實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)書醫(yī)學(xué)衛(wèi)生

1、1 不同類型鉛中毒大鼠模型的神經(jīng)系統(tǒng)毒性學(xué)習(xí)記憶障礙機(jī)制比較研究 摘要 大量的流行病學(xué)調(diào)查和研究表明鉛中毒可誘發(fā)腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)損傷特別是對(duì)腦發(fā)育的影響備受關(guān)注大家公認(rèn)為發(fā)育大腦更容易受到鉛的損害國(guó)內(nèi)外有許多關(guān)于鉛中毒對(duì)腦發(fā)育影響機(jī)制研究但其物質(zhì)基礎(chǔ)如何仍未完全明確。鉛中毒對(duì)成熟大腦影響的報(bào)道相對(duì)較少有關(guān)鉛中毒對(duì)發(fā)育大腦和成熟大腦影響的機(jī)制差異并沒有系統(tǒng)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)采用幼年和成年的大鼠以腹腔注射和自由飲用醋酸鉛溶液的方式給藥分別選用幼年和成年大鼠分別建立了急性和慢性鉛中毒模型造模成功后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)了解大鼠的記憶和識(shí)別能力處死大鼠后采用病理和免疫組化方法研究不同類型鉛中毒大鼠中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)的神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況了解神經(jīng)元環(huán)路的變化情況。采用原子吸收測(cè)定、生化試劑測(cè)定、酶聯(lián)免疫法方法和分子生物學(xué)技術(shù)研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化和抗氧化防御系統(tǒng)了解活性氧的產(chǎn)生情況和氧化應(yīng)急的損傷情況同時(shí)分析腦組織中鈣離子代謝、多種激酶的活性及主要神經(jīng)遞質(zhì)和信號(hào)分子的變化情況了解鉛中毒對(duì)大腦內(nèi)的代謝和信息傳遞的影響。通過一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)不同類型鉛中毒大鼠的行為學(xué)解剖組織學(xué)、代謝學(xué)和信息學(xué)等多方面比較尋找兩種大鼠鉛中毒模型的差異進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的進(jìn)一步研究尋找可能的新機(jī)制為鉛對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機(jī)制進(jìn)一步研究提供理論支持同時(shí)為排鉛藥物篩選研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 鉛中毒大鼠大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 2 不同類型鉛

3、中毒大鼠模型的神經(jīng)系統(tǒng)毒性學(xué)習(xí)記憶障礙機(jī)制比較研究 一、項(xiàng)目可行性報(bào)告 一立項(xiàng)的背景和意義 鉛對(duì)環(huán)境的污染日益加劇已由職業(yè)環(huán)境擴(kuò)展到日常環(huán)境.實(shí)際上隨著我國(guó)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展特別是汽車保有量和房屋裝修業(yè)的迅速增加每個(gè)城市都面臨環(huán)境中的鉛負(fù)荷不斷上升的危險(xiǎn)而鉛可通過皮膚、呼吸道、消化道進(jìn)入人體誘發(fā)腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)損傷1。1999年8月全國(guó)部分地區(qū)和城市兒童血鉛水平調(diào)查平均38.8的兒童血鉛水平超過100 g·dl-1。也就是說我國(guó)城市兒童中有約40左右受到鉛中毒的威脅2。近年人們生活條件提高了但鉛中毒事件任然嚴(yán)重國(guó)內(nèi)外常常報(bào)道鉛超標(biāo)或中毒的事件34美國(guó)、加拿大等均報(bào)道交通警察血鉛超

4、標(biāo)嚴(yán)重4。浙江省近年不同地方報(bào)道中毒的事件 2005年浙江中部的東陽、蘭溪、永康、義烏、浦江、紹興等市縣的錫箔產(chǎn)業(yè)的大量從業(yè)人員和上千名兒童發(fā)生鉛中毒事件2011年在浙江臺(tái)州和德清的電池生產(chǎn)廠引起周圍數(shù)百位居民鉛中毒事件。 由此可見鉛中毒已經(jīng)是比較嚴(yán)重的社會(huì)問題探索鉛中毒的毒性機(jī)理研究防治措施和篩選相關(guān)藥物有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。在鉛中毒對(duì)人體的危害方面研究發(fā)現(xiàn)5-6鉛能引起貧血腦發(fā)育、肝、腎功能損害降低免疫功能致癌等作用。其中對(duì)腦的影響最為嚴(yán)重由于腦是鉛最敏感的器官微量鉛即可引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙嚴(yán)重中毒可引起中樞神經(jīng)細(xì)胞退行性改變導(dǎo)致腦病兒童可導(dǎo)致智力低下認(rèn)知缺陷5因此鉛中毒的很多深入研究是

5、關(guān)于腦部的毒性損害。 鉛對(duì)腦的損害集中在一些特殊的區(qū)城。最首要的部位包括大腦皮質(zhì)的額前區(qū)海馬回和小腦。這些區(qū)域的神經(jīng)元如顆粒細(xì)胞和小球周細(xì)胞等主要參與學(xué)習(xí)記憶而在這些區(qū)域的膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)環(huán)路如隔-海馬、斜角帶-嗅球、meynert基底核nbm-新皮層等具有維持正常的學(xué)習(xí)記憶功能7-8。星狀膠質(zhì)細(xì) 3 胞參與維持正常的學(xué)習(xí)記憶功能9。鉛中毒的一些特征性的臨床表現(xiàn)有可能正是與這種特殊的解剖部位的特點(diǎn)密切相關(guān)。如大腦皮質(zhì)額前區(qū)的損傷可以引起認(rèn)知功能的損害并可引起進(jìn)行性的注意力分散10。 大量研究顯示11鉛引起氧化應(yīng)急損傷一方面鉛作為氧自由基的啟動(dòng)劑而誘發(fā)氧自由基的產(chǎn)生鉛通過線粒體產(chǎn)生活性氧同

6、時(shí)還可抑制氧自由基的清除酶sodcat活力使血肝和腦中mda含量增高。另一方面鉛作為琉基的親合物質(zhì)易于與含疏基的酶gshpxg6pdgr或物質(zhì)gsh結(jié)合而使相應(yīng)酶活力下降和琉基耗竭因此使機(jī)體的抗氧化能力下降進(jìn)一步增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化的毒理效應(yīng)。yiin和lin等人的研究證明12鉛能顯著增加油酸亞油酸和花生四烯酸中mda的含量且脂肪酸中雙鍵數(shù)目越高其相應(yīng)體系中mda含量也越高。鉛能誘導(dǎo)花生四烯酸的聚集從而增加細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的敏感性13。鉛在體外能與磷脂雙分子膜緊密結(jié)合14。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明15脂質(zhì)過氧化水平的增加和磷脂水平的下降與腦區(qū)的鉛濃度顯著相關(guān)。因此轉(zhuǎn)變的膜脂質(zhì)成分可導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性滲透能力的變

7、化使細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)受損細(xì)胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放凋亡相關(guān)物質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 鉛可取代鈣的作用影響細(xì)胞內(nèi)多種激酶的活性等多個(gè)環(huán)節(jié)鉛可以通過與鈣離子競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)干預(yù)突觸前終端鈣離子而對(duì)ltp起作用16。還可作用于突觸后膜上電壓依賴性的鈣離子通道阻斷鈣離子電流6鉛可以激活蛋白激酶cpkc系統(tǒng)引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的升高而胞內(nèi)鈣離子超載是神經(jīng)細(xì)胞損傷死亡的重要原因。鉛還作用于鈣調(diào)素-蛋白激酶和camp-蛋白激酶等使鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶camk失活517減少erk2活性維持時(shí)間降低erk2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白和信號(hào)蛋白等發(fā)揮其對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)和學(xué)習(xí)記憶的形成。鉛還可以通過抑制腺苷酸環(huán)化酶間接抑

8、制蛋白酶磷酸化過程從而影響學(xué)習(xí)記憶過程18。鉛可以破壞星形膠質(zhì)細(xì)跑19。另外的幾項(xiàng)研究表明 2021鉛模擬鈣樣作用激活nmda受體復(fù)合物、活化nos引發(fā)自由基氣體分子no合成增加及自由基連鎖反應(yīng)導(dǎo)致組織細(xì)胞的變性與壞死同時(shí)nmda受體復(fù)合物的激活與n0對(duì)sgc的活化引起胞內(nèi)camp水平升高進(jìn)而刺激突觸前膜興奮性氨基酸釋放異常導(dǎo)致神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)異常表現(xiàn)出神經(jīng)行為異常。 總之有關(guān)鉛對(duì)腦損傷機(jī)制方面國(guó)內(nèi)外學(xué)者目前已經(jīng)達(dá)成廣泛的共識(shí)5-6 4 鉛通過誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)過氧化物含量升高破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)通過影響鈣離子代謝、細(xì)胞內(nèi)多種激酶的活性等多個(gè)環(huán)節(jié)影響腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞和星狀細(xì)胞的正常功能并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的過度表

9、達(dá)。 這個(gè)機(jī)制解釋了許多鉛致腦損傷的毒理原理但仍有一些機(jī)理任未明確如神經(jīng)環(huán)路受損便出現(xiàn)嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙的問題雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為鉛中毒可引起嚴(yán)重的認(rèn)知障礙但這種神經(jīng)行為障礙是否與基底前腦膽堿能系統(tǒng)異常有關(guān)仍未明確。針對(duì)目前很多鉛中毒研究主要集中在發(fā)育腦對(duì)成熟腦研究比較少且一些鉛中毒的作用機(jī)制不明的情況下本研究采用系統(tǒng)研究法通過選用幼年和成年大鼠分別建立急性和慢性鉛中毒模型22測(cè)定鉛中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力同時(shí)觀察鉛對(duì)大鼠腦神經(jīng)發(fā)生、基底前腦成熟膽堿能神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)另外分析引起鉛中毒的主要機(jī)制涉及的指標(biāo)在不同模型動(dòng)物的表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)鉛對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的腦損傷差異尋找差異產(chǎn)生的可能原因進(jìn)行

10、有關(guān)指標(biāo)的進(jìn)一步研究尋找可能的新機(jī)制為鉛神經(jīng)毒性機(jī)制的進(jìn)一步研究積累實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn) 1ji a wang f luo w tang r chen j cai t. lead poisoning in china: a nightmare fromindustrialisation. lancet 2011 377: 147476. 2shen xmet al. childhood lead poidoning china a international symon childhood lead pos prevshanghai china:19968-18 3尹平平. 血鉛超標(biāo)的警鐘還要

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18、 劉素媛慢性染鉛對(duì)小鼠海馬ca2 2鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶表達(dá)的影響中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志.2005195:393-395 18迪云.鉛對(duì)兒童學(xué)習(xí)記憶的影響及其細(xì)胞和分子機(jī)理.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志.1997112:97-98 19bellinger d. neuropsychologic function in children exposed to environmental lead. epidemeology19956l:101一103. 20.morita t. smooth muscle cell derived carbon monoxide is a regulator of

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20、理對(duì)研究防治措施和篩選相關(guān)藥物有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為鉛中毒可引起嚴(yán)重的認(rèn)知障礙但這種神經(jīng)行為障礙是否與基底前腦膽堿能系統(tǒng)異常有關(guān)仍未明確。針對(duì)目前很多鉛中毒研究主要集中在發(fā)育腦對(duì)成熟腦研究比較少且一些鉛中毒的作用機(jī)制不明的情況下本研究采用系統(tǒng)研究法通過選用幼年和成年大鼠分別建立急性和慢性鉛中毒模型22測(cè)定鉛中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力同時(shí)觀察鉛對(duì)大鼠腦神經(jīng)發(fā)生、基底前腦成熟膽堿能 6 神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)另外分析引起鉛中毒的主要機(jī)制涉及的指標(biāo)在不同模型動(dòng)物的表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)鉛對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的腦損傷差異尋找差異產(chǎn)生的可能原因進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的進(jìn)一步研究尋找可能的新機(jī)制為鉛神經(jīng)毒性機(jī)制

21、的進(jìn)一步研究積累實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 三項(xiàng)目主要研究開發(fā)內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵及主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) 研究?jī)?nèi)容 1 不同類型鉛中毒大鼠模型建立 1 急性鉛中毒模型。 a 幼年急性鉛中毒大鼠模型建立。幼年鉛中毒大鼠模型選用新生大鼠出生當(dāng)天 采用腹腔注射醋酸鉛溶液根據(jù)血鉛濃度變化確定急性鉛損傷動(dòng)物模型建立 b 成年急性鉛中毒大鼠模型建立。選用成年大鼠 采用腹腔注射醋酸鉛溶液根據(jù)血鉛濃度變化確定急性鉛損傷動(dòng)物模型建立 2 慢性鉛中毒模型。 a幼年急性鉛中毒大鼠模型建立。幼年鉛中毒大鼠模型選用新生大鼠出生當(dāng)天 采用自由飲用醋酸鉛水溶液根據(jù)血鉛濃度確定慢性鉛損傷動(dòng)物模型建立 b成年急性鉛中毒大鼠模型建立。選用成年大鼠 采用自由飲用

22、醋酸鉛水溶液根據(jù)血鉛濃度確定慢性鉛損傷動(dòng)物模型建立 2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 1采用定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。 2空間收索實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的能力。 3組織學(xué)實(shí)驗(yàn) 組織病理實(shí)驗(yàn)。取材大腦皮質(zhì)的額前區(qū)海馬回和小腦進(jìn)行肉眼形態(tài)觀察和病理切片觀察同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析了解神經(jīng)干細(xì)組織病理實(shí)驗(yàn)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的趨勢(shì)和狀態(tài)和新增殖細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元的趨勢(shì)和狀態(tài)。 7 4生化、酶聯(lián)免疫法和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 采用試劑盒、原子吸收儀和pcr儀測(cè)定各組大鼠腦勻漿中相關(guān)離子神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)分子以及相關(guān)酶的含量和活力了解氧化應(yīng)激損傷機(jī)制鈣離子代謝機(jī)制

23、主要激酶代謝變化情況。 通過對(duì)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析尋找發(fā)育大腦與成熟大腦在鉛中毒中的差異性急性和慢性鉛中毒的差異性為鉛對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機(jī)制進(jìn)一步研究積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)為提供理論支持同時(shí)為排鉛藥物篩選研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 擬解決的問題 1. 幼年大鼠和成年大鼠的給藥劑量選擇急性鉛中毒和慢性鉛中毒的時(shí)程選擇。找出最佳建模方式。 2. 了解與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的大腦皮質(zhì)的額前區(qū)海馬回和小腦等組織在鉛中毒后的變化情況從形態(tài)、組織病理到免疫組化為鉛中毒的后期機(jī)制變化尋找物質(zhì)基礎(chǔ)。 3. 比較中樞神經(jīng)系統(tǒng)鉛中毒機(jī)制中主要相關(guān)代謝和信號(hào)通路的差異結(jié)合行為學(xué)和組織學(xué)情況全面了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)鉛中毒機(jī)制尋找引起差異的可能

24、機(jī)制。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) 1. 比較不同大鼠鉛中毒模型的特點(diǎn)為不同實(shí)驗(yàn)要求提供合適動(dòng)物模型。 2.結(jié)合不同層面行為學(xué)、組織學(xué)、代謝和信息學(xué)的改變分析了不同類型鉛中毒大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化情況尋找其差異了解差異的可能原因發(fā)現(xiàn)可能的新機(jī)制為鉛中毒防治提供理論支持。 四項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)、社會(huì)效益、技術(shù)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化前景以及獲取自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的情況 通過本項(xiàng)目實(shí)施預(yù)期達(dá)到以下目標(biāo) 1.成功建立大鼠不同類型鉛中毒模型 8 2.在國(guó)內(nèi)外重要期刊發(fā)表論文2-3篇 3.系統(tǒng)比較大鼠不同類型鉛中毒模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化異同為深入開展鉛中毒機(jī)制研究通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 五項(xiàng)目實(shí)施方案、技術(shù)路線、組織方式與課題分解 項(xiàng)目

25、實(shí)施方案 1不同類型鉛中毒大鼠模型建立 1 急性鉛中毒模型。 a、 幼年急性鉛中毒大鼠模型建立。幼年鉛中毒大鼠模型選用新生大鼠出生當(dāng)天 采用腹腔注射醋酸鉛溶液0.36 、0.12 醋酸鉛溶液0.1ml 隔日注射1 次共8 次至17d 時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)血鉛濃度變化確定急性鉛損傷動(dòng)物模型建立 b、成年急性鉛中毒大鼠模型建立。選用成年大鼠200-300 g 采用腹腔注射醋酸鉛溶液0.36 、0.12 醋酸鉛溶液0.1ml 隔日注射1 次共8 次至17d 時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)血鉛濃度變化確定急性鉛損傷動(dòng)物模型建立 2 慢性鉛中毒模型。 a、幼年急性鉛中毒大鼠模型建立。幼年鉛中毒大鼠模型選用新生大鼠出生當(dāng)天

26、 采用自由飲用醋酸鉛水溶液醋酸鉛溶液濃度為2、0.2、0.05 gl醋酸鉛水溶液。染毒60-90天根據(jù)血鉛濃度確定慢性性鉛損傷動(dòng)物模型建立 b、成年急性鉛中毒大鼠模型建立。選用成年大鼠200-300 g 采用自由飲用醋酸鉛水溶液醋酸鉛溶液濃度為2、0.2、0.05 gl醋酸鉛水溶液。染毒60-90天根據(jù)血鉛濃度確定慢性性鉛損傷動(dòng)物模型建立 2行為學(xué)實(shí)驗(yàn)morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 1采用定位航行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天半每天分上、下午兩個(gè)時(shí)間段共9個(gè)時(shí)間段大鼠每時(shí)間段測(cè)試4次分別從水池的東、南、西、北4個(gè)點(diǎn)入水入水時(shí)大鼠面朝池壁。設(shè)定120秒為最長(zhǎng)逃避潛伏期escape latency超過120秒的記錄為1

27、20秒。每只大鼠在120秒內(nèi)仍未能找到平臺(tái)則由實(shí)驗(yàn)者將其 引向平臺(tái)時(shí)間則記為120秒每次測(cè)試間隔為15秒。測(cè)試結(jié)果記錄大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期、運(yùn)動(dòng)路程和運(yùn)動(dòng)速度。 9 2空間探索試驗(yàn)。測(cè)試第五天下午將平臺(tái)移去將大鼠固定一點(diǎn)放入水中120秒記錄它在120秒內(nèi)穿過平臺(tái)位置的次數(shù)穿環(huán)次數(shù)。 3組織學(xué)實(shí)驗(yàn) 取材大腦皮質(zhì)的額前區(qū)海馬回和小腦進(jìn)行肉眼形態(tài)觀察看有無異常。進(jìn)行病理切片進(jìn)行常規(guī)染色觀察腦細(xì)胞及周圍組織變化情況同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析chat、brdu、nf、gfap單標(biāo)或雙標(biāo)反應(yīng)切片觀察中樞神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的存在狀態(tài)和新增殖趨勢(shì)和狀態(tài)。 4生化、酶聯(lián)免疫法和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 采用原子吸收儀測(cè)

28、定血鉛含量生化試劑盒測(cè)定no、gtp、谷氨酸、谷胱甘肽 、鈣含量sodmda gsh-px ache活性。elisa測(cè)定鈣調(diào)素、蛋白激酶和camp、腺昔酸環(huán)化酶鳥昔酸環(huán)化酶磷酸二酯酶nos和camk活力 pcr儀測(cè)定cnos和camkmrna表達(dá)情況。 技術(shù)路線 10 六計(jì)劃進(jìn)度安排。 2012年7月2013年3月大鼠鉛中毒模型的建立與驗(yàn)證。 2013年3月2013年12月 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)morris水迷宮實(shí)驗(yàn)組織病理實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)分析星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的狀態(tài)。生化、酶聯(lián)免疫法和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過測(cè)定血液和腦組織鉛含量及生化指標(biāo)了解各種動(dòng)物的鉛含量狀況酶法及酶聯(lián)免疫方法測(cè)定腦組織中主要代謝酶的活性酶聯(lián)免疫法測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)狀況rt-pc