度測(cè)定不能區(qū)別 DNA和RNA RNA污染物會(huì)導(dǎo)致DNA濃度高估。但是，純凈 RNA的比值在2.0左右，而純凈的DNA大約 為1.8。因此，如果這個(gè)值為1.95，那么說明樣本里面有RNA雜質(zhì)。注：苯酚在270 - 275 n

6、m的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大的吸光度，非常接近于DNA因此苯酚能提高樣本在 260 nm附近的吸光度，從而導(dǎo)致高估DNA的產(chǎn)量和純度。熒光法熒光法使用熒光染料測(cè)定 DNA的濃度，具有特異性和靈敏性。Hoechst 33258結(jié)合到DNA上后，能增大458 nm波長(zhǎng)附近的發(fā)光強(qiáng)度，除此之外，也可以使用一些更加靈敏的熒光染料，比如 PicoGreen 染料?；?PicoGreen 染料的實(shí)驗(yàn)，比紫外吸光光度法靈敏 10， 000 倍， 而比使用Hoechst 33258染料的方法至少靈敏 400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen實(shí)驗(yàn)對(duì)雙鏈DNA的選擇性要遠(yuǎn)高于 RNA和單鏈DNA。DNA標(biāo)準(zhǔn)品

7、和樣本與熒光染料混合，并且使用熒光計(jì)檢測(cè)。將樣本的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果相比較，以確定DNA的濃度。Real-time PCR可以使用real-time PCR 技術(shù)來測(cè)定DNA羊本的數(shù)量和質(zhì)量。多重PCR技術(shù)使用引物集在多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增不同大小的片段，是檢測(cè)DNA損傷和片段化的有效質(zhì)控手段。此類技術(shù)試驗(yàn)專門測(cè)定可經(jīng)PCF擴(kuò)增，適于二代測(cè)序的DNA分子。上述提到的這些常規(guī)方法，通常不能測(cè)定的樣本中擴(kuò)增得到的 DNA的量，或者會(huì)高估了 DNA的量。與它們相比，real-time PCR更加適用于預(yù)測(cè)DNA羊本是否適合于二代測(cè)序。文庫制備對(duì)于大多數(shù)商業(yè)化的二代測(cè)序平臺(tái)，使用諸如橋式擴(kuò)增或者乳液PC

8、R方法，對(duì)文庫中的 DNA片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，以產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測(cè)序模板非常必要。通過將平臺(tái)特異性的適配子與感興趣的DNA源（比如基因組 DNA雙鏈cDNA或者PCR擴(kuò)增子等所產(chǎn)生的 DNA片段）退火，得到片段文庫。適配子序列的存在，使得我們可以對(duì)文庫分子進(jìn)行選擇性的克隆擴(kuò)增。因此，這種方法不需要像傳統(tǒng)的方法那樣， 在微生物中間體中，對(duì)基因組片段進(jìn)行微生物克隆。另外，適配子序列中，還含有平臺(tái)特異性的測(cè)序引物的結(jié)合位點(diǎn)。通常情況下，一個(gè)常規(guī)的 DNA文庫構(gòu)建方案包含四步：片段化DNA對(duì)DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)連接適配子序列（不適用于單分子測(cè)序）對(duì)可選的文庫進(jìn)行擴(kuò)增目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組DNA

9、碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動(dòng)力剪切法。這四種方法都可以用于文庫構(gòu)建，但是每一種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。核酸內(nèi)切酶消化的方法快速并且容易，但是難以精確的控制片段長(zhǎng)度的分布。另外這種方法可能會(huì)對(duì)基因 組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA勺雙鏈打斷，這種斷裂是隨機(jī)的，因此能在文庫中對(duì)DNA進(jìn)行無偏的呈遞。可以使用瓊脂糖凝膠電泳或者自動(dòng)化的DNA分析方法，對(duì)DNA片段的尺寸分布進(jìn)行控制。片段化DNA之后，需要將DNA修復(fù)，產(chǎn)生5'磷酸化的平末端 DNA以便能夠和測(cè)序平臺(tái)特異性的適配子相連接。文庫構(gòu)建的效率直接依 賴于DNA末端修復(fù)的效率和準(zhǔn)確性。末端修復(fù)混合溶液

10、將 5'或者3'的粘性末端轉(zhuǎn)變成 5'磷酸化的平末端 DNA在大多數(shù)情況下，末端修復(fù)通過T4 DNA聚合酶的5' 3'聚合酶活性和3' 5'的核酸外切酶活性完成。而 T4多聚核苷酸激酶確保平末端的DNA片段5'端的磷酸化，以便進(jìn)行后續(xù)的適配子連接。根據(jù)所使用的測(cè)序平臺(tái)，平末端 DNA片段可以直接與適配子連接，或者需要在其片段的3 '端增加一個(gè)單獨(dú)的突出的腺苷酸A,以便與平臺(tái)特異性適配子上突出的胸苷酸T相互配對(duì)。通常情況下，使用Klenow片段（具有最低的 3'到5'端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端

11、轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步驟。T4 DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復(fù)過的末端相連，然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DNA的尺寸，選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過程中可能出現(xiàn) 適配子的二聚體，它們會(huì)和與適配子連接的文庫片段共同擴(kuò)增，從而降低測(cè)序平臺(tái)對(duì)真正文庫片段測(cè)序的能力并且降低測(cè)序的質(zhì)量，因 此在測(cè)序之前，必須將它們從文庫中除去。一些測(cè)序平臺(tái)要求文庫片段的長(zhǎng)度分布在比較窄的范圍內(nèi)，以得到最佳的結(jié)果，很多時(shí)候， 這只能通過去除凝膠電泳上的相應(yīng)的片段條帶實(shí)現(xiàn)。這種方法也可以用來去除適配子二聚體。

12、完成這一步驟之后，應(yīng)該對(duì) DNA片段文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)濃度和測(cè)序文庫的適配子設(shè)計(jì)，既可以直接稀釋溶液并用于測(cè)序，也可以對(duì)文庫進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。在文庫擴(kuò)增階段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的適配子序列，通過與PCR引物的重疊，用于后續(xù)的克隆擴(kuò)增和與測(cè)序引物結(jié)合，或者提高DNA文庫的產(chǎn)量。為了得到最佳的文庫擴(kuò)增結(jié)果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文庫質(zhì)量評(píng)估方法，參見 NGS文庫質(zhì)控。為了充分利用測(cè)序能力，不同樣本得到的測(cè)序文庫可以放在一起，在同一輪實(shí)驗(yàn)中一同測(cè)序。通過將DNA片段與具有不同特征的適配子相連接，可以實(shí)現(xiàn)這一過程，即對(duì)于每一個(gè)樣本使用不同的短

13、核苷酸序列作為適配子。有一些其它的方法可以用于簡(jiǎn)化文庫構(gòu)建。有一種新方法使用轉(zhuǎn)位酶/DNA的復(fù)合物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座，以便在同一個(gè)試管中同時(shí)將DNA片段化并標(biāo)記。通過對(duì)所標(biāo)記的 DNA片段進(jìn)行有限次數(shù)的 PCF擴(kuò)增，可以構(gòu)建完整的測(cè)序文庫，這節(jié)省了操作步驟和時(shí)間。但是，使用體外 轉(zhuǎn)座構(gòu)建的文庫，與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的文庫相比，具有更高的序列偏倚。NGS文庫質(zhì)控高質(zhì)量的文庫是成功進(jìn)行第二代測(cè)序的關(guān)鍵。文庫構(gòu)建包含復(fù)雜的步驟，比如片段化樣本、修復(fù)末端、將末端腺苷?；?、連接適配子和 擴(kuò)增文庫。根據(jù)使用的平臺(tái)和文庫類型，這些步驟也會(huì)發(fā)生變化。監(jiān)控每一個(gè)步驟非常必要，包括在片段化樣本之后檢查片段的尺寸， 以及連接適

14、配子之后檢查片段的大小和濃度。文庫驗(yàn)證過程中，需要分析文庫中片段的大小和數(shù)量，這是質(zhì)控的最后步驟。評(píng)估文庫中片段的大小瓊脂糖和PAGE凝膠電泳是傳統(tǒng)的檢測(cè)片段大小的方法，它們比較耗時(shí)。最近，基于微流技術(shù)的電泳或者毛細(xì)管電泳越來越廣泛的用于檢測(cè)片段的大小和濃度。即買即用的芯片和膠盒省去了配置凝膠的步驟， 使用方便。它們具有更高的通量，并且省去了很多的手動(dòng)操作時(shí)間。除此之外，它們的靈敏度更高（對(duì)于檢測(cè)的限制更少），并且能完 全自動(dòng)化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)資料。這些儀器能同時(shí)檢測(cè)片段的大小和濃度。測(cè)定文庫中的片段數(shù)量分光光度法和熒光法參見分光光度法和熒光法電泳設(shè)備如前所述，基于微流技術(shù)的電泳和

15、毛細(xì)管電泳除了提供片段大小的信息之外，還提供了定量檢測(cè)數(shù)據(jù)。但是，電泳、分光光度法和熒光 法的一個(gè)共同的局限性是，都只檢測(cè)總的核苷酸的濃度，而非與適配子連接的分子的濃度。Real-time PCR將適配子連接到文庫分子的兩端，使得可以在平行的PCF擴(kuò)增步驟中擴(kuò)增上百萬個(gè)獨(dú)立的 DNA分子（乳液PCR或者橋式PCR。在有些儀器中，乳液PCR可以將一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到數(shù)百萬個(gè)相同序列的拷貝，并全都結(jié)合在同一個(gè)珠子上。在另一種平臺(tái)上，橋式PCR能夠?qū)⒁粋€(gè)DNA分子轉(zhuǎn)變成一個(gè)包含相同序列的多個(gè)拷貝的 DNA簇。因此，兩端連接了適配子的擴(kuò)增之后的分子，決定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及橋式 PCR中

16、產(chǎn)生的最佳DNA簇。對(duì)擴(kuò)增后的文庫中的分子進(jìn)行精確的定量檢測(cè)，對(duì)于確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數(shù)據(jù)是非常重要的。低估擴(kuò)增文庫中的分子數(shù)量，會(huì)導(dǎo)致混雜的信號(hào)以及難以解析的數(shù)據(jù)；相反地，高估分子的數(shù)量會(huì)降低結(jié)合模板的珠子或者DNA簇的產(chǎn)量，并且沒有充分利用測(cè)序能力。Real-time PCR能夠特異性的定量檢測(cè)兩端結(jié)合有適配子的DNA分子，因此能夠?qū)U(kuò)增文庫中的分子進(jìn)行高度精確的定量檢測(cè)。Real-timePCR的靈敏性非常高，可以對(duì)濃度非常低的文庫分子進(jìn)行定量檢測(cè)，即使其濃度低于傳統(tǒng)方法可以檢測(cè)的閾值。因此，這種方法能盡量減 少對(duì)文庫的擴(kuò)增，降低可能的偏倚。用于決對(duì)定量檢測(cè)的數(shù)字 PCR數(shù)字PCR

17、能夠?qū)Χ鷾y(cè)序的文庫進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)，而不需要標(biāo)準(zhǔn)品。這個(gè)技術(shù)對(duì)文庫進(jìn)行有限的稀釋，并進(jìn)行大量獨(dú)立的PCR反應(yīng)；因此，大多數(shù)反應(yīng)沒有模板，得到陰性的結(jié)果。一個(gè)單獨(dú)的陽性PCR反應(yīng)統(tǒng)計(jì)為一個(gè)單獨(dú)的模板分子。通過統(tǒng)計(jì)所有陽性PCR勺數(shù)量，能夠確定文庫分子的絕對(duì)數(shù)目。數(shù)字PCR的主要優(yōu)點(diǎn)在于：?jiǎn)畏肿拥拿舾行耘cPCR擴(kuò)增的效率無關(guān)，因?yàn)槌晒Φ臄U(kuò)增被統(tǒng)計(jì)為一個(gè)分子，而與最終產(chǎn)物的數(shù)量無關(guān)但是，這種技術(shù)需要特殊的儀器，并且花費(fèi)較高，因此尚未廣泛用于文庫定量檢測(cè)。宏基因組學(xué)MetagenomicsDNA 測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域之一是宏基因組領(lǐng)域，即從環(huán)境樣本中直接回收的遺傳物質(zhì)的非培養(yǎng)研究。宏基因組學(xué)是指一個(gè)環(huán)境樣

18、本中所包含的所有微生物基因組的功能和序列分析。這個(gè)詞匯起源于“meta” （在這里指對(duì)于基因多樣性的系統(tǒng)性理解）和“ genomics ” （對(duì)一個(gè)物種的遺傳物質(zhì)的綜合分析）。宏基因組不是一個(gè)新的學(xué)科，但由于二代測(cè)序技術(shù)所帶了的諸多可能性，宏基因組的應(yīng)用經(jīng)歷了巨大的提升。據(jù)估計(jì)，微生物中僅有 1%左右是可培養(yǎng)的，因此宏基因組學(xué)的研究能極大的拓展我們對(duì)于環(huán)境的認(rèn)識(shí)。很多年以來，“宏基因組”這個(gè)詞匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān)，比如，分析從極端的生存環(huán)境下分離得到的DNA以便發(fā)現(xiàn)能用于工業(yè)的新的生物催化劑。但是，通量的極大提高，以及所花費(fèi)的費(fèi)用和時(shí)間的降低，將這個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用擴(kuò)展到了很多其他方面。宏基因組

19、學(xué)可分成幾個(gè)領(lǐng)域，包括：病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)微生物組分析環(huán)境宏基因組學(xué)注：這并不是全面的分類，研究者可以選擇其他的分類標(biāo)準(zhǔn)。病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)和疾病的診斷相關(guān)，用于確定有疾病癥狀的患者體內(nèi)未知的病原體。這通常是極具挑戰(zhàn)性的過程，因?yàn)槲⑸锏臄?shù)量可能非常少（每毫升血液中大概有1-10個(gè)細(xì)胞）。與之相反，微生物組分析則涉及到數(shù)量巨大的微生物，比如口腔或者直腸拭子中的微生物。此時(shí)，我們的目標(biāo)是分析這些菌群的組成?？紤]到人體僅包含1%勺人類細(xì)胞而其它99%都是微生物細(xì)胞，微生物組分析在未來的診斷技術(shù)中有潛在的巨大應(yīng)用。更多細(xì)節(jié)，請(qǐng)見人類微生物組工程（）。環(huán)境宏基因組學(xué)的目標(biāo)除了包括傳統(tǒng)的

20、尋找新的生物催化劑之外，還包括研究和鑒定棲息環(huán)境。從理論上來講，環(huán)境宏基因組學(xué)有兩種不同的研究方法：全基因組分析：對(duì)所有存在的DNA進(jìn)行測(cè)序16S分析：僅對(duì)16S rRNA DNA進(jìn)行測(cè)序第一種方法只是簡(jiǎn)單的對(duì)樣本中存在的所有DNA進(jìn)行測(cè)序。這可以完整地描繪所有出現(xiàn)過的微生物，并且可能發(fā)現(xiàn)新的酶或者酶家族，以及抗生素的抗性。另一方面，這種方法需要較高的測(cè)序能力，因而，相對(duì)于第二種方法，其通量較低并且花費(fèi)較高。與此相關(guān)的進(jìn)一 步的方法正在研發(fā)。在宏基因組的應(yīng)用中，通常需要能提供較高的片段長(zhǎng)度的測(cè)序儀，這是因?yàn)橥ǔ]有參考序列可供參照。對(duì)于16S rRNA分析而言，測(cè)序儀的讀長(zhǎng)需要覆蓋整個(gè)區(qū)域（另

21、請(qǐng)參照二代測(cè)序儀）。RNA 測(cè)序RNA測(cè)序（RNA-seq）是使用深度測(cè)序技術(shù)來研究生物體轉(zhuǎn)錄組的方法。此方法在構(gòu)建合適的文庫之后，對(duì)樣本中的RNA直接測(cè)序，得到豐富的數(shù)據(jù)集以進(jìn)行分析。這項(xiàng)技術(shù)的高靈敏度和高分辨率使得它成為研究整個(gè)轉(zhuǎn)錄情形的有價(jià)值的工具。數(shù)據(jù)的定量性以及測(cè)序技術(shù)的高動(dòng)態(tài)范圍使得其對(duì)基因表達(dá)的分析具有高度的靈敏性。數(shù)據(jù)的單個(gè)堿基的分辨率提供了關(guān)于單核苷酸多態(tài)性（SNP）、選擇性剪接、外顯子/內(nèi)含子邊界、非翻譯區(qū)及其它元件的詳細(xì)信息。除此之外，RNA-seq不需要預(yù)先知道參考序列，這使得從頭的轉(zhuǎn)錄組分析和新的變異體和突變體的檢測(cè)成為可能。RNA-seq是研究轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)大、革命性方

22、法，但是使用這種技術(shù)需要非常仔細(xì)以獲得最高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。RNA-seq中需要考慮的因素第一個(gè)需要考慮的因素是樣本富集?？俁NA通常只包含比例很少的編碼 RNA或者功能RNA樣本中大部分 RNA是核糖體RNA（ rRNA大約占到了總RNA的 80 - 90%和較少的轉(zhuǎn)運(yùn) RNA （tRNA）。為了避免將80 - 90%勺測(cè)序資源用在重復(fù)的rRNA序列上，通常在測(cè)序之前，需要從樣本中去除rRNA這通?？梢酝ㄟ^特定的消耗rRNA實(shí)現(xiàn)，也可以通過使用寡聚胸腺嘧啶富集技術(shù)選擇性富集Poly A實(shí)現(xiàn)。消耗rRNA的方法可以同時(shí)保留編碼 RNA和非編碼RNA（項(xiàng)非常重要的研究?jī)?nèi)容）的信息，而 Poly A富集

23、則僅保留了編碼 mRNA Poly A富集可能 會(huì)丟掉特定的RNA和具有高轉(zhuǎn)換率的 RNA有一些其他的方法可以避免rRNA的影響，比如選擇性降解大量轉(zhuǎn)錄物，或者不擴(kuò)增rRNA的擴(kuò)增技術(shù)。但是這些方法不像rRNA消耗或者poly A 富集那么常見，并且可能扭曲轉(zhuǎn)錄物表征的正常水平。另外一個(gè)需要考慮的因素是要研究的 RNA的大小。RNA轉(zhuǎn)錄物跨越比較大的大小范圍；與常規(guī)的 RNA分析相比，關(guān)注小 RNA的實(shí)驗(yàn)（比如 microRNA或者長(zhǎng)度范圍在15 - 35bp的RNA，需要特別的純化和文庫構(gòu)建方案。大多數(shù)其他大小的RNA片段可以同時(shí)測(cè)序（RNA測(cè)序的常用步驟之一是將 RNA分割成普通長(zhǎng)度，比如

24、 200 - 300 nt長(zhǎng)度的片段）。RNA-seq測(cè)序操作步驟一旦確定了移除核糖體的方法和要研究的片段大小，就可以將RNA勾建成一個(gè)文庫。對(duì)于大多數(shù)測(cè)序儀器而言，這包括首先將RNA丁碎成片段，其次通過逆轉(zhuǎn)錄方法構(gòu)建雙鏈cDNA在后續(xù)的文庫構(gòu)建過程中，這些雙鏈的cDNA被當(dāng)作普通的基因組DNA來對(duì)待。如果想要保留RNA的直接信息（鏈型），必須使用修改過的文庫構(gòu)建方案，比如將mRNA與連接適配子直接相連，或者標(biāo)記cDNA的一條鏈以便在測(cè)序之前移除。在進(jìn)行測(cè)序計(jì)劃過程中，需要考慮三個(gè)主要的因：測(cè)序深度、讀長(zhǎng)和是否使用雙端測(cè)序數(shù)據(jù)。測(cè)序深度可以提供RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度信息，并且較大的測(cè)序深度使得對(duì)于

25、稀有轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)更加靈敏。讀長(zhǎng)也很重要，因?yàn)檩^長(zhǎng)的讀段對(duì)于檢測(cè)剪接事件更加靈敏（內(nèi)含子-外顯 子邊界，外顯子-外顯子邊界）。雙端測(cè)序數(shù)據(jù)能提供更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的信息，特別是相互分隔的較遠(yuǎn)的外顯子。一般而言，從頭分析以及尋找新的結(jié)構(gòu)變異要求較高的測(cè)序深度和讀長(zhǎng)，并且會(huì)得益于雙端測(cè)序數(shù)據(jù)。典型的測(cè)序應(yīng)用包含 100 - 200 M片段，長(zhǎng)度為2 x50-100 bp 。與之相反，表達(dá)分析得益于較高的測(cè)序深度，但是讀長(zhǎng)和雙端測(cè)序數(shù)據(jù)則對(duì)結(jié)果的改善作用較小。這方面應(yīng)用的一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)包含10 - 30 M片段，讀長(zhǎng)為1 x 35 - 100 bp。基因調(diào)控研究二代測(cè)序技術(shù)也是研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)有力的

26、工具。比如ChlP-seq技術(shù)(染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序)可以用于分析蛋白-DNA的相互作用。二代測(cè)序技術(shù)也能用于確定基因組的全局甲基化模式。ChlP-Seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) (ChlP) 是用于研究轉(zhuǎn)錄因子和修飾組蛋白基因調(diào)控機(jī)制的強(qiáng)大、多功能方法。這種技術(shù)用于確定活細(xì)胞中染色質(zhì) 上那些與轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子、修飾組氨酸、染色質(zhì)重塑蛋白或者其它的核因子相互結(jié)合的區(qū)域。整個(gè)操作過程非常耗時(shí)，包含了很多步驟和變量，每一個(gè)步驟都需要研究者根據(jù)自己的模型體系進(jìn)行優(yōu)化。將細(xì)胞與甲醛交聯(lián)之后，將染色質(zhì)中共價(jià)相連的基因組DNA和核因子復(fù)合物分離出來，然后經(jīng)過超聲波處理，剪切成可以處理的大小?？贵w與目標(biāo)核蛋

27、白特異性免疫共沉淀時(shí)，也將與這些核蛋白特異性結(jié)合的基因組DNA也沉淀下來了。去除化學(xué)交聯(lián)并經(jīng)過核酸純化處理的這些DNA可用于測(cè)序、基于微陣列的基因組雜交或者PCRT增。ChIP與二代測(cè)序技術(shù)聯(lián)用(ChlP-Seq )可研究與感興趣蛋白相結(jié)合的位點(diǎn)在基因組的范圍內(nèi)的分布。與微陣列分析(ChlP-Chip)相比，ChlP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率，動(dòng)態(tài)范圍和基因組覆蓋度，因而它對(duì)于DNA結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)具有超級(jí)的靈敏度和準(zhǔn)確度。另外， ChIP-Seq 技術(shù)通常只要很少的起始樣本輸入量，并且不需要雜交探針，具有較高的靈活性，任何 測(cè)序過基因組的物種都可以使用這種方法進(jìn)行研究。高效的ChlP-

28、Seq過程需要優(yōu)化幾個(gè)關(guān)鍵的變量。首先，甲醛交聯(lián)的溫度和時(shí)間需要優(yōu)化。如果蛋白和DNA交聯(lián)的過于緊密，則在測(cè)序之前無法將染色質(zhì)有效地打碎成片段，并且去除交聯(lián)也會(huì)遇到困難。通常情況下，最好以在37 ° C下與1%勺甲醛共培育10分鐘起始，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化。有幾種不同的方法可以將染色質(zhì)打成碎片，比如超聲波和酶消化(比如使用微球菌核酸酶)。如果使用二代測(cè)序技術(shù)來分析免疫共沉淀的DNA染色質(zhì)碎片的大小應(yīng)在大約100 - 300核苷酸長(zhǎng)度范圍內(nèi)，并且每一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中(細(xì)胞的類型、組織的類型)，將染色質(zhì)打碎成片段的參數(shù)也需要嚴(yán)格優(yōu)化。ChlP實(shí)驗(yàn)的成功與否取決于所使用的抗體的量和特異性。

29、最好選用能從多家抗體廠商處獲得的，經(jīng)過ChlP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體。為了確定抗體能特異性地沉淀目標(biāo)蛋白，可以使用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)核提取物。如果在結(jié)果中，僅能觀察到一條特定大小的條帶，則可認(rèn)為該抗體 是特異性的。使用選定的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，然后通過蛋白印跡分析技術(shù)確定抗體是否能特異性的沉淀目標(biāo)蛋白。如果這樣的實(shí)驗(yàn)失 敗了，那么還可以將選定的抗體與培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。如果僅有細(xì)胞核顯色，則說明抗體至少能特異性的識(shí)別一種位于細(xì)胞 核內(nèi)并可結(jié)合到DNA上面的蛋白。根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度，經(jīng)過驗(yàn)證的抗體的量以及用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必須經(jīng)過優(yōu)化，以便獲得足夠的DNA進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于識(shí)別組蛋白和組蛋白修

30、飾的抗體而言，每一次免疫共沉淀反應(yīng)大概需要100，000到1百萬個(gè)細(xì)胞中的染色質(zhì)。如果轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的動(dòng)態(tài)性較高或者與組蛋白相比，僅在有限的基因組位點(diǎn)上結(jié)合，那么實(shí)驗(yàn)就需要更多的染色質(zhì)。為避免多余的抗體與非目標(biāo)蛋白和染色質(zhì)的非特異性結(jié)合，同時(shí)保證能沉淀足夠多的目標(biāo)蛋白，每一次免疫共沉淀反應(yīng)使用的抗體的數(shù)量也非常重要。通常而言，1-10 gg的抗體即可得到合理的結(jié)果?？梢杂脤?duì)照反應(yīng)來比對(duì) ChlP 反應(yīng)的特異性。在平行的 ChlP 反應(yīng)中，使用同樣數(shù)量的染色質(zhì)，可以使用同型的對(duì)照抗體或者沒有抗體的 珠子用來比照抗體和珠子與蛋白和染色質(zhì)的非特異性的結(jié)合。通過比較陰性對(duì)照樣本和ChlP樣本中在

31、特定位點(diǎn)沉淀的DNA的量，能計(jì)算這個(gè)位點(diǎn)的富集因子。但是，在這種免疫共沉淀對(duì)照實(shí)驗(yàn)中得到的沉淀物的量通常很少，不足以提供足夠的片段進(jìn)行二代測(cè)序。因此，ChlP-Seq 實(shí)驗(yàn)通常使用輸入對(duì)照樣本作比對(duì)。在這種情況下，每個(gè) ChlP 反應(yīng)中通常有 1%交聯(lián)并且打碎的染色質(zhì)被用來去除交聯(lián)并且與 沉淀的樣本一同純化并進(jìn)行后續(xù)的深度測(cè)序。這使得我們可以比對(duì)由于打碎染色質(zhì)所引起的偏移，這些偏移表現(xiàn)在染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)，DNAT增，測(cè)序，拷貝數(shù)量的變化，以及測(cè)定基因組區(qū)域的能力。在沉淀的DNA碎片去除交聯(lián)和純化之后，建議使用real-time PCR 技術(shù)確認(rèn)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的基因組位點(diǎn)的回收和富集效果。通過比較輸入對(duì)照組與 Chip樣本的qPCR結(jié)果，可以計(jì)