丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范

1、丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范 中國疾病預防控制中心中國疾病預防控制中心 二二一一年五月二十日年五月二十日 前前 言言丙型肝炎已呈全球性流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球丙型肝炎已呈全球性流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球 hcvhcv 的感染率約為的感染率約為 3%3%，估計約，估計約 1.71.7億人感染億人感染 hcvhcv，每年新發(fā)丙型肝炎病例約，每年新發(fā)丙型肝炎病例約 3.53.5 萬例。我國病毒性肝炎的發(fā)病人數(shù)一直位于所有萬例。我國病毒性肝炎的發(fā)病人數(shù)一直位于所有傳染病的前列，而丙型肝炎報告發(fā)病率在病毒性肝炎中也呈現(xiàn)上升趨勢。丙型肝炎是一種主要傳染病的前列，而

2、丙型肝炎報告發(fā)病率在病毒性肝炎中也呈現(xiàn)上升趨勢。丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)經(jīng)血液傳播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。展為肝硬化甚至肝細胞癌，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。丙型肝炎給人類帶來了如此巨大的危害，在目前還沒有疫苗的情況下，早期發(fā)現(xiàn)、早期治丙型肝炎給人類帶來了如此巨大的危害，在目前還沒有疫苗的情況下，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療至關(guān)重要。然而，大眾對于丙型肝炎認知的欠缺、

3、患者缺乏明顯癥狀、在高危人群中早期發(fā)療至關(guān)重要。然而，大眾對于丙型肝炎認知的欠缺、患者缺乏明顯癥狀、在高危人群中早期發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者的機制的缺乏，都使丙型肝炎防治面臨巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)丙型肝炎患者的機制的缺乏，都使丙型肝炎防治面臨巨大的挑戰(zhàn)。目前丙型肝炎病毒檢測已經(jīng)在疾病預防控制機構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)、采供血機構(gòu)、出入境檢驗檢目前丙型肝炎病毒檢測已經(jīng)在疾病預防控制機構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)、采供血機構(gòu)、出入境檢驗檢疫機構(gòu)等廣泛開展，但是疫機構(gòu)等廣泛開展，但是我國在丙型肝炎病毒實驗室檢測方面尚存在檢測策略不明確、檢測程我國在丙型肝炎病毒實驗室檢測方面尚存在檢測策略不明確、檢測程序不標準、檢測結(jié)果解釋不規(guī)范等問題。臨床實

4、驗室檢測中存在大量的假陽性、假陰性結(jié)果。序不標準、檢測結(jié)果解釋不規(guī)范等問題。臨床實驗室檢測中存在大量的假陽性、假陰性結(jié)果。鑒于此，為加強全國丙型肝炎檢測工作，提高實驗室檢測質(zhì)量，急需制訂關(guān)于丙型肝炎病毒實鑒于此，為加強全國丙型肝炎檢測工作，提高實驗室檢測質(zhì)量，急需制訂關(guān)于丙型肝炎病毒實驗室檢測的技術(shù)規(guī)范。驗室檢測的技術(shù)規(guī)范。受衛(wèi)生部委托，中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心于受衛(wèi)生部委托，中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心于 2008 年年 10 月月 25 日在北日在北京召開了首次京召開了首次丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范 （以下簡稱（以下簡稱規(guī)范

5、規(guī)范 ）編寫組工作會議。衛(wèi)）編寫組工作會議。衛(wèi)生部及中國疾病預防控制中心的有關(guān)領(lǐng)導從全國丙型肝炎防控管理角度，為生部及中國疾病預防控制中心的有關(guān)領(lǐng)導從全國丙型肝炎防控管理角度，為規(guī)范規(guī)范編寫內(nèi)容編寫內(nèi)容提出了幾點要求：提出了幾點要求：1 規(guī)范規(guī)范內(nèi)容要考慮為公共衛(wèi)生服務(wù)，要考慮到基層的具體情況。內(nèi)容要考慮為公共衛(wèi)生服務(wù)，要考慮到基層的具體情況。 規(guī)范規(guī)范制訂的標準要制訂的標準要有實用性及可操作性。有實用性及可操作性。2 規(guī)范規(guī)范內(nèi)容要有發(fā)展的眼光，要考慮經(jīng)濟發(fā)展和技術(shù)進步。內(nèi)容要有發(fā)展的眼光，要考慮經(jīng)濟發(fā)展和技術(shù)進步。 規(guī)范規(guī)范內(nèi)容要有一定的前內(nèi)容要有一定的前瞻性，要有較長的使用壽命。瞻性，要

6、有較長的使用壽命。3 規(guī)范規(guī)范內(nèi)容要有大局觀念，要考慮有利于各系統(tǒng)的發(fā)展。內(nèi)容要有大局觀念，要考慮有利于各系統(tǒng)的發(fā)展。 規(guī)范規(guī)范編寫要借鑒國外經(jīng)驗、編寫要借鑒國外經(jīng)驗、立足國內(nèi)具體情況。立足國內(nèi)具體情況。隨后，隨后，在衛(wèi)生部和中國疾病預防控制中心有關(guān)領(lǐng)導的支持下，中國疾病預防控制中心性病在衛(wèi)生部和中國疾病預防控制中心有關(guān)領(lǐng)導的支持下，中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心組織國內(nèi)有關(guān)專家，歷時近兩年，經(jīng)過反復多次修改，制訂完成了我國艾滋病預防控制中心組織國內(nèi)有關(guān)專家，歷時近兩年，經(jīng)過反復多次修改，制訂完成了我國丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。規(guī)范規(guī)范共分九章，

7、包括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎共分九章，包括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒抗體檢測，丙型肝炎病毒抗原檢測，丙型肝炎病毒核酸檢測，丙型肝炎病毒檢測策略，丙病毒抗體檢測，丙型肝炎病毒抗原檢測，丙型肝炎病毒核酸檢測，丙型肝炎病毒檢測策略，丙型肝炎病毒細胞培養(yǎng)，實驗樣品的采集、保存、運輸，丙型肝炎病毒檢測實驗室的室內(nèi)質(zhì)量控型肝炎病毒細胞培養(yǎng)，實驗樣品的采集、保存、運輸，丙型肝炎病毒檢測實驗室的室內(nèi)質(zhì)量控制及能力驗證和實驗室生物安全。制及能力驗證和實驗室生物安全?，F(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展日新月異，新理論、新觀點、新的診斷技術(shù)和新的防治策略不斷出現(xiàn)，中現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展日新月異，新理論、新觀點、新的診斷技術(shù)和新的防治策略不

8、斷出現(xiàn)，中國疾病預防控制中心將根據(jù)最新的臨床醫(yī)學證據(jù)適時組織專家組對本國疾病預防控制中心將根據(jù)最新的臨床醫(yī)學證據(jù)適時組織專家組對本規(guī)范規(guī)范進行修改和更新。進行修改和更新。本本規(guī)范規(guī)范主要起草單位：中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心。主要起草單位：中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心。本本規(guī)范規(guī)范參加編寫單位：中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心、中國疾參加編寫單位：中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心、中國疾病預防控制中心病毒病預防控制中心、北京大學醫(yī)學部、北京人民醫(yī)院、上海巴斯德研究病預防控制中心病毒病預防控制中心、北京大學醫(yī)學部、北京人民醫(yī)院、上海巴斯德研究所、中

9、國藥品生物制品檢定所、浙江大學醫(yī)學院、北京市疾病預防控制中心。所、中國藥品生物制品檢定所、浙江大學醫(yī)學院、北京市疾病預防控制中心。本本規(guī)范規(guī)范編寫組織者：蔣巖。編寫組織者：蔣巖。本本規(guī)范規(guī)范編寫組人員：莊輝、魏來、魯鳳民、鐘勁、祁自柏、陳智、周林福、汪寧、編寫組人員：莊輝、魏來、魯鳳民、鐘勁、祁自柏、陳智、周林福、汪寧、蔣巖、邢文革、邢玉蘭、畢勝利。蔣巖、邢文革、邢玉蘭、畢勝利。本本規(guī)范規(guī)范編寫聯(lián)系人：邢文革。編寫聯(lián)系人：邢文革。本本規(guī)范規(guī)范適用于全國所有的丙型肝炎病毒檢測實驗室。適用于全國所有的丙型肝炎病毒檢測實驗室。本本規(guī)范規(guī)范解釋權(quán)屬于中國疾病預防控制中心。解釋權(quán)屬于中國疾病預防控制中心

10、。本本規(guī)范規(guī)范自發(fā)布之日起施行。自發(fā)布之日起施行。丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范編寫組編寫組20102010年年5 5月月2020日日 于北京于北京i目目 錄錄第一章第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒.11病毒形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu).12基因型.23復制和細胞嗜性.24致病性和免疫性.3第二章第二章 丙型肝炎病毒抗體檢測丙型肝炎病毒抗體檢測.51概述.52試劑.53檢測方法及程序.54抗體檢測注意事項.105抗體檢測的意義.116結(jié)果報告和解釋.11第三章第三章 丙型肝炎病毒抗原檢測丙型肝炎病毒抗原檢測.131概述.132試劑.133檢測方法及程序.144抗原檢測注意事項

11、.145抗原檢測的意義.156結(jié)果報告和解釋.15第四章第四章 丙型肝炎病毒核酸檢測丙型肝炎病毒核酸檢測.161丙型肝炎 rna 定性檢測.162丙型肝炎病毒 rna 定量檢測.173丙型肝炎病毒基因型檢測.23第五章第五章 丙型肝炎病毒檢測策略丙型肝炎病毒檢測策略.261疫情監(jiān)測相關(guān)的檢測策略.262臨床診斷相關(guān)的檢測策略.273血液篩查相關(guān)的檢測策略.30第六章第六章 丙型肝炎病毒細胞培養(yǎng)丙型肝炎病毒細胞培養(yǎng).321丙型肝炎病毒的細胞培養(yǎng)模型.322體外細胞培養(yǎng)技術(shù)在丙型肝炎病毒檢測中應用的展望.33第七章第七章 實驗樣品的采集、保存、運輸實驗樣品的采集、保存、運輸.351樣品采集.352

12、樣品保存與運輸.35ii第八章第八章 丙型肝炎病毒檢測實驗室的室內(nèi)質(zhì)量控制及能力驗證丙型肝炎病毒檢測實驗室的室內(nèi)質(zhì)量控制及能力驗證.371室內(nèi)質(zhì)量控制.372能力驗證.41第九章第九章 實驗室生物安全實驗室生物安全.461丙型肝炎病毒相關(guān)檢測的生物安全級別.462實驗室生物安全保障措施.473實驗室安全操作.484職業(yè)暴露及其處理.50參考文獻參考文獻.521第一章第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒（hcv）于 1989 年被正式命名，在此之前被稱為腸道外傳播的非甲非乙型肝炎病毒。1991 年被歸為黃病毒科（flaviviridae） 。雖然丙型肝炎作為疾病早已被發(fā)現(xiàn)，但直到 200

13、5 年 hcv 體外細胞培養(yǎng)才獲得成功。這對進一步認識 hcv 結(jié)構(gòu)與功能、深入研究 hcv 的發(fā)病機制、研究和開發(fā)抗 hcv 藥物和疫苗具有重要意義。1 1病毒形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)病毒形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)hcv 是一種有包膜的 rna 病毒。病毒體為直徑 4060nm 的球狀顆粒，包膜表面有刺突結(jié)構(gòu)。用有機溶劑提取去除包膜后，可暴露其中心的核衣殼，直徑約 33nm。經(jīng)蔗糖梯度離心后，血清中的 hcv 顆粒分布于 3 個組分：浮密度為 1.041.06g/ml 者為與血清中脂蛋白結(jié)合的病毒顆粒；1.091.1g/ml 者為游離的病毒顆粒；浮密度為 1.171.24g/ml 的病毒顆粒與血清中抗體結(jié)合以

14、免疫復合物形式存在。在分類學上hcv屬黃病毒科（flaviviridae）丙型肝炎病毒屬（hepacivirus） 。hcv是單股正鏈rna病毒，基因組總長約9.6kb，編碼單一的開放讀框（open reading frame，orf） ，可翻譯成一個約3000個氨基酸的前體蛋白。在hcv orf兩側(cè)分別有一個5非編碼區(qū)和3非編碼區(qū)，均具有復雜的二級結(jié)構(gòu)。5非編碼區(qū)含有內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，ires） ，可直接與40s核糖體亞單位結(jié)合，啟動hcv前體蛋白的翻譯。翻譯啟動后首先產(chǎn)生hcv前體蛋白。由宿主細胞的信號蛋白酶和hcv自身編碼的蛋白

15、酶加工成約10個成熟的hcv編碼蛋白。hcv結(jié)構(gòu)蛋白位于前體蛋白的氨基末端1/3處，由宿主細胞的信號蛋白酶加工，包括核心蛋白（core） 、2個包膜糖蛋白（e1、e2）和一個小的p7蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白（ns）位于前體蛋白的羧基末端2/3處，包括ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b，其加工由hcv自身編碼的蛋白酶介導，其中ns2-3自身蛋白酶切割ns2和ns3間的連接，而ns3絲氨酸蛋白酶負責下游ns3至ns5b間的加工成熟（圖1） 。2圖圖1 hcv基因組結(jié)構(gòu)及病毒蛋白基因組結(jié)構(gòu)及病毒蛋白注：阿拉伯數(shù)字代表各成熟蛋白的第一位氨基酸殘基位置；細箭頭所指處由宿主細胞的信號蛋白酶切割

16、；實心粗箭頭所指處由hcv ns2-3自身蛋白酶切割；空心粗箭頭所指處由hcv ns3/4a絲氨酸蛋白酶切割。其中ns3-4a間的連接為順式切割，而ns4a-ns5b為反式切割。2 2基因型基因型依據(jù)基因序列的差異，可將 hcv 分為 6 個主要基因型及不同亞型，按照國際通行的方法，以阿拉伯數(shù)字表示 hcv 基因型，以小寫的英文字母表示基因亞型（如 1a、2b、3c等） 。基因 1 型呈全球性分布，占所有 hcv 感染的 70%以上，歐洲、美洲和亞洲的流行株以 1 型和 2 型為主；4 型主要流行于中東地區(qū)；南非以 5 型和 6 型為主。我國以 1b 和 2a基因型較為常見，但以 1b 型為主

17、；某些地區(qū)有 1a、2b、3b 和 6a 型的報道。3 3復制和細胞嗜性復制和細胞嗜性hcv主要感染肝細胞。首先，hcv與靶細胞表面的受體結(jié)合，進入細胞后脫殼將其基因組rna釋放到細胞漿中。在hcv5非編碼區(qū)內(nèi)的ires指導下，hcv基因組rna可作為信使rna被翻譯為一個大的前體蛋白，后者經(jīng)宿主細胞和hcv自身編碼的蛋白酶加工成為成熟的hcv基因產(chǎn)物，其中ns3到ns5b可組成hcv的復制復合體，以hcv基因組rna為模板，啟動負鏈hcv rna的合成。新合成的負鏈hcv rna又可作為模板進行新正鏈及新負鏈hcv rna的合成，其中一些正鏈hcv rna可包裝成為子代病毒，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運系

18、統(tǒng)釋放到細胞外（圖2） 。3圖圖 2 hcv 復制周期示意圖復制周期示意圖4 4致病性和免疫性致病性和免疫性丙型肝炎的潛伏期為226周，平均約67周。多數(shù)（約80%）hcv感染者無癥狀或僅有輕微癥狀，如疲勞、食欲減退、右上腹部不適、搔癢等，黃疸很少見（20%） 。50%80%的患者可發(fā)展成慢性丙型肝炎。有些患者不出現(xiàn)癥狀，發(fā)病時已呈慢性感染，慢性丙型肝炎的表現(xiàn)輕重不等。約20%的慢性丙型肝炎患者可在20年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，一旦到肝硬化階段，每年約有1%7%可進展為原發(fā)性肝細胞癌。我國約10%肝癌患者血中存在抗-hcv。目前丙型肝炎尚無有效疫苗可以預防，切斷傳播途徑尤其是控制血液傳播仍是最主要的預

19、防措施。丙型肝炎的標準治療方法是-干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療，有助于盡早從血液和肝臟中清除hcv，并使患者的血液生化學指標及組織學改變恢復正常。人感染hcv后，可呈現(xiàn)四種類型的抗-hcv反應：（1）被動輸入抗-hcv反應。多見于輸入含高滴度抗-hcv血液者，于輸血后抗-hcv即為陽性，5周后陰轉(zhuǎn)，而后感染者自身產(chǎn)生抗-hcv，并可持續(xù)存在。 （2）遲發(fā)性抗-hcv持續(xù)陽性反應。一般于輸血后2022周或發(fā)病后1416周抗-hcv陽轉(zhuǎn)，并迅速達高水平，可持續(xù)陽性10年以上。 （3）遲發(fā)性抗-hcv短期陽性反應。于輸血后1921周或發(fā)病后911周抗-hcv陽轉(zhuǎn)，但1年后轉(zhuǎn)陰。（4）無反應。此種反應多見

20、于一過性hcv感染者或免疫力低下者，抗-hcv始終陰性。目4前多認為，hcv感染所致肝臟損傷主要來自機體對hcv的免疫應答。此外，有研究顯示，hcv的核心蛋白可通過損傷線粒體功能，引起肝細胞氧化應激，間接導致肝細胞損傷。hcv感染者大約有25%能自動清除體內(nèi)病毒。有證據(jù)表明，這是機體產(chǎn)生了較強的體液和細胞免疫應答所致，hcv感染后的轉(zhuǎn)歸被認為與細胞免疫關(guān)系更為密切。丙型肝炎患者康復后，僅有較低免疫力，可再次被同種或異種hcv株所感染。也有同一患者感染多種基因型hcv的報道。 5第二章第二章 丙型肝炎病毒抗體檢測丙型肝炎病毒抗體檢測1 1概述概述丙型肝炎病毒抗體檢測是丙型肝炎診斷的重要依據(jù)。自從

21、1989年建立了抗-hcv檢測方法以來，檢測技術(shù)不斷發(fā)展。到目前為止，已經(jīng)在臨床廣泛應用的丙型肝炎病毒抗體檢測技術(shù)包括酶免疫技術(shù)、膠體金快速檢測技術(shù)、化學發(fā)光技術(shù)、熒光技術(shù)等?？贵w檢測廣泛用于血液篩查、流行病學調(diào)查、臨床診斷，為早期發(fā)現(xiàn)感染者和病人、早期治療提供可靠的依據(jù)。2 2試劑試劑抗-hcv 目前常用的檢測試劑包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金法快速試驗、化學發(fā)光試驗、免疫熒光試驗、免疫印跡試驗和蛋白芯片。使用抗-hcv 試劑，必須是經(jīng)過國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊，在有效期內(nèi)的試劑。應根據(jù)目的和試劑使用范圍，選擇抗體檢測試劑。推薦使用臨床質(zhì)量評估敏感性和特異性高的試劑。3 3檢測方法及程序檢

22、測方法及程序3.1 抗體篩查試驗包括酶聯(lián)免疫試驗、膠體金法快速試驗、化學發(fā)光試驗和免疫熒光試驗。3.1.1 抗-hcv 酶聯(lián)免疫試驗3.1.1.1 試劑和原理間接酶聯(lián)免疫法（elisa）是抗-hcv 檢測常用的篩查方法。其基本原理是以 hcv 抗原包被固相載體，用辣根過氧化物酶標記的抗人 igg 與被檢樣品中的抗-hcv 反應，以鄰苯二胺（opd）或 3，3，5，5四甲基聯(lián)苯胺（tmb）等底物顯色后，利用檢測儀器根據(jù)顏色的深淺進行陰陽性結(jié)果判斷。其主要反應過程如下：（1）試劑中包含重組抗原與固相載體連接形成的固相抗原。（2）加入經(jīng)樣本稀釋液稀釋的被檢樣品，樣本中的抗-hcv 與抗原結(jié)合，形成固

23、相抗原抗體復合物。6（3）洗滌：固相載體上只留下抗-hcv。其他免疫球蛋白及樣品中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。（4）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。（5）加底物顯色：利用分析儀分析結(jié)果。elisa 中通常用聚苯乙烯為固相載體，有微孔板、小管、小珠（beads）、微粒（microparticle）、磁性微粒等類型，后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。不同形式的固相載體要求不同的洗滌裝置，并有其特殊的自動分析系統(tǒng)。目前臨床診斷和采供血機構(gòu)廣泛采用第三代

24、 elisa 試劑，即采用基因工程制備的重組蛋白做為包被抗原制備的抗-hcv elisa 試劑進行抗體篩查。3.1.1.2 試驗程序板式 elisa 試劑均采用規(guī)格統(tǒng)一的 812 的 96 微孔板，與板式 elisa 試劑配套使用的洗滌裝置（洗板機等）、自動分析儀（酶標儀等）均為開放式的，適用于各家產(chǎn)品。其主要的試劑組分和試驗程序如下：（1） 配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按照規(guī)定倍數(shù)稀釋。（2） 稀釋：每孔加入規(guī)定量樣品稀釋液。（3） 加樣：分別在相應孔中加入一定量的被檢樣品或陰、陽性對照，輕輕振蕩混勻。（4） 溫育：按照說明書用封板膜封板后置 37溫育。（5） 洗滌：小心揭掉封板膜，

25、用洗板機設(shè)置相應洗滌時間和次數(shù)，最后一次盡量扣干。（6） 加酶：每孔加入規(guī)定量的酶標試劑。（7） 溫育：按照說明書用封板膜封板后置 37溫育。（8） 洗滌：操作同 5。（9） 顯色：每孔按照說明書要求加入顯色劑，輕輕振蕩混勻，37避光顯色。（10） 測定：每孔加入規(guī)定量終止液，輕輕振蕩混勻，按照說明書設(shè)定酶標儀檢測波長測定各孔 od 值。微孔板以外的固相載體形式，其洗滌裝置和自動分析系統(tǒng)均為試劑與儀器配套型的。自動化程度較高，精密度和重復性等指標也達到較高水平，但檢測成本較昂貴。73.1.1.3 判定標準（1）陰性對照的正常范圍：一般情況下，陰性對照孔讀數(shù)規(guī)定值（若有 1 孔陰性對照讀數(shù)大于規(guī)

26、定值應舍棄，若有兩孔或兩孔以上陰性對照讀數(shù)大于規(guī)定值，應重復試驗）。（2）陽性對照的正常范圍：正常情況下，陽性對照孔讀數(shù)規(guī)定值（若有 1 孔陽性對照讀數(shù)小于規(guī)定值應舍棄，若兩孔陽性對照讀數(shù)小于規(guī)定值，應重復試驗）。（3）根據(jù)試劑盒提供方法計算臨界值（cutoff）。（4）陰性判定：樣品讀數(shù)臨界值（cutoff）者為抗-hcv 陰性。（5）陽性判定：樣品讀數(shù)臨界值（cutoff）者為抗-hcv 陽性反應。如試劑有配套的自動分析系統(tǒng)，則系統(tǒng)會自動計算 cutoff 值，并判定結(jié)果。3.1.2 抗-hcv 膠體金法快速試驗3.1.2.1 試劑和原理近年來膠體金免疫滲濾試驗（膠體金法）方法日趨成熟，逐

27、步在臨床上得到廣泛應用。該方法利用免疫膠體金技術(shù)，以間接法檢測樣品中的抗-hcv。檢測時，樣品中的抗-hcv與固定在硝酸纖維膜上的金標蛋白反應，形成復合物，經(jīng)層析移動至檢測條的檢測區(qū)，被固定在硝酸纖維素膜上的 hcv 抗原捕獲，形成一條陽性色帶。未被結(jié)合的金標抗體移動至檢測條的質(zhì)控區(qū)，與包被在此的抗金標蛋白的二抗反應形成另一色帶。該試劑具有操作簡單、檢測快速、特異性好、靈敏度較高、無需特殊的實驗條件及儀器設(shè)備，可用于抗-hcv 篩查。此外，一些以納米磁微粒作為標記物的新型抗-hcv 快速檢測試劑也開始投入使用。3.1.2.2 試驗方法膠體金試劑一般采用試紙條或檢測板：（1）檢測板：根據(jù)試劑說明

28、書取規(guī)定量的待檢樣品加入檢測板的樣品孔或樣品池中，再滴加入緩沖液；（2）試紙條：將試劑條箭頭所指方向插入樣品收集器內(nèi)，待檢樣品液面直到標記線為止，確保浸沒時間大于 1015 秒。然后將試劑條從樣品收集器中拿出，將之粘貼到測試卡上，再觀察測試結(jié)果。不要將試劑條浸沒位置超過標記線（具體時間規(guī)定按照說明書所示）。3.1.2.3 判定標準（1）陽性反應（+）：兩條紫紅色條帶出現(xiàn)。一條位于測試區(qū)（t）內(nèi)，另一條位于8質(zhì)控區(qū)（c）。（2）陰性（-）：僅質(zhì)控區(qū)（c）出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)（t）內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)。（3）無效：質(zhì)控區(qū)（c）未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑條已變質(zhì)損壞。在此情況

29、下，應再次仔細閱讀說明書，并用新的試劑條重新測試。如果問題仍然存在，應立即停止使用此批號產(chǎn)品，并與當?shù)毓搪?lián)系。（4）注意事項：測試區(qū)（t）內(nèi)的紫紅色條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定觀察時間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應判為陽性反應。3.1.3.化學發(fā)光試驗3.1.3.1 試劑和原理化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)?；瘜W發(fā)光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種：（1）化學發(fā)光標

30、記免疫分析法：化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析（clia），是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物acridiniumester（ae），是有效的發(fā)光標記物，通過起動發(fā)光試劑作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子的結(jié)合不會減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。（2）化學發(fā)光酶免疫分析法：從標記免疫分析角度，化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme i

31、mmunoassay，cleia）應屬酶免疫分析，只是反應的底物是發(fā)光劑，操作步驟與 elisa 分析完全相同。以酶標記生物活性物質(zhì)（如酶標記的抗原或抗體）進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。該方法又分為如下幾類： hrp 標記的 cleia：常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾，是一類重要的發(fā)光試劑。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧（過氧化陰離子 o2-，單線態(tài)氧 o2，羥自由基 oh-，過氧化氫 h2o2）存在下生成激發(fā)態(tài)中間體，當其回到基態(tài)時發(fā)光，其波長為 425nm。早期用魯米諾直接標記抗原或

32、抗體，但標記后發(fā)光強度9降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應后利用魯米諾作為發(fā)光底物， 在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑（naoh2h2o2）作用下，魯米諾發(fā)光，發(fā)光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。 增強發(fā)光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassay，eleia）在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強發(fā)光劑以增強發(fā)光信號， 并在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定， 便于重復測量， 從而提高分析靈敏度和準確性。 alp 標記的 cleia 所用底物為環(huán) 1，22 二氧乙烷衍生物，用于化學發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團金剛烷基，其分子中

33、發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團，在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光。3.1.3.2 試驗方法操作步驟與elisa分析類似或完全相同。3.1.3.3 判定標準在陰性和陽性對照符合試劑盒質(zhì)控要求的情況下，以信號值（signal）/臨界值（cutoff）試劑盒注明的s/co判定為抗-hcv陽性反應。根據(jù)試劑盒注明的（signal/cutoff）范圍內(nèi)或?qū)θ蹶栃苑磻獦颖具M行復試或補充試驗，或判定為陰性。3.2 抗體補充試驗抗體補充試驗包括免疫印跡試驗和蛋白芯片檢測方法。3.2.1 抗-hcv 免疫印跡試驗3.2.1.1 試劑和原理目前獲美國fda正式批準的抗-hcv補充試驗試劑只有一種，即美國ch

34、iron公司的重組免疫印跡法試劑（riba）。riba hcv 3.0將c100、c22和ns3、ns5四種成分噴涂在硝酸纖維薄膜條上，并設(shè)置了兩種不同濃度的人igg對照帶和一條hsod對照帶，用于內(nèi)部對照和結(jié)果判斷。其診斷hcv感染的敏感性高、特異性強，可檢測針對hcv不同編碼區(qū)抗原的抗體，且不需要特殊的儀器設(shè)備。因此常用來確證elisa檢測的結(jié)果。3.2.1.2 試驗方法 依照試劑說明書操作。3.2.1.3 判定標準依照試劑判定標準判定結(jié)果。riba 試劑檢測時出現(xiàn)兩條以上陽性帶，判定為陽性。其中 igg control和 igg control均顯色，且前者顏色深于后者，hsod 帶不顯

35、色或色帶低10于 igg control，以上條件成立則試驗成立。抗體產(chǎn)生條帶的判定依次為ns4、ns3、core 和 ns5。若兩條抗體帶顯色，判定為抗體陽性；若 1 條抗體帶顯色，判為疑似抗體陽性；若所有抗體帶均不顯色，判為抗體陰性。3.2.2 蛋白芯片檢測技術(shù)3.2.2.1 試劑和原理蛋白芯片檢測技術(shù)是一種自動快捷、靈敏特異、高通量的蛋白組學研究方法，是伴隨著基因芯片發(fā)展起來的一項新型診斷技術(shù)，已成功地運用于自身抗體、腫瘤標志物等的檢測。 用蛋白芯片的方法檢測抗-hcv 分片段，主要采用先進的蛋白芯片膜處理技術(shù)、點樣技術(shù)、洗滌技術(shù)、標記技術(shù)等檢測技術(shù)。檢測原理基于間接免疫法，采用化學發(fā)光

36、的方法。突破了傳統(tǒng)的 hcv 酶聯(lián)免疫試驗（elisa）檢測試劑盒一次只能檢測抗-hcv 的局限，樣品用量僅為 elisa 的 1/5，能同時檢測樣品中抗 hcv core、抗 hcv ns3、抗 hcv ns4、抗 hcv ns5 以及抗 hcv 總抗體 5 項指標，能使臨床方便地了解抗-hcv 中，core，ns3，ns4 和 ns5 4 種不同功能區(qū)抗體出現(xiàn)的情況及不同的臨床意義。如抗-hcv core 滴度持續(xù)明顯降低反映 hcv rna 可能消失；抗-hcv ns3 可用于早期診斷，下降或轉(zhuǎn)陰提示治療有效，是病毒血癥水平降低或消失的敏感標志；抗-hcv ns4 與疾病慢性化有關(guān)，反映

37、總抗體水平；抗-hcv ns5 與肝細胞壞死有關(guān)，用于急性感染的診斷。3.2.2.2 試驗方法取出制備好的芯片，加試劑盒規(guī)定倍數(shù)倍稀釋的一定量血清樣本以及陰陽性對照，37 溫浴 30 分鐘，反應終止后加入洗滌液，按照說明書要求的時間和次數(shù)進行洗滌，然后加入一定量相應標記的抗人 ig g 結(jié)合物，37 溫浴 30 分鐘，再按照說明書要求進行洗滌，根據(jù)試劑盒內(nèi)二抗的不同標記類型直接進行掃描檢測，或者加入底物或顯色液進行檢測。3.2.2.3 判定標準需要兩條陽性帶，才可判定為陽性，且抗原反應性1。4 4抗體檢測注意事項抗體檢測注意事項4.1 檢測要點（1）嚴格按照試劑說明書操作，不得擅自更改；11（

38、2）注意防止交叉污染；（3）嚴格遵守實驗室操作規(guī)程。4.2 檢測中常見錯誤（1）稀釋錯誤；（2）在加樣時刮擦已包被抗原的微孔；（3）不適當?shù)氖褂玫喂埽玫喂芗釉噭r滴管應處于垂直位置且液滴要自由落下；（4）使用不適當?shù)募訕悠鳂岊^，加樣器與槍頭一定要匹配，否則會使取樣加樣不準；（5）不連貫的操作技術(shù)，每份樣本及質(zhì)控品要同樣對待，同時要同一個技術(shù)人員加所有的樣本及質(zhì)控；使用全自動處理處理系統(tǒng)有助于減少人為因素的影響；（6）使用不適當?shù)脑O(shè)備，設(shè)備使用前要保證經(jīng)過了校準；（7）不適當?shù)臏囟龋噭┦褂们耙胶庵潦覝?，孵育溫度要準確，否則會改變反應的動力學，產(chǎn)生錯誤結(jié)果；（8）不同批號試劑中的組分混合使用

39、。5 5抗體檢測的意義抗體檢測的意義抗-hcv 檢測最初被推薦用于檢出 hcv 感染。在臨床上，針對大多數(shù)患有肝臟疾病的病人，篩查檢測的敏感性和特異性均較高，抗-hcv 假陽性較為少見。然而，在 hcv 感染率低的人群中（如無償獻血員、現(xiàn)役或退役軍人、普通人群、衛(wèi)生保健從業(yè)人員、性病門診就診者），假陽性率較高，陽性預期值較低。抗-hcv 產(chǎn)生假陽性的主要原因是：（1）高 igg 血癥：目前國內(nèi)外的抗-hcv 試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理，間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性 igg，igg 對聚苯乙烯有較強的吸附力，非特異性 igg 可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽

40、性；（2）類風濕因子的干擾：類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清或血漿中的類風濕因子為巨球蛋白 igm，可非特異性地吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性；（3）超氧化物歧化酶（sod）的干擾：如 eia 試劑所含的重組基因片段 c-100 為酵母菌產(chǎn)生的sod 融合蛋白，樣品中 sod 升高會造成抗-hcv 假陽性結(jié)果；（4）用于試劑制備的 hcv抗原不純。用于生產(chǎn)抗-hcv 的抗原主要有 hcv 核心區(qū)、ns3、ns4 及 ns5 區(qū)蛋白，均為基因工程產(chǎn)物，如抗原的純度太低，可產(chǎn)生非特異性反應。由于以上原因，不能單獨依靠篩查試驗陽性反應結(jié)果來判斷一個人是否感染 hcv。因12此，篩查試驗陽性反應的樣品

41、需應用具有更高特異性的補充試驗進行確證分析。免疫印跡試驗是具有高特異性的抗-hcv 補充試驗，用來確認篩查實驗陽性反應的樣品，其結(jié)果表示為“陽性”、“陰性”、“不確定”。免疫印跡試驗陽性結(jié)果可判定抗-hcv 陽性。確認抗-hcv 陽性結(jié)果提示需要進行有關(guān) hcv 感染的咨詢和醫(yī)學評價，包括進行 hcv rna 和肝臟生物化學（如 alt）檢測。6 6結(jié)果報告和解釋結(jié)果報告和解釋6.1 根據(jù)篩查和補充試驗結(jié)果進行報告的基本原則6.1.1 對于篩查試驗陰性樣品，無需做進一步檢測，可報告為“抗-hcv 陰性” 。6.1.2 對于篩查試驗陽性反應樣品，可選擇“根據(jù)其 s/co 比值”的方案或選擇“不根

42、據(jù)其s/co”的方案直接進行補充試驗。6.1.2.1 根據(jù)其 s/co 比值進行補充試驗：對于高 s/co 比值的篩查試驗陽性反應樣品，可報告為“抗-hcv 陽性”，無需再做補充試驗；對于低 s/co 比值的篩查試驗陽性反應樣品，應進一步做補充試驗。6.1.2.2 直接進行補充試驗：對所有篩查試驗陽性樣品，進行免疫印跡試驗；或先做核酸放大檢測(nat)，nat 陰性的樣品，再進行免疫印跡試驗。6.2 試劑盒規(guī)定的 s/co 閾值的說明6.2.1 高 s/co 比值：當 s/co 比值特定的閾值時，其補充試驗結(jié)果陽性的預測值95；6.2.2 低 s/co 比值：其 s/co 比值0.99） ，斜

43、率（反映擴增的效率）在指定的范圍內(nèi)。但采用外標法定量的試劑盒標準品擴增良好也不一定意味著樣品一定擴增良好，因為還涉及rna提取質(zhì)量的問題，因此特別要注意考察陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控的結(jié)果，陰性結(jié)果必須沒有擴增曲線，而陽性質(zhì)控必須擴增曲線良好，結(jié)果落入指定的區(qū)間內(nèi)。2.3 b-dna 技術(shù)2.3.1 原理分支 dna（bdna）技術(shù)基于其獨特的信號放大系統(tǒng)，即 bdna 信號放大系統(tǒng)，這是一個人工合成的 bdna，bdna 的分枝可結(jié)合多個酶標記物，從而將病毒的信號放大，以便進行檢測。利用序列特異的寡聚核苷酸探針雜交捕捉 hcv rna，hcv rna 隨后與支鏈dna（bdna）二級探針雜交，bdn

44、a 再與酶聯(lián)三級探針結(jié)合，隨后加入酶底物，產(chǎn)生的化學發(fā)光信號強度與靶 rna 的量成正比。2.3.2 操作程序首先將血漿樣品離心，濃縮其中的病毒顆粒，hcv rna 釋放后加入微孔板中，板孔中包被有可與病毒特異結(jié)合的一系列靶探針，另一系列靶探針的一端可標記在游離的病毒核酸鏈上，另一端可與 bdna 結(jié)合，加入酶標記物對結(jié)合的 bdna 進行標記，經(jīng)過清洗后加入底物進行反應，測定反應強度。本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標記物，每次實驗設(shè)置一系列外部標記，通過實驗樣品反應強度與外部標記樣品強度的比較確定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。由于此實驗不涉及核酸擴增過程，因此全部操作可在同一區(qū)域內(nèi)進行，對此區(qū)域的要求相對較

45、低，但應保證此區(qū)域內(nèi)不含有與本實驗目的基因相同的大量核酸擴增產(chǎn)物或克隆22產(chǎn)物。試驗區(qū)應配置 2 個溫浴箱（在使用前分別調(diào)至 37和 63）、高速恒溫離心機和bdna 測定分析儀。2.3.3 特點bdna 檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：不涉及核酸擴增反應，污染的可能性小，因此對實驗室的要求較 pcr 低；不需要核酸提取，直接用微量的血漿即可進行檢測；檢測的重復性好。但其不足在于線性范圍較窄，操作耗時較長，并且結(jié)果在很大程度上依賴于質(zhì)控品與標準品的表現(xiàn)。bdna 在國外實驗室有較為廣泛的應用，但在我國應用很少。2.4 hcv rna 定量檢測的臨床意義hcv rna水平與肝臟損害的嚴重程度及纖維化無關(guān)，也

46、不能預測感染的自然史和疾病預后，因此，臨床上患者常規(guī)處理和監(jiān)測并不需要反復檢測hcv rna。hcv rna定量檢測的意義主要體現(xiàn)在作為抗病毒治療療效的判斷指標。表現(xiàn)在：僅hcv rna陽性的患者才考慮抗病毒治療；持續(xù)病毒學應答（svr）（抗病毒治療24周后hcv rna低于檢測限，即50iu/ml）是抗病毒治療的目標；而治療過程中快速病毒學應答（rvr，即4周hcv rna低于檢測限，50iu/ml）和evr（即治療12周時血清hcv rna定性檢測陰性或定量檢測小于最低檢測限，或定量檢測降低2個數(shù)量級以上）則是svr的預測工具，能幫助更合理地進行個體化治療。因此更優(yōu)化的治療方案是根據(jù)治療中

47、的應答來指導用藥方案（rgt策略）。2.5 結(jié)果報告現(xiàn)階段對hcv rna定量檢測的單位尚未完全統(tǒng)一，有的報拷貝/ml，有的報告國際單位（iu）/ml，不同的試劑所用的標準不一樣，造成iu和拷貝之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)不同。國產(chǎn)hcv rna定量檢測試劑盒的檢測范圍一般在103108拷貝/ml，國外知名試劑靈敏度要高于國產(chǎn)試劑，最低檢測限約低一個數(shù)量級。一個合格的 hcv rna 定量檢測報告單應該具備如下內(nèi)容：檢測方法（如熒光定量pcr） 、檢測試劑名稱、單位及檢測范圍。臨床樣品的結(jié)果可能有幾種情況：結(jié)果在檢測范圍內(nèi)，則按檢測的結(jié)果直接發(fā)報告，如每毫升 3.2105拷貝/ml（有的臨床實驗室表示為3.

48、20e+05 拷貝/ml） ；結(jié)果高于檢測上限，則應用 hcv 陰性的混合血漿（清）將樣本進行 101000 稀釋后再重新進行檢測，直到結(jié)果落入檢測范圍內(nèi)；樣本未出現(xiàn)擴增曲線，則報告為低于檢測下限。如果低于檢測下限，但又有擴增曲線出現(xiàn)，則應重新進行檢測，若在檢測限內(nèi)，按照實際數(shù)發(fā)報告，若仍低于檢測下限，則報告為“低于檢測下限” 。目前很多實驗室對這部分樣品不進行復檢就直接發(fā)出報告，會造成相當部分陽性樣品的漏檢。233 3丙型肝炎病毒基因型檢測丙型肝炎病毒基因型檢測3.1 hcv 基因型1993 年 simmonds 等提出的分型方法得到了大多數(shù)學者的認同。simmonds 等分析不同毒株編碼非

49、結(jié)構(gòu)蛋白 5（ns5）區(qū)域核苷酸序列的同源性，按照發(fā)現(xiàn)的先后將 hcv 主要分為 16 個型，每個型有若干亞型，以 a，b，c 等表示。這樣，hcv 被分為 6 個型和 70多個亞型。simmonds 分型方法對臨床慢性丙型肝炎的抗病毒治療具有重要指導意義，美國肝病學會、歐洲肝病學會、亞太肝病學會和中國制定的系列丙型肝炎防治指南都采用了該法進行分型。在我國，最主要的基因型為 1b（66%） ，其次為 2a（14%） ，還有其他較少見的型別，如西南地區(qū)的 3 型和廣東等地區(qū)的 6 型等。3.2 hcv 基因型檢測方法與試劑傳統(tǒng)的 hcv 血清學分型與分子生物學分型相比，只有 62.1%的符合率。

50、現(xiàn)階段檢測hcv 基因型的分子生物學方法有限制性片段長度多態(tài)性（rflp） 、測序法及反相線性探針雜交法（reverse hybridization line probe assay，lipa）等，目前商品化試劑盒所用的方法主要是后兩種。如 bayer 的 trugene hcv 分型試劑盒和 inno-lipa hcv 基因分型 2.0 試劑盒。分型試劑的檢測靶位點主要集中于保守的 5端非編碼區(qū)，trugene hcv 分型試劑直接對 hcv rna 序列測定來分型，lipa 則是基于反相雜交原理pcr 擴增目的基因（擴增的 dna 被生物素標記） ，與硝酸纖維膜上線形區(qū)帶上的寡核苷酸探針雜

51、交，再加入標記有堿性磷酸酯酶的親和素，與雜交產(chǎn)物上標記的生物素結(jié)合，加入顯色底物 nbt/bcip 孵育后，顯現(xiàn)紫色或棕色的條帶，不同的條帶組合對應不同的基因型。相比第一代產(chǎn)品，二代 lipa hcv 增加了核心區(qū)序列，可準確地區(qū)分 1a 和 1b 型，并可避免東南亞地區(qū)和我國南部地區(qū)較常見的 6c-6l 型被誤分為 1 型，但仍約有 8%的 2a 型易被 lipa 誤判為 1a 型，而這兩種型別的 hcv 感染的治療和預后均存在較大差異。需要注意，不論是 trugene 還是 lipa，均要經(jīng)過 pcr 擴增，對 hcv 混合感染進行分型時，不可避免會因不同型別 rna 擴增效率不一造成的劣

52、勢擴增毒株的漏檢。3.3 直接測序法 hcv 分型操作程序隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，直接測序分型成為目前具有推廣潛力的 hcv 基因型檢測方法。該方法需要對 hcv rna 進行巢式 pcr（nested pcr，亦稱套式 pcr）擴增，套式pcr 是 pcr 衍生技術(shù)中最常用的方法，它使用兩對引物，進行兩次 pcr 反應，能夠極大24地增加 pcr 擴增反應的敏感性和特異性。套式 pcr 第二次反應的引物（內(nèi)引物）位于第一次 pcr 擴增區(qū)域內(nèi)。外引物進行第一次 pcr 擴增后，將第一次 pcr 擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至第二次 pcr 反應管內(nèi)，使用一對內(nèi)引物進行第二次 pcr 擴增反應，最后用凝膠電泳

53、鑒定擴增產(chǎn)物。之后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收目的片段，然后測序。3.3.1 引物設(shè)計原則除遵循 pcr 引物設(shè)計的一般原則以外，hcv 分型主要考慮的是選擇哪一段基因組序列進行分型才能獲得更高的分辨效率。臨床上用于 hcv 基因分型的方法有多種，最常用的是根據(jù) 5端非編碼區(qū)（5ncr）序列差異而進行的基因分型方法，如 inno-lipa、5ncr 序列的直接測序、限制性片段長度多態(tài)性（rflp）-pcr 等，但基于 5ncr 的基因分型方法對不同亞型的分型準確率有較大的差異，對 1b、1a、2a、2b、2c、3a亞型的分型準確率分別為 76%、91%、20%、50%和 96%，

54、幾乎不能對 4a、4b 和 4c 亞型進行區(qū)分，總準確率僅有 76%，這與 5ncr 序列過于保守有關(guān)。因為同一基因型、不同亞型 hcv5ncr 序列的差異度僅為 1.0%3.3%，而 ns5b 基因序列的差異度為16.5%20.1%，ns5b 基因更適合用于 hcv 的基因分型。列舉常用的 pcr 引物：外側(cè)引物：5-tggggatcccgtatgatacccgctgctttga-3 （上游引物）5-ggcggaattcctggtcatagcctccgtgaa-3 （下游引物）擴增的片段長度為401bp內(nèi)側(cè)引物：5-ctcaaccgtcactgagagagacat-3 （上游引物）5-gct

55、ctcaggttccgctcgtcctcc-3 （下游引物，測序引物）擴增的片段長度為339bp3.3.2 擴增體系引物各10100pmol/l4種dntp（datp、dttp或dutp、dctp和dgtp） 各200mol/ltaq dna聚合酶12umg2+1.52.0mmol/l模板dna100ng2000g三蒸水加至50l3.3.3 pcr 條件42 60min，94 5min第 1 輪 pcr 條件為：94 2min94 30s，50 35s，68 2.5min，35 個循環(huán)68 9.5min。第 2 輪：取第 1 輪 pcr 產(chǎn)物 1l 作為模板，進行第 2 輪 pcr，反應條件與

56、第 1 輪相同。253.3.4 切膠純化1%瓊脂糖凝膠電泳之后，對目的片段切割，回收及純化。測序，純化后的 dna 片段測序一般由專業(yè)的測序公司幫助完成，目的片段大小在500600bp 以下可以單向測序，超過 500600bp 的需要雙向測序。3.3.5 結(jié)果分析根據(jù)序列，使用 bioedit 軟件進行基因親緣關(guān)系分析并繪制系統(tǒng)進化樹，得到分型結(jié)果。3.4 hcv 基因分型的臨床意義不同基因型對抗病毒治療的應答不同，采取的治療方案也不同，對rna定量結(jié)果也有一定的影響。基因型的測定有助于決定抗病毒療程和藥物劑量。根據(jù)臨床研究結(jié)果，在1型患者中，抗病毒治療的療程和利巴韋林的用藥劑量不同對持續(xù)病毒

57、學應答（sustained virologic response，svr）有明顯的影響，建議療程為1年，利巴韋林的用量要達到l000l200mg/d，盡管如此，其持續(xù)病毒學應答僅達到40%45；而2和3型患者，療程半年，利巴韋林的用量只要800mg/d即可達到70%80的持續(xù)病毒學應答。延長療程或增加利巴韋林的用量都不能進一步提高svr率。根據(jù)不同的基因型和患者肝臟病理學改變情況調(diào)整療程和利巴韋林的用藥劑量，可以減少不必要的浪費，同時減輕藥物不良反應，提高患者對治療的依從性。26第五章第五章 丙型肝炎病毒檢測策略丙型肝炎病毒檢測策略實驗室對丙型肝炎病毒的檢測可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測等。以診斷

58、為目的的檢測是為了確定個體 hcv 感染狀況，包括臨床檢測、自愿咨詢檢測、根據(jù)特殊需要進行的體檢等；以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播 hcv，包括獻血/漿員篩查和原料血漿篩查；以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群 hcv 感染率及其變化趨勢，包括各類高危人群、重點人群和一般人群。1 1疫情監(jiān)測相關(guān)的檢測策略疫情監(jiān)測相關(guān)的檢測策略使用高敏感性篩查試劑進行初篩，結(jié)果呈陰性，報告抗-hcv 陰性，不再進行復檢；結(jié)果陽性反應，進入復檢程序。所有初篩陽性反應的樣品使用高特異性篩查試劑進行復檢，結(jié)果陰性反應，報告抗-hcv 陰性；結(jié)果陽性反應，報告抗-hcv 陽性。hcv 感染疫情報告檢測流程見圖

59、3。樣品陰性反應初篩試驗初篩試驗陽性反應復檢試驗復檢試驗陰性反應陽性反應報告陰性篩查試劑（高敏感性）報告陽性篩查試劑（高特異性）圖 3 hcv 感染疫情報告檢測流程272 2臨床診斷相關(guān)的檢測策略臨床診斷相關(guān)的檢測策略2.1 初篩試驗樣品驗收合格后，用篩查試劑進行初篩。結(jié)果呈陰性反應，報告抗-hcv陰性；結(jié)果呈陽性反應，進入復檢試驗。2.2 復檢試驗對初篩呈陽性反應的樣品用原有試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理（或廠家）試劑進行復檢試驗。如均呈陰性反應，報告抗-hcv陰性；如均呈陽性反應或一陰一陽反應，則進入補充試驗進行確證。2.3 補充試驗2.3.1 “根據(jù)試劑s/co比值”的方案進行確證對

60、于高s/co比值（當s/co比值特定的閾值時，其補充試驗結(jié)果陽性的預測值95）的篩查試驗（包括初篩及復檢）陽性反應樣品，可報告為抗-hcv陽性，無需再做補充試驗；對于低s/co比值（其s/co比值特定的閾值）的篩查試驗（包括初篩及復檢）陽性反應樣品，應進一步做免疫印跡補充試驗。結(jié)果陰性者，報告抗-hcv陰性；結(jié)果陽性者，報告抗-hcv陽性；結(jié)果可疑者，報告“可疑”并進行隨訪。2.3.2 補充試驗直接進行確證2.3.2.1 復檢試驗陽性反應樣品，進行免疫印跡試驗。結(jié)果陰性者，報告抗-hcv 陰性；結(jié)果陽性者，報告抗-hcv 陽性；結(jié)果可疑者，報告“可疑”并進行隨訪。2.3.2.2 復檢試驗陽性反