細(xì)胞工程第6章：細(xì)胞拆合與克隆技術(shù)2

1、細(xì)胞工程cell engineeringchapter 6chapter 6、細(xì)胞拆合與克隆技術(shù)、細(xì)胞拆合與克隆技術(shù)61 細(xì)胞拆合細(xì)胞拆合611 細(xì)胞拆合技術(shù)發(fā)展概況細(xì)胞拆合技術(shù)發(fā)展概況612 細(xì)胞拆合概念與意義細(xì)胞拆合概念與意義 613 細(xì)胞拆合技術(shù)與關(guān)鍵細(xì)胞拆合技術(shù)與關(guān)鍵62 克隆技術(shù)克隆技術(shù)621 克隆的定義及理論基礎(chǔ)克隆的定義及理論基礎(chǔ)622 細(xì)胞核移植（也是克隆技術(shù)關(guān)鍵）細(xì)胞核移植（也是克隆技術(shù)關(guān)鍵）623 克隆動(dòng)物一般制備技術(shù)克隆動(dòng)物一般制備技術(shù)624 體細(xì)胞克隆技術(shù)體細(xì)胞克隆技術(shù)625 克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義626 存在的問題存在的問題627 克隆技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)克

2、隆技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)61 細(xì)胞拆合細(xì)胞拆合611 細(xì)胞拆合技術(shù)發(fā)展概況細(xì)胞拆合技術(shù)發(fā)展概況612 細(xì)胞拆合概念與意義細(xì)胞拆合概念與意義一、細(xì)胞拆合（一、細(xì)胞拆合（cell reconstruction）：）：是指從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其細(xì)胞組是指從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其細(xì)胞組分，在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的分，在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞器及其組分進(jìn)行重組形成有生物活性細(xì)胞器及其組分進(jìn)行重組形成有生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的一種細(xì)胞工程技術(shù)。的細(xì)胞或細(xì)胞器的一種細(xì)胞工程技術(shù)。二、細(xì)胞拆合過程：二、細(xì)胞拆合過程： 細(xì)胞器及其分離細(xì)胞器及其分離 同種或異種細(xì)胞器與同種或異種細(xì)胞器與組分重組組

3、分重組 新的重組細(xì)胞或新的性狀或產(chǎn)品新的重組細(xì)胞或新的性狀或產(chǎn)品 細(xì)胞核分離、細(xì)胞核分離、 細(xì)胞核細(xì)胞核 胞質(zhì)體的獲得胞質(zhì)體的獲得 融合融合 胞質(zhì)體胞質(zhì)體三、細(xì)胞拆合基本方式（目前）三、細(xì)胞拆合基本方式（目前）四、細(xì)胞拆合意義四、細(xì)胞拆合意義 細(xì)胞拆合技術(shù)是現(xiàn)代生物工程中令人細(xì)胞拆合技術(shù)是現(xiàn)代生物工程中令人矚目的熱點(diǎn)課題，細(xì)胞拆合與細(xì)胞融合矚目的熱點(diǎn)課題，細(xì)胞拆合與細(xì)胞融合技術(shù)是細(xì)胞工程中的細(xì)胞或細(xì)胞器水平技術(shù)是細(xì)胞工程中的細(xì)胞或細(xì)胞器水平上主要構(gòu)建手段，它與基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、上主要構(gòu)建手段，它與基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)等結(jié)合，可以人為地獲得新干細(xì)胞技術(shù)等結(jié)合，可以人為地獲得新物種或使細(xì)胞表達(dá)新的

4、性狀和新的產(chǎn)物。物種或使細(xì)胞表達(dá)新的性狀和新的產(chǎn)物。613 細(xì)胞拆合技術(shù)與關(guān)鍵細(xì)胞拆合技術(shù)與關(guān)鍵一、細(xì)胞拆合技術(shù)方法一、細(xì)胞拆合技術(shù)方法細(xì)胞組分分離技術(shù)細(xì)胞組分分離技術(shù)分級(jí)分離法分級(jí)分離法 細(xì)胞大小、密度細(xì)胞大小、密度密度梯度離心法密度梯度離心法 利用利用 細(xì)胞表面電荷細(xì)胞表面電荷流式細(xì)胞分選儀分離法流式細(xì)胞分選儀分離法 細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 超聲波破碎法超聲波破碎法反復(fù)凍融法：反復(fù)凍融法：-70 37c，重復(fù)，重復(fù)3-4次，次， 細(xì)胞壁破碎細(xì)胞壁破碎化學(xué)裂解法：化學(xué)裂解法：sds（十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉）高速組織搗碎法：需循環(huán)水冷卻高速組織搗碎法：需循環(huán)

5、水冷卻流式細(xì)胞分選儀流式細(xì)胞分選儀去核細(xì)胞（胞質(zhì)體）的制備：（見羅立新表去核細(xì)胞（胞質(zhì)體）的制備：（見羅立新表5-1）核體的制備：核體的制備： 貼壁法純化（見圖貼壁法純化（見圖5-2、5-3） 核體需核體需5-10h再貼壁再貼壁 培養(yǎng)培養(yǎng) 分離分離 完整細(xì)胞需完整細(xì)胞需2h （菲可液梯度離心）（菲可液梯度離心）微核體的制備：微核體的制備： cb具有排核作用，形成的微核體；具有排核作用，形成的微核體； 01ug/ml秋水仙胺，秋水仙胺，48h，處理細(xì)胞，處理細(xì)胞 細(xì)胞微核化細(xì)胞微核化 離心離心14000r/min、20min，80-90% 1-3%牛血清密度梯度離心牛血清密度梯度離心（見圖（見圖

6、5-4） 去核細(xì)胞的性質(zhì)：去核細(xì)胞的性質(zhì)：二、細(xì)胞拆合技術(shù)關(guān)鍵二、細(xì)胞拆合技術(shù)關(guān)鍵細(xì)胞器與完整細(xì)胞融合：細(xì)胞器與完整細(xì)胞融合： ctdna葉綠體葉綠體（抗藥性、色素）（抗藥性、色素） 細(xì)胞器分離細(xì)胞器分離 細(xì)胞器包裹細(xì)胞器包裹 mtdna線粒體線粒體 形成脂質(zhì)體或血影細(xì)胞形成脂質(zhì)體或血影細(xì)胞 與完整細(xì)胞融合與完整細(xì)胞融合生物大分子引入完整細(xì)胞：生物大分子引入完整細(xì)胞： 1975年，童第周、牛滿江，鯉魚或鯽魚年，童第周、牛滿江，鯉魚或鯽魚mrna 鯉金魚鯉金魚 金魚受精卵金魚受精卵 鯽金魚鯽金魚62克隆技術(shù)克隆技術(shù)621 克隆的定義及理論基礎(chǔ)克隆的定義及理論基礎(chǔ)一、克隆（一、克隆（clone）：

7、）： 克隆克隆原意為原意為“扦插的枝條扦插的枝條”無性繁殖系無性繁殖系 基因克?。▽?shí)為基因擴(kuò)增）基因克?。▽?shí)為基因擴(kuò)增） 細(xì)胞克?。▽?shí)為有絲分裂的細(xì)胞集落）細(xì)胞克?。▽?shí)為有絲分裂的細(xì)胞集落） 個(gè)體克?。ㄈ缰参锟旆眰€(gè)體）個(gè)體克?。ㄈ缰参锟旆眰€(gè)體） 引伸為引伸為“克隆操作技術(shù)，即核移殖技術(shù)克隆操作技術(shù)，即核移殖技術(shù)”二、理論基礎(chǔ)：二、理論基礎(chǔ)： 體細(xì)胞具有細(xì)胞全能性體細(xì)胞具有細(xì)胞全能性三、發(fā)展歷程：三、發(fā)展歷程：622 細(xì)胞核移植（也是克隆技術(shù)關(guān)鍵）細(xì)胞核移植（也是克隆技術(shù)關(guān)鍵）一、定義一、定義 細(xì)胞核移植技術(shù)：是指利用顯微操作技術(shù)將細(xì)胞核移植技術(shù)：是指利用顯微操作技術(shù)將某種動(dòng)物細(xì)胞核移入同種或異

8、種動(dòng)物的去核成熟某種動(dòng)物細(xì)胞核移入同種或異種動(dòng)物的去核成熟卵內(nèi)的精細(xì)技術(shù)；卵內(nèi)的精細(xì)技術(shù)； 它可分為胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植；它可分為胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植； 它可用于發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生它可用于發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等問題的研究，實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的物學(xué)等問題的研究，實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的組配，還能培育出新物種。組配，還能培育出新物種。二、發(fā)展歷程二、發(fā)展歷程三、核移植技術(shù)三、核移植技術(shù)供體和受體的準(zhǔn)備供體和受體的準(zhǔn)備 魚類：魚類： 供體供體囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞，囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞， 受體受體成熟的卵細(xì)胞成熟的卵細(xì)胞 發(fā)育發(fā)育 （人工催產(chǎn)、水中激活）（人工

9、催產(chǎn)、水中激活） 時(shí)間時(shí)間 兩棲類：兩棲類： 配合配合 供體供體囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞，囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞， 好好 受體受體成熟卵細(xì)胞（人工針刺）成熟卵細(xì)胞（人工針刺）鳥類、爬行類：未知鳥類、爬行類：未知哺乳類：哺乳類：供體供體早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、體細(xì) 胞；后用體細(xì)胞，如乳腺細(xì)胞、粘胞；后用體細(xì)胞，如乳腺細(xì)胞、粘 膜上皮細(xì)胞；合子核到膜上皮細(xì)胞；合子核到64細(xì)胞期，細(xì)胞期， 0.2%鏈霉蛋白酶預(yù)處理鏈霉蛋白酶預(yù)處理,溶去胚胎溶去胚胎 膠膜及透明帶膠膜及透明帶,分離單個(gè)卵裂球；分離單個(gè)卵裂球； 受體受體去核卵母細(xì)胞、受精卵、去核卵母細(xì)胞、受精卵、2細(xì)胞胚細(xì)胞胚 胎

10、（第一極體成熟時(shí)期去核）；胎（第一極體成熟時(shí)期去核）；去卵膜和卵核去卵膜和卵核用玻璃微針（尖為用玻璃微針（尖為2-4um） 魚卵魚卵借助第二極體標(biāo)志，去核；借助第二極體標(biāo)志，去核； 兩棲卵兩棲卵紫外線去核；紫外線去核； 哺乳卵哺乳卵借助第一極體；借助第一極體；供體細(xì)胞制備：供體細(xì)胞制備： 胚胎或組織機(jī)械切割胚胎或組織機(jī)械切割 置細(xì)胞分離液置細(xì)胞分離液（含胰蛋白酶）處理幾分鐘（含胰蛋白酶）處理幾分鐘 單細(xì)胞短期培養(yǎng)單細(xì)胞短期培養(yǎng)移植移植 選擇合適微吸管（比細(xì)胞核大，比供體細(xì)胞小選擇合適微吸管（比細(xì)胞核大，比供體細(xì)胞?。?，不能多帶細(xì)胞質(zhì)，須），不能多帶細(xì)胞質(zhì)，須30-40min內(nèi)完成操作過內(nèi)完成操

11、作過程，溫度程，溫度16-18c；顯微操縱術(shù)：原子力顯微鏡、顯微操縱儀；顯微操縱術(shù)：原子力顯微鏡、顯微操縱儀；顯微操作儀顯微操作儀核移植操作過核移植操作過程程623 克隆動(dòng)物一般制備技術(shù)克隆動(dòng)物一般制備技術(shù)一、胚胎細(xì)胞核移植法一、胚胎細(xì)胞核移植法世界：世界： 1984年，英，綿羊年，英，綿羊; 1995年，日本；年，日本； 1997年，澳大利亞，孿生牛年，澳大利亞，孿生牛; 1998年，食用牛年，食用牛 目前，小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、羊、猴目前，小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、羊、猴中國：中國： 1990年，中國發(fā)育所，兔；西北農(nóng)大，山羊年，中國發(fā)育所，兔；西北農(nóng)大，山羊; 1991年，臺(tái)灣，豬年

12、，臺(tái)灣，豬 ; 1992年，江蘇農(nóng)科院，兔年，江蘇農(nóng)科院，兔 ; 1995年，中國發(fā)育所與揚(yáng)州大學(xué)，山羊年，中國發(fā)育所與揚(yáng)州大學(xué)，山羊; 1995年，華南師院與廣西師大，克隆雜色牛年，華南師院與廣西師大，克隆雜色牛; 1995年，西北農(nóng)大，豬年，西北農(nóng)大，豬 1996年，湖南醫(yī)科大，小鼠年，湖南醫(yī)科大，小鼠二、胚胎干細(xì)胞核移植：二、胚胎干細(xì)胞核移植： 鼠，鼠，8細(xì)胞前胚胎，細(xì)胞前胚胎， 細(xì)胞全能性明顯細(xì)胞全能性明顯三、胎兒成纖維細(xì)胞核移植：三、胎兒成纖維細(xì)胞核移植： 1996年，年，3只山羊只山羊624 體細(xì)胞克隆技術(shù)體細(xì)胞克隆技術(shù)一、體細(xì)胞克隆技術(shù)：一、體細(xì)胞克隆技術(shù)： 是指將動(dòng)物體細(xì)胞經(jīng)過

13、抑制培養(yǎng)，是指將動(dòng)物體細(xì)胞經(jīng)過抑制培養(yǎng)，使其處于休眠狀態(tài)，利用細(xì)胞核移植技使其處于休眠狀態(tài)，利用細(xì)胞核移植技術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，發(fā)育成胚胎術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，發(fā)育成胚胎后移植到受體，妊娠產(chǎn)仔，克隆出非成后移植到受體，妊娠產(chǎn)仔，克隆出非成體動(dòng)物。體動(dòng)物。 20世紀(jì)，世紀(jì)，50年代，體細(xì)胞克隆出成體年代，體細(xì)胞克隆出成體蛙，但哺乳類個(gè)體不成功蛙，但哺乳類個(gè)體不成功 1997、2、23，英格蘭、愛丁堡羅斯林，英格蘭、愛丁堡羅斯林研究所與研究所與ppl制藥公司，伊恩制藥公司，伊恩.維爾穆特博維爾穆特博士研究小組，用白綿羊細(xì)胞核士研究小組，用白綿羊細(xì)胞核+黑綿羊去黑綿羊去核卵母細(xì)胞，培育出克隆綿

14、羊核卵母細(xì)胞，培育出克隆綿羊“多莉多莉”，現(xiàn)現(xiàn)存活存活 1998、7，美國，夏威夷大學(xué)，用豚鼠細(xì)，美國，夏威夷大學(xué)，用豚鼠細(xì)胞核胞核+黑鼠去核卵細(xì)胞，培育出黑鼠去核卵細(xì)胞，培育出50只克隆鼠只克隆鼠 ，克隆豬，克隆豬 2002、1，中國，克隆牛（盧光銹，中南，中國，克隆牛（盧光銹，中南大學(xué)，干細(xì)胞，克隆人胚胎）大學(xué)，干細(xì)胞，克隆人胚胎） 2005、8，經(jīng)過李寧教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組，經(jīng)過李寧教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組一年多的科技攻關(guān)，一年多的科技攻關(guān)，8月月5日，我國第一頭日，我國第一頭體細(xì)胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生體細(xì)胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生。該項(xiàng)目得到了國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)。該項(xiàng)目得到了國

15、家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃劃“973”項(xiàng)目以及北京市自然科學(xué)基項(xiàng)目以及北京市自然科學(xué)基金資助。金資助。 2005、12，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，高產(chǎn)奶牛體細(xì)胞，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，高產(chǎn)奶牛體細(xì)胞克隆技術(shù)的研究獲得突破，利用成年母奶牛成克隆技術(shù)的研究獲得突破，利用成年母奶牛成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞、胎兒輸纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞、胎兒輸卵管上皮細(xì)胞作為供體核克隆時(shí)重構(gòu)胚的囊胚發(fā)卵管上皮細(xì)胞作為供體核克隆時(shí)重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率，分別為育率，分別為41%、41%46%和和39%?？寺∨咛ァ？寺∨咛サ囊浦埠蟮囊浦埠?0天妊娠檢查時(shí)，妊娠率為天妊娠檢查時(shí)，妊娠率為35.2%（51/145），妊娠母牛早期

16、流產(chǎn)率為），妊娠母牛早期流產(chǎn)率為15.2%（8/51，指妊娠，指妊娠159天前），早產(chǎn)率為天前），早產(chǎn)率為4%（2/51，指妊娠，指妊娠7-8個(gè)月）。個(gè)月）。體細(xì)胞克隆高產(chǎn)奶體細(xì)胞克隆高產(chǎn)奶牛牛 2006、2，美國，美國科學(xué)科學(xué)雜志日宣雜志日宣布，韓國和美國科學(xué)家成功克隆出了人類早布，韓國和美國科學(xué)家成功克隆出了人類早期胚胎，并從中提取出胚胎干細(xì)胞。這是科期胚胎，并從中提取出胚胎干細(xì)胞。這是科學(xué)家首次利用克隆技術(shù)獲得人類胚胎干細(xì)學(xué)家首次利用克隆技術(shù)獲得人類胚胎干細(xì)胞。胞。漢城國立大學(xué)和美國密歇根州立大學(xué)等漢城國立大學(xué)和美國密歇根州立大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家參與了這項(xiàng)研究。名健康機(jī)構(gòu)的科學(xué)家參與了這項(xiàng)

17、研究。名健康婦女為這項(xiàng)研究志愿捐獻(xiàn)了個(gè)卵細(xì)胞婦女為這項(xiàng)研究志愿捐獻(xiàn)了個(gè)卵細(xì)胞以及被稱為卵丘細(xì)胞的體細(xì)胞。以及被稱為卵丘細(xì)胞的體細(xì)胞。 科學(xué)家們從卵丘細(xì)胞內(nèi)提取出細(xì)胞核，然后將其科學(xué)家們從卵丘細(xì)胞內(nèi)提取出細(xì)胞核，然后將其植入同一位婦女去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，并采用植入同一位婦女去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，并采用化學(xué)手段刺激卵細(xì)胞分裂，共有個(gè)克隆細(xì)胞經(jīng)化學(xué)手段刺激卵細(xì)胞分裂，共有個(gè)克隆細(xì)胞經(jīng)過約天的時(shí)間發(fā)育到至少幾十個(gè)細(xì)胞組成的、被過約天的時(shí)間發(fā)育到至少幾十個(gè)細(xì)胞組成的、被稱為胚囊的早期胚胎階段?？茖W(xué)家們從這些胚囊中稱為胚囊的早期胚胎階段?？茖W(xué)家們從這些胚囊中分離出個(gè)內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)，并在此基礎(chǔ)上最終獲得分

18、離出個(gè)內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)，并在此基礎(chǔ)上最終獲得一個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)顯示，利用這種辦法一個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)顯示，利用這種辦法獲得的胚胎干細(xì)胞具有多能性，可分化成骨骼細(xì)獲得的胚胎干細(xì)胞具有多能性，可分化成骨骼細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和未成熟的腦細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。胞、肌肉細(xì)胞和未成熟的腦細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。 克隆人早期胚胎克隆人早期胚胎(1)克隆人早期胚克隆人早期胚胎胎(2) 2006、3，中國首批轉(zhuǎn)基因體，中國首批轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛的再克隆體日前成功細(xì)胞克隆牛的再克隆體日前成功降生。降生?？寺⊙蚪韪股咏虺锹涞乜寺⊙蚪韪股咏虺锹涞?克隆動(dòng)物可以自然交配克隆動(dòng)物可以自然交配 中國轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)再破難關(guān)中國轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)再破難關(guān) 熒光小豬熒光小豬 625 克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義一、無性繁殖意義為：有利于保護(hù)柔弱的一、無性繁殖意義為：有利于保護(hù)柔弱的 胚胎期；有利于大量快速繁殖。胚胎期；有利于大量快速繁殖。二、檢驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞全能性（理論上）；二、檢驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞全能性（理論上）；三、加速動(dòng)物繁殖，優(yōu)良育種，保護(hù)珍稀三、加速動(dòng)物繁殖，優(yōu)良育種，保護(hù)珍稀 動(dòng)物；動(dòng)物；四、用于醫(yī)