微生物檢測技術實驗

1、海 南 大 學實 驗 教 學 自 編 教 材微生物檢測技術實驗農學院生物技術系編實驗一 細菌學鑒定中常用的生化反應實驗一、目的要求了解細菌鑒定中常用的生化反應及其原理。二、基本原理微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物。生化反應常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。IMVIC是吲哚（indol test）、甲基紅（methyl red test）、伏普（Voges-Prokauer test）和檸檬酸鹽（citrate test）四個試驗的縮寫，i是在英文中為了發(fā)音方便而加上去的。這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產

2、氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），多用于水的細菌學檢查。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中若超過一定數量，則表示受糞便污染。產氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水時要將兩者分開。硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。吲哚試驗是用來檢測吲哚的產生。有些細菌能產生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學檢測的指標。色氨酸水解反應：吲哚與對二甲基苯甲醛反應：大腸桿菌吲哚反應陽性，產氣腸桿菌為陰性。甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，

3、如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產生酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基的甲基紅指示劑由橘黃色（pH6.3）變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產生有機酸，但這個試驗在區(qū)分大腸桿菌和產氣腸桿菌上仍然是有價值的。這兩個細菌在培養(yǎng)的早期均產生有機酸、但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此大腸桿菌為陽性反應，產氣腸桿菌為陰性反應。伏普試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性未端產物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧

4、化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏普反應陽性；不產生紅色化合物者為陰性反應。有時為了使反應更為明顯，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。其化學反應過程如下：產氣腸桿菌為陽性反應，大腸桿菌為陰性反應。檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用。有些細菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產氣腸桿菌；而另一些細菌則不能利用檸檬酸鹽，如大腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后，產生堿性化合物，使培養(yǎng)基的pH升高，當加人1溴麝香草酚藍指示劑時，培養(yǎng)基就會由綠色變?yōu)樯钏{色。溴麝香草酚藍的指示范圍為：pH小于6.0時呈黃色，pH在6.07.0時為綠色，pH大于 7.6時呈藍色

5、。硫化氫試驗是檢測硫化氫的產生，也是用于腸道細菌檢查的常用生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物以半胱氨酸為例，其化學反應過程如下：大腸桿菌為陰性，產氣腸桿菌為陽性。三、器材1、菌種：大腸桿菌，產氣腸桿菌。2、培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基，醋酸鉛培養(yǎng)基。蛋白胨水培養(yǎng)基:蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.6,121滅菌20min。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，水1000mL，調pH 7.2，分裝，1

6、21滅菌20min。檸檬酸鹽培養(yǎng)基：NH4H2PO4 1g，K2HPO4 1g，NaCl 5g，MgSO4 0.2g，檸檬酸鈉2g，瓊脂15-20g，水1000mL，1%溴香草酚藍乙醇液 10mL，將上述試劑加熱溶化后，調pH 6.8，然后加入指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾，分裝，121，20min滅菌后制成斜面。注意不要過堿，以黃綠色為準。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH 7.0-7.2,121滅菌20min。醋酸鉛培養(yǎng)基：pH 7.4的牛肉膏蛋白胨瓊脂100mL，硫代硫酸鈉0.25g，10%的醋酸鉛水溶液1mL。將牛肉膏蛋白胨

7、瓊脂加熱溶化，待冷至60時加入硫代硫酸鈉0.25g，并調pH7.2，分裝于三角瓶中，115滅菌15min，取出后冷至60，加入10%的醋酸鉛水溶液1mL，混勻導入試管。在配制檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基時，其pH不要偏高，以淺綠色為宜。吲哚試驗中用的蛋白胨水培養(yǎng)基中宜選用色氨酸含量高的蛋白胨，如用胰蛋白水解素得到的蛋白胨較好。3、溶液或試劑：甲基紅指示劑，40KOH，5萘酚，乙醚，吲哚試劑等。四、操作步驟1、接種與培養(yǎng)（1）用接種針將大腸桿菌、產氣腸桿菌分別穿刺接入2支醋酸鉛培養(yǎng)基中（硫化氫試驗），置37培養(yǎng)48 h。（2）將上述二菌分別接種于2支蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗），2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲

8、基紅試驗和伏普試驗），2支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基和2支醋酸鉛培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)2 d。2、結果觀察（1）硫化氫試驗：培養(yǎng)48 h后觀察黑色硫化鉛的產生。（2）吲哚試驗：于培養(yǎng)2d后的蛋白胨水培養(yǎng)基內加34滴乙醚，搖動數次，靜置l3min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加人2滴吲哚試劑，在乙醚和培養(yǎng)物之間產生紅色環(huán)狀物為陽性反應。配制蛋白胨水培養(yǎng)基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋自酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量較高。（3）甲基紅試驗：培養(yǎng)2d后，將1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內加入甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽勝，變黃色者為陰性。注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現假陽性反應。（4）伏

9、普試驗：培養(yǎng)2 d后，將另 1支葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)物內加人510滴40KOH，然后加入等量的 5萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫 1530min，以加快反應速度。若培養(yǎng)物呈紅色者，為伏普反應陽性。（5）檸檬酸鹽試驗：培養(yǎng)48 h后觀察檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上有無細菌生長和是否變色。藍色為陽性，綠色為陰性。五、實驗報告1、結果將實驗結果填人下表?！啊北硎娟栃苑磻?，“一”表示陽性反應。菌名IMViC試驗硫化氫試驗吲哚試驗甲基紅試驗伏普試驗檸檬酸鹽試驗大腸桿菌產氣腸桿菌對照2、思考題（1）討論IMViC試驗在醫(yī)學檢驗上的意義。（2）解釋在細菌培養(yǎng)中吲哚檢測的化學原理，為什么在這個試驗中用吲哚的存

10、在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？（3）為什么大腸桿菌是甲基紅反應陽性，而產氣腸桿菌為陰性？這個試驗與伏普試驗最初底物與最終產物有何異同處？為什么會出現不同？（4）說明在硫化氫試驗中，醋酸鉛的作用?？梢杂媚姆N化合物代替醋酸鉛？實驗二 水中細菌總數的測定一、目的要求1、學習水樣的采取方法和水樣細菌總數測定的方法。2、了解水源水的平板菌落計數的原則。二、基本原理本實驗應用平板菌落計數技術測定水中細菌總數。由于水中細菌種類繁多，它們對營養(yǎng)和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落，計算出來的水中細菌總

11、數僅是一種近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。三、器材1、培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，滅菌水。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH 7.0-7.2,121滅菌20min。2、儀器或其他用具：滅菌三角燒瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管，滅菌試管等。四、操作步驟1、水樣的采?。?）自來水：先將自來水龍頭用火焰燒灼 3min滅菌，再開放水龍頭使水流 5min后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。（2）池水、河水或湖水：應取距水面1015 cm的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻

12、璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出，最好立即檢查，否則需放入冰箱中保存。2、細菌總數測定（1）自來水 用滅菌吸管吸取 lmL水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。共做兩個平皿。 分別傾注約15 mL已溶化并冷卻到45左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。 另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15 mL，作空白對照。 培養(yǎng)基凝固后，倒置于37溫箱中，培養(yǎng)24 h，進行菌落計數。兩個平板的平均菌落數即為 lmL水樣的細菌總數。（2）池水、河水或湖水等 稀釋水樣：取 3個滅菌空試管，分別加人 9 mL滅菌水。取 lmL水樣注入第一管9 mL滅菌水內

13、、搖勻，再自第一管取lmL至下一管滅菌水內，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10-1、10-2與10-3。稀釋倍數看水樣污濁程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數在30300個之間的稀釋度最為合適，若三個稀釋度的菌數均多到無法計數或少到無法計數，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數。一般中等污穢水樣，取10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀釋度，污穢嚴重的取10-2、10-3、10-4三個連續(xù)稀釋度。 自最后三個稀釋度的試管中各取 lmL稀釋水加人空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。 各傾注 15mL已溶化并冷卻至45左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，立即放在桌上搖勻。 凝固后倒置于 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。

14、3、菌落計數方法（1）先計算相同稀釋度的平均菌落數。若其中一個平板有較大片狀菌苔生長時，則不應采用，而應以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時，則可將此一半的菌落數乘2以代表全平板的菌落數，然后再計算該稀釋度的平均菌落數。（2）首先選擇平均菌落數在30300之間的，當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，則以該平均菌落數乘其稀釋倍數即為該水樣的細菌總數（見表21，例1）。（3）若有兩個稀釋度的平均菌落數均在30300之間，則按兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小于2，應采取兩者的平均數；若大于2，則取其中較小的菌落總數（

15、見表21，例2及例3）。（4）若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數（見表21，例4）。（5）若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數（見表21，例5）。（6）若所有稀釋度的平均菌落數均不在30300之間，則以最近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數（見表21，例6）。表21 計算菌落總數方法舉例五、實驗報告1、結果（1）自來水平板菌落數1mL自來水中細菌總數12（2）池水、河水或湖水等稀釋度101102103平板121212菌落數平均菌落數計算方法細菌總數/mL2、思考題（1）從自來水的細菌總數結果來看，是否合乎飲用

16、水的標準？（2）你所測的水源水的污穢程度如何？（3）國家對自來水的細菌總數有一標準，那么各地能否自行設計其測定條件（諸如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等）來測定水樣總數呢？為什么？實驗三 多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群一、目的要求1、學習測定水中大腸菌群數量的多管發(fā)酵法。2、了解大腸菌群的數量在飲水中的重要性。二、基本原理多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗、平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分。l、初（步）發(fā)酵試驗發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白陳液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣。為便于觀察細菌的產酸情況，培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細菌產酸后，培養(yǎng)

17、基即由原來的紫色變?yōu)辄S色溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用。水樣接種于發(fā)酵管內，37下培養(yǎng)，24 h內小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產氣；此外產酸不產氣的也不能完全說明是陰性結果，在量少的情況下地可能延遲48h后才產氣，此時應視為可疑結果，因此，以上兩種結果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。48 h后仍不產氣的為陰性結果。2、平板分離平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂（遠藤氏培養(yǎng)基，Endos medium）或伊紅美藍瓊脂（eosin methylene blue agar，EMB

18、 agar），前者含有堿性復紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產生的酸和乙醛即和復紅反應，形成深紅色復合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長。伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產生與遠藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發(fā)酵管 24 h內產酸產氣和 48 h產酸產氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。3、復發(fā)酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經涂片染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌者，通過此試驗再

19、進一步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，經 24 h培養(yǎng)產酸又產氣的，最后確定為大腸菌群陽性結果。三、器材1、培養(yǎng)基：乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內有倒置小套管），伊紅美藍瓊脂平板，滅菌水。乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1.6的溴甲酚紫乙醇液1mL，水1000mL，將蛋白胨，牛肉膏，乳糖及NaCl加熱溶于1000mL水中，調pH7.2至7.4，加入溴甲酚紫乙醇液1mL，混勻，分裝，115滅菌20min。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，乳糖10g，NaCl 5g，K2HPO4 2.0g，2%伊紅水溶液20-30mL，0.

20、65%美藍水溶液10-15mL，瓊脂20g，水補足1000mL，pH7.4,121滅菌20min。2、儀器或其他用具：載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。四、操作步驟1、水樣的采取同實驗二。2、自來水檢查（1）初（步）發(fā)酵試驗：在2個含有50 mL三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加人100mL水樣。在10支含有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10mL水樣（如圖31）?；靹蚝?，37培養(yǎng) 24 h，24 h未產氣的繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h。（2）平板分離：經24 h培養(yǎng)后，將產酸產氣及48 h產酸產氣的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于37下培養(yǎng)1824 h，將

21、符合下列特征的菌落的一小部分，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。 深紫黑色、有金屬光澤。 紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。 淡紫紅色、中心顏色較深。（3）復發(fā)酵試驗：經涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落l3個，37培養(yǎng) 24 h，結果若產酸又產氣，即證實有大腸菌群存在。證實有大腸菌群存在后，再根據初發(fā)酵試驗的陽性管（瓶）數查表32，即得大腸菌群數。圖31 多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的操作步驟和結果解釋3、池水、河水或湖水等的檢查（1）將水樣稀釋成10-1與10-2。（2） 分別吸取 lmL 1

22、0-2、10-1的稀釋水樣和 lmL原水樣，各注入裝有 10mL普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10mL和100mL原水樣，分別注入裝有5mL和50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管（瓶）中。（3）以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗。（4）將100、10、1、0.1（10-1）mL水樣的發(fā)酵結果查表32，將10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）mL水樣的發(fā)酵管結果查表33，即得每升水樣中的大腸菌群數。表31 大腸菌群檢數表接種水樣總量300mL（100mL2份，10mL10份）表32 大腸菌群檢數表接種水樣總量111.1mL（100mL、10mL、1mL、0.1mL各1份）“”大腸菌群發(fā)酵陽性；“”大腸菌群發(fā)酵陰性表33 大腸菌群檢數表接種水樣總量11.11mL（10mL、1mL、0.1mL、0.01mL各1份）“”發(fā)酵陽性；“”發(fā)酵陰性五、實驗報告1、結果（1）自來水 100mL水樣的陽性管數是多少？10mL水樣的陽性管數是多少查表31得每升水樣中大腸菌群數是多少？（2）池水、河水或湖水陽性結果記“；陰性結果