最新分子熒光分析新技術(shù)

1、 第四章第四章分子熒光分析新技術(shù)分子熒光分析新技術(shù) 4.1 分子熒光光分析法概論分子熒光光分析法概論 一定量分析一定量分析 a =-lgt =bc t = f ( ) f =f 若用級(jí)數(shù)展開，略去高次項(xiàng)，得若用級(jí)數(shù)展開，略去高次項(xiàng)，得f = 2.303f kc k = bf稱為熒光的量子產(chǎn)率稱為熒光的量子產(chǎn)率，f 0iittii 0)1( 303.20bcei 0i吸吸收收的的量量子子數(shù)數(shù)發(fā)發(fā)出出的的量量子子數(shù)數(shù) 二影響發(fā)光強(qiáng)度的因素二影響發(fā)光強(qiáng)度的因素 f = xcffkkkk s* skc kf kx tkp kc 討論討論1. kf主要取決于分子結(jié)構(gòu)，受環(huán)境影響較小。主要取決于分子結(jié)構(gòu)，

2、受環(huán)境影響較小。 max 可作為可作為kf的定性度量的定性度量 max大，大，a大，大，kf大大 例如例如 * * nn* * 具有多重共軛雙鍵的分子發(fā)射的熒光較強(qiáng)具有多重共軛雙鍵的分子發(fā)射的熒光較強(qiáng)2. kc受環(huán)境影響最為強(qiáng)烈受環(huán)境影響最為強(qiáng)烈( (無(wú)輻射去活速率常數(shù)）無(wú)輻射去活速率常數(shù)） t升高，分子碰撞的幾率增加，升高，分子碰撞的幾率增加，kc變大變大 3. kx為內(nèi)交聯(lián)的速率常數(shù)為內(nèi)交聯(lián)的速率常數(shù) kx既受分子結(jié)構(gòu)的影響，也在一定程度上受環(huán)境的既受分子結(jié)構(gòu)的影響，也在一定程度上受環(huán)境的 影響。影響。 kx：（：（1）對(duì)）對(duì)* *nn，k kx xk kf f 對(duì)對(duì)* *，k kx xk

3、kf f （2）溶劑的極性影響分子躍遷類型）溶劑的極性影響分子躍遷類型 喹啉在苯中喹啉在苯中 * *nn 在極性在極性s s * * 喹啉在苯、乙醇、水中的喹啉在苯、乙醇、水中的f分別為分別為1，30，1000 (1) kx依賴于依賴于s*tt的距離的距離 距離越小，距離越小，kx越大越大(2) 重原子效應(yīng)重原子效應(yīng) 在含有在含有軌道上的分子引入重原子之后，軌道上的分子引入重原子之后，k kx x變大變大 氟苯氟苯 f 0.16 氯苯氯苯 f 0.05 溴苯溴苯 f 0.01 碘苯碘苯 f 0(3) 不成對(duì)自旋的順磁物質(zhì)，也發(fā)現(xiàn)會(huì)增大系內(nèi)交聯(lián)速率不成對(duì)自旋的順磁物質(zhì)，也發(fā)現(xiàn)會(huì)增大系內(nèi)交聯(lián)速率

4、例如：鋅卟啉二甲酯螯合物具有中等強(qiáng)度的熒光和磷光例如：鋅卟啉二甲酯螯合物具有中等強(qiáng)度的熒光和磷光, 銅卟啉二甲酯螯合物的熒光減弱，磷光增強(qiáng)銅卟啉二甲酯螯合物的熒光減弱，磷光增強(qiáng) 三分子發(fā)光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系三分子發(fā)光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系 要使分子產(chǎn)生熒光，則分子結(jié)構(gòu)能吸收要使分子產(chǎn)生熒光，則分子結(jié)構(gòu)能吸收uv-vis輻射輻射, 且要有較高的熒光效率。且要有較高的熒光效率。(1)若分子吸收若分子吸收uv-vis輻射能力越強(qiáng)，發(fā)光越輻射能力越強(qiáng)，發(fā)光越 強(qiáng)；強(qiáng)；(2)能強(qiáng)烈發(fā)光的分子幾乎都是經(jīng)過能強(qiáng)烈發(fā)光的分子幾乎都是經(jīng)過* * 躍遷，具有共軛雙鍵、剛性較強(qiáng)的平面和躍遷，具有共軛雙鍵、剛性較強(qiáng)的平面和 多環(huán)結(jié)構(gòu)

5、的分子易于發(fā)光。多環(huán)結(jié)構(gòu)的分子易于發(fā)光。 取代基對(duì)分子發(fā)光有顯著影響取代基對(duì)分子發(fā)光有顯著影響（1） 給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng) 如如nhnh2 2，ohoh（2） 吸電子基團(tuán)使熒光減弱或熄滅吸電子基團(tuán)使熒光減弱或熄滅 如如cooh，no2，nn 剛性強(qiáng)的分子剛性強(qiáng)的分子f大大 如環(huán)的封閉作用使分子剛性增強(qiáng)如環(huán)的封閉作用使分子剛性增強(qiáng) 芴芴 f 1.0 聯(lián)二苯聯(lián)二苯 f 0.2 有機(jī)螯合劑與金屬離子形成配鍵時(shí)，有機(jī)螯合劑與金屬離子形成配鍵時(shí)， 剛性剛性 增強(qiáng)增強(qiáng) 8-羥基喹啉與羥基喹啉與zn f 8-羥基喹啉羥基喹啉 f 四儀器四儀器 與與uv-vis的區(qū)別：的區(qū)別： 1.檢

6、測(cè)方向與入射方向檢測(cè)方向與入射方向垂直，以便使被散射垂直，以便使被散射的入射光的直接檢出的入射光的直接檢出減至減至最少最少2.兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器 3.檢測(cè)池四面透明檢測(cè)池四面透明 4.激發(fā)光譜激發(fā)光譜 5.發(fā)射光譜發(fā)射光譜 lm1sm2dr五溶液熒光的熄滅五溶液熒光的熄滅 熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強(qiáng)度熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強(qiáng)度降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質(zhì)分子降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，這些會(huì)引起熒光的熄滅的物質(zhì)光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，這些會(huì)

7、引起熒光的熄滅的物質(zhì)稱為稱為熄滅劑熄滅劑 。 狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和熒光物質(zhì)分子之間發(fā)生相互作用而引起熒光物質(zhì)分熒光物質(zhì)分子之間發(fā)生相互作用而引起熒光物質(zhì)分子的子的熒光效率降低或熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)的壽命縮熒光效率降低或熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)的壽命縮短短，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。 著名的熄滅劑著名的熄滅劑: 鹵素離子鹵素離子 重金屬離子重金屬離子 氧分子氧分子 硝基化合物硝基化合物 鹵素離子對(duì)于奎寧的熒光有顯著的熄滅鹵素離子對(duì)于奎寧的熒光有顯著的熄滅作用，但對(duì)某些物質(zhì)的熒光并不發(fā)生熄滅作作用，但對(duì)某些物質(zhì)的熒光并不發(fā)生熄滅作

8、用，這表明熄滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相用，這表明熄滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互是有選擇性的?；ナ怯羞x擇性的。 熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低待熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低待測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的不良作用，但另一方面，測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的不良作用，但另一方面，我們可以利用某一物質(zhì)對(duì)某一熒光物質(zhì)的熄我們可以利用某一物質(zhì)對(duì)某一熒光物質(zhì)的熄滅作用建立對(duì)該物質(zhì)的熒光熄滅法檢測(cè)。該滅作用建立對(duì)該物質(zhì)的熒光熄滅法檢測(cè)。該法常具有更高的選擇性。法常具有更高的選擇性。 1.碰撞熄滅碰撞熄滅 溶液中熒光物質(zhì)分子溶液中熒光物質(zhì)分子m和熄滅劑和熄滅劑q相碰撞相碰撞 而引起熒光熄滅。而引起熒光熄滅。 比較速率比較速率(

9、1)(1)m mh hmm* *( (吸光吸光) 1) 1 (2)(2)m m* * m mh h ( (發(fā)生熒光發(fā)生熒光) k) k1 1 m m* * (3)(3)m m* * +q m+q+ +q m+q+熱熱 k k2 2 m m* * qq 1k 2kstern-volmerstern-volmer方程式方程式 k k：熄滅常數(shù)：熄滅常數(shù) qq：熄滅劑濃度：熄滅劑濃度(m)(m) f f0 0,f,f分別是熄滅劑分別是熄滅劑q q不存在時(shí)及存在時(shí)的不存在時(shí)及存在時(shí)的溶液的熒光強(qiáng)度溶液的熒光強(qiáng)度)(1072321rdrdprktt 10qkff 2. 組成化合物的熄滅組成化合物的熄滅

10、某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之后，溶液的吸收光譜有了顯著的改變，溶液的后，溶液的吸收光譜有了顯著的改變，溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低熒光強(qiáng)度顯著降低; 隨著溫度的升高，熒光強(qiáng)隨著溫度的升高，熒光強(qiáng)度而增強(qiáng)。度而增強(qiáng)。 上述情況可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子上述情況可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子m與熄滅劑分子與熄滅劑分子q作用而生成了絡(luò)合物作用而生成了絡(luò)合物mq，如，如絡(luò)合物絡(luò)合物mq的形成是由于微弱的范德華引力的的形成是由于微弱的范德華引力的作用，則所形成的絡(luò)合物并不發(fā)生熒光，且作用，則所形成的絡(luò)合物并不發(fā)生熒光，且對(duì)對(duì)solusolu的吸收并不發(fā)生任何影響。的吸收

11、并不發(fā)生任何影響。能能量量降降低低 hmmmhmhmqmqq m1k* 發(fā)生熒光的物質(zhì)仍為發(fā)生熒光的物質(zhì)仍為m m* *分子，品種并沒有改分子，品種并沒有改變，所以熒光分子的平均壽命也沒有改變，至于變，所以熒光分子的平均壽命也沒有改變，至于solusolu溫度升高熒光強(qiáng)度之所以增強(qiáng)，可能是由于溫度升高熒光強(qiáng)度之所以增強(qiáng)，可能是由于溫度升高時(shí)該絡(luò)合物較不穩(wěn)定，較多地分解為溫度升高時(shí)該絡(luò)合物較不穩(wěn)定，較多地分解為m m和和q q分子的緣故。這一點(diǎn)可以作為這一類型熄滅分子的緣故。這一點(diǎn)可以作為這一類型熄滅不同于碰撞熄滅的標(biāo)志。不同于碰撞熄滅的標(biāo)志。 如果絡(luò)合物如果絡(luò)合物mqmq的形成是由于強(qiáng)大的力，

12、則絡(luò)的形成是由于強(qiáng)大的力，則絡(luò)合物合物mqmq將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光譜也將發(fā)生改變。譜也將發(fā)生改變。3.轉(zhuǎn)入三重線級(jí)的熄滅轉(zhuǎn)入三重線級(jí)的熄滅 e c位位 e 能能 * * g d a bcbd處于單線態(tài)的基態(tài)處于單線態(tài)的基態(tài)egf為第一激發(fā)單線態(tài)為第一激發(fā)單線態(tài)虛線為激發(fā)三線態(tài)虛線為激發(fā)三線態(tài) 當(dāng)由單線態(tài)轉(zhuǎn)移至三線態(tài)時(shí)，多余的振當(dāng)由單線態(tài)轉(zhuǎn)移至三線態(tài)時(shí)，多余的振動(dòng)能在碰撞中損失掉，動(dòng)能在碰撞中損失掉，solu中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入三重線級(jí)的分子在一般溫度下是不會(huì)發(fā)光三重線級(jí)的分子在一般溫度下是不會(huì)發(fā)光的，它們把多余的能量消耗于它們與其它的

13、，它們把多余的能量消耗于它們與其它分子的碰撞之中，分子的碰撞之中，因因而引起熒光的熄滅而引起熒光的熄滅 。 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在低溫下可由三線轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在低溫下可由三線態(tài)重新返回到基態(tài)，在這一過程中將放出態(tài)重新返回到基態(tài)，在這一過程中將放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的磷光。波長(zhǎng)較長(zhǎng)的磷光。 含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些雜環(huán)化合物基及某些雜環(huán)化合物容易轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，容易轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變系有系有強(qiáng)烈磁場(chǎng)的誘導(dǎo)作用強(qiáng)烈磁場(chǎng)的誘導(dǎo)作用所引起的，在原所引起的，在原子核附近，尤其是在子核附近，尤其是在br或或i

14、這樣重的原子這樣重的原子核附近，存在著強(qiáng)烈的磁場(chǎng)，所以含溴、核附近，存在著強(qiáng)烈的磁場(chǎng)，所以含溴、碘的化合物容易使溶液熒光熄滅碘的化合物容易使溶液熒光熄滅。 幾乎所有會(huì)發(fā)生熒光的有機(jī)化合物都會(huì)幾乎所有會(huì)發(fā)生熒光的有機(jī)化合物都會(huì)被溶解在溶液中的氧分子熄滅劑熄滅到不同被溶解在溶液中的氧分子熄滅劑熄滅到不同的程度。的程度。 三線態(tài)的氧分子和單線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞三線態(tài)的氧分子和單線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞 單線態(tài)的氧分子和三線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞單線態(tài)的氧分子和三線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞 4. 4. 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅 某些熄滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時(shí)，某些熄滅劑分子與熒光

15、物質(zhì)分子相互作用時(shí)，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即氧化還原反應(yīng)，即引發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即氧化還原反應(yīng)，即引起熒光的熄滅。起熒光的熄滅。 例：甲基藍(lán)熒光溶液被例：甲基藍(lán)熒光溶液被fefe2+2+離子熄滅離子熄滅 d + + h d* d* d + + h d * + fe2+ d + fe3+ d + h dh（半醌）（半醌） 2dh d + dh2 （無(wú)色染料）（無(wú)色染料） 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅劑并不限于金發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅劑并不限于金屬離子，屬離子，i，br，cns，s2o32等易于等易于給出電子的陰離子對(duì)奎寧，羅丹明及熒光素給出電子的陰離子對(duì)奎寧，羅丹明及熒光素鈉等有機(jī)熒光物質(zhì)也會(huì)發(fā)生熄滅

16、作用。鈉等有機(jī)熒光物質(zhì)也會(huì)發(fā)生熄滅作用。5. 熒光物質(zhì)的自熄滅熒光物質(zhì)的自熄滅 當(dāng)當(dāng)c 1m時(shí)，常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。時(shí)，常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。 自熄滅的原因是多樣的：自熄滅的原因是多樣的： （1）m* m 例：例：f熄滅熄滅 苯和蒽苯和蒽 （2）多聚體的形成）多聚體的形成 多聚體與單體具有不同的吸收光譜，但不多聚體與單體具有不同的吸收光譜，但不會(huì)發(fā)生熒光或熒光強(qiáng)度很弱。會(huì)發(fā)生熒光或熒光強(qiáng)度很弱。 消除：消除： （1）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃度增大而加大，因此若對(duì)度增大而加大，因此若對(duì)solu稀釋可消稀釋可消除或減低熒光的熄滅作用；除或減低熒光的熄滅作用； （2）溶解

17、氧的除去，通入氮?dú)?。）溶解氧的除去，通入氮?dú)?。六? 散射光和拉曼光對(duì)于熒光分析的干擾散射光和拉曼光對(duì)于熒光分析的干擾1. 散射光對(duì)于熒光分析的干擾散射光對(duì)于熒光分析的干擾 光通過物質(zhì)時(shí)，有小部分在側(cè)向散射開來，光通過物質(zhì)時(shí)，有小部分在側(cè)向散射開來， 這種現(xiàn)象叫做這種現(xiàn)象叫做光的散射光的散射。 若散射光的頻率與入射光的頻率相同，則若散射光的頻率與入射光的頻率相同，則 稱為稱為溶劑的瑞利散射光溶劑的瑞利散射光。 若散射光的頻率與入射光的頻率不同，則若散射光的頻率與入射光的頻率不同，則 稱為稱為溶劑的拉曼光溶劑的拉曼光。 f 450 320 640 360 720 320 nm瑞利散射光瑞利散射光

18、 360 nm水溶劑的拉曼光水溶劑的拉曼光光柵分光光柵分光640 nm，720 nm分別是二級(jí)的瑞利散射光和拉曼光分別是二級(jí)的瑞利散射光和拉曼光0.04gg奎寧奎寧/ml0.1n h/ml0.1n h2 2soso4 4exex 320 nm320 nm上述這些峰均會(huì)在空白實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)上述這些峰均會(huì)在空白實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn) 散射光和拉曼光對(duì)熒光分析有顯著的影響，必散射光和拉曼光對(duì)熒光分析有顯著的影響，必須消除。須消除。 熒光分光光度計(jì)：熒光分光光度計(jì)： 濾光片熒光計(jì)濾光片熒光計(jì) 若熒光峰的波長(zhǎng)與激發(fā)光的波長(zhǎng)很接近，則由若熒光峰的波長(zhǎng)與激發(fā)光的波長(zhǎng)很接近，則由散光所應(yīng)起的誤差將嚴(yán)重地影響方法的靈敏度，可散

19、光所應(yīng)起的誤差將嚴(yán)重地影響方法的靈敏度，可調(diào)節(jié)熒光計(jì)的狹縫寬度。調(diào)節(jié)熒光計(jì)的狹縫寬度。 液槽液槽 探測(cè)器的窗口探測(cè)器的窗口 2. 溶劑的拉曼光及其對(duì)熒光光譜的干擾溶劑的拉曼光及其對(duì)熒光光譜的干擾 拉曼光沒有確定的波長(zhǎng)，但它的頻率和激發(fā)拉曼光沒有確定的波長(zhǎng)，但它的頻率和激發(fā)光的頻率卻有一定的差值。光的頻率卻有一定的差值。 例：在不同汞射線照射下水的拉曼光的波長(zhǎng)例：在不同汞射線照射下水的拉曼光的波長(zhǎng) exex(nm)(nm) 248 313 365 405 436水（水（q） 271 350 416 469 511波數(shù)波數(shù)（-1-1） 0.339 0.339 0.340 0.335(1)差別差別

20、熒光有一定的波長(zhǎng)，而與激發(fā)光的頻率無(wú)熒光有一定的波長(zhǎng)，而與激發(fā)光的頻率無(wú)關(guān)，拉曼光隨著激發(fā)波長(zhǎng)而改變；關(guān)，拉曼光隨著激發(fā)波長(zhǎng)而改變； 拉曼光發(fā)生的時(shí)間比熒光快一千萬(wàn)倍；拉曼光發(fā)生的時(shí)間比熒光快一千萬(wàn)倍； 拉曼光強(qiáng)度很弱。拉曼光強(qiáng)度很弱。表表1 在不同汞射線照射下數(shù)種主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)在不同汞射線照射下數(shù)種主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng) solvent solvent exex(nm)(nm) 248 313 365 405 436 248 313 365 405 436 水水 271 350 416 469 511271 350 416 469 511 乙醇乙醇 267 344 409 459 500

21、267 344 409 459 500 環(huán)己烷環(huán)己烷 267 344 408 458 499267 344 408 458 499 四氯化碳四氯化碳 - 320 375 418 450- 320 375 418 450 氯仿氯仿 - 346 410 461 502- 346 410 461 502 表表2 在不同汞射線照射下在不同汞射線照射下 拉曼光與激發(fā)光的波數(shù)差值拉曼光與激發(fā)光的波數(shù)差值（-1-1） solvent solvent exex(nm) (nm) 平均差值平均差值(-1-1) ) 248 313 365 465 248 313 365 465 水水 0.339 0.339 0.

22、340 0.335 0.3380.339 0.339 0.340 0.335 0.338 甲醇甲醇 0.292 0.292 0.293 0.290 0.2920.292 0.292 0.293 0.290 0.292 0.143 0.143 0.141 0.134 0.140 0.143 0.143 0.141 0.134 0.140 環(huán)己烷環(huán)己烷 0.287 0.287 0.291 0.285 0.2880.287 0.287 0.291 0.285 0.288 0.137 0.138 0.135 0.132 0.136 0.137 0.138 0.135 0.132 0.136 四氯化碳四

23、氯化碳 - 0.073 0.079 0.071 0.074- 0.073 0.079 0.071 0.074 氯仿氯仿 - 0.073 0.073 0.065 0.070- 0.073 0.073 0.065 0.070 - 0.301 0.301 0.304 0.302 - 0.301 0.301 0.304 0.302 （2）拉曼譜線與激發(fā)光的頻率差值及波數(shù)）拉曼譜線與激發(fā)光的頻率差值及波數(shù)差值是分子的振動(dòng)能級(jí)與轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷的差值是分子的振動(dòng)能級(jí)與轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷的結(jié)果，拉曼光的頻率和激發(fā)光的頻率之間結(jié)果，拉曼光的頻率和激發(fā)光的頻率之間的差值相當(dāng)于分子的振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)頻率，對(duì)的差值相當(dāng)于分子的振動(dòng)轉(zhuǎn)

24、動(dòng)頻率，對(duì)于某一給定的物質(zhì)，頻率差值是恒定不變于某一給定的物質(zhì)，頻率差值是恒定不變的，而和激發(fā)光的頻率無(wú)關(guān)。的，而和激發(fā)光的頻率無(wú)關(guān)。first eeslaser frequency（vitual es） 0 218 314 459762790 h0 h0h0h0stokesh(0- ) )antistokes （3）拉曼光的消除）拉曼光的消除 選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻x擇適當(dāng)?shù)娜軇?選用合適的激發(fā)光波長(zhǎng)選用合適的激發(fā)光波長(zhǎng) e=e= h=h=h =h=h c c 4.2 三維熒光光譜法三維熒光光譜法 total luminescencetotal luminescence spectrometry s

25、pectrometry 一般熒光法對(duì)復(fù)雜混合物熒光光譜難以一般熒光法對(duì)復(fù)雜混合物熒光光譜難以分辨，因而使它的應(yīng)用受到限制。分辨，因而使它的應(yīng)用受到限制。 f是是exex、emem的函數(shù)。的函數(shù)。 total luminescence（tls） two-dimensional spectra（tds） topograms一一. 三維熒光光譜圖的表示方法三維熒光光譜圖的表示方法1. 三維投影圖（三維投影圖（isometric projection） 以以emem為為x軸，軸， exex為為y軸，軸，f為為z軸而構(gòu)成軸而構(gòu)成的三維投影圖。的三維投影圖。 y軸軸由小到大由小到大 正面圖正面圖 y軸軸由

26、大到小由大到小 背面圖背面圖 2. 等高線圖（等高線圖（contour plats） 以以emem為為x軸，軸， exex為為y軸，把熒光強(qiáng)度相軸，把熒光強(qiáng)度相等的點(diǎn)用線連接起來，則在平面上形成等高線等的點(diǎn)用線連接起來，則在平面上形成等高線圖，稱為等高線熒光光譜圖。圖，稱為等高線熒光光譜圖。二二. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. 一般的熒光分光光度計(jì)一般的熒光分光光度計(jì) 分別測(cè)定各個(gè)不同激發(fā)波長(zhǎng)下熒光發(fā)射分別測(cè)定各個(gè)不同激發(fā)波長(zhǎng)下熒光發(fā)射光譜，根據(jù)所得數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)繪制三維投影光譜，根據(jù)所得數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)繪制三維投影圖或等高線圖。圖或等高線圖。 此法非常麻煩，耗時(shí)。此法非常麻煩，耗時(shí)。2. 電視熒光計(jì)（電視

27、熒光計(jì)（videofluorometer） 電視熒光計(jì)使用快速掃描多道檢測(cè)器，電視熒光計(jì)使用快速掃描多道檢測(cè)器，如光導(dǎo)攝像管在幾毫秒內(nèi)以矩陣的形式收集如光導(dǎo)攝像管在幾毫秒內(nèi)以矩陣的形式收集數(shù)據(jù)，光導(dǎo)攝像管的光敏表面可看成是幾千數(shù)據(jù)，光導(dǎo)攝像管的光敏表面可看成是幾千個(gè)檢測(cè)器的二維排列。個(gè)檢測(cè)器的二維排列。 red yellow greenblue uvemissionpolychromator vidicon exexememexcitationpolychromatorsample3. 光二極管陣列熒光計(jì)光二極管陣列熒光計(jì)(the photodiode array fluorenometer)

28、 與二維光導(dǎo)攝像管檢測(cè)器相比，光二極管陣與二維光導(dǎo)攝像管檢測(cè)器相比，光二極管陣列是一維檢測(cè)器。為了得到光二極管檢測(cè)器，熒列是一維檢測(cè)器。為了得到光二極管檢測(cè)器，熒光分光光度計(jì)的光電倍增管和單色器必須被二極光分光光度計(jì)的光電倍增管和單色器必須被二極管陣列和多色器所取代。管陣列和多色器所取代。三三. 三維射影圖和等高圖的特點(diǎn)三維射影圖和等高圖的特點(diǎn)1. 三維投影圖比較直觀地觀察激發(fā)發(fā)射波三維投影圖比較直觀地觀察激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的信息；長(zhǎng)對(duì)所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的信息；2. 三維投影圖難以用于相似樣品的定量測(cè)定；三維投影圖難以用于相似樣品的定量測(cè)定；3. 等高線圖可用于相似樣品的定量比較。等

29、高線圖可用于相似樣品的定量比較。四四. 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用1. 血清血清 tds已經(jīng)被廣泛用于多環(huán)芳香碳?xì)浠呀?jīng)被廣泛用于多環(huán)芳香碳?xì)浠衔锓治?、液相色譜、細(xì)菌指紋、地球化合物分析、液相色譜、細(xì)菌指紋、地球化學(xué)、煤化作用研究和光化學(xué)研究，在生物學(xué)、煤化作用研究和光化學(xué)研究，在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是較新的應(yīng)用研究。醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是較新的應(yīng)用研究。 從血管直接抽取的血樣稱為從血管直接抽取的血樣稱為全血全血。 全血經(jīng)放置之后，自然分為兩層，上全血經(jīng)放置之后，自然分為兩層，上層清析。稱為層清析。稱為血清血清(serum)。 全血加抗凝劑以后，放置一段時(shí)間后，全血加抗凝劑以后，放置一段時(shí)間后，也會(huì)分為兩

30、層，上層的清液稱為也會(huì)分為兩層，上層的清液稱為血漿血漿(plasma)。 血漿比血清多一種膠原蛋白。血漿比血清多一種膠原蛋白。 a. 小白鼠小白鼠 血清是由大量的物質(zhì)所組成，但僅少數(shù)物血清是由大量的物質(zhì)所組成，但僅少數(shù)物質(zhì)對(duì)血清的熒光有貢獻(xiàn)。在質(zhì)對(duì)血清的熒光有貢獻(xiàn)。在紫外區(qū)紫外區(qū)，熒光是由，熒光是由于蛋白質(zhì)上色氨酸的熒光所致，因?yàn)閺睦野彼嵊诘鞍踪|(zhì)上色氨酸的熒光所致，因?yàn)閺睦野彼岬缴彼岱浅Ｓ行У姆肿娱g能量傳遞。到色氨酸非常有效的分子間能量傳遞。 leinev報(bào)道了正常報(bào)道了正常小白鼠小白鼠血清血清uv熒光和熒光和肝癌帶病小白鼠肝癌帶病小白鼠uv熒光的變化，具有腫瘤的熒光的變化，具有腫瘤的小白鼠

31、的單一熒光峰向短波方向移動(dòng)，且峰高小白鼠的單一熒光峰向短波方向移動(dòng)，且峰高降低。降低。 在他的進(jìn)一步報(bào)道中，健康和具在他的進(jìn)一步報(bào)道中，健康和具有腫瘤的小白鼠的有腫瘤的小白鼠的可見熒光可見熒光地貌圖被地貌圖被報(bào)道，僅一個(gè)熒光峰被發(fā)現(xiàn)，暫時(shí)被報(bào)道，僅一個(gè)熒光峰被發(fā)現(xiàn)，暫時(shí)被認(rèn)為是認(rèn)為是nad(p)h(煙酰胺腺嘌呤二核煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸苷酸磷酸)的熒光所致，通過聚類分的熒光所致，通過聚類分析熒光參數(shù)，可使具有腫瘤的小鼠與析熒光參數(shù)，可使具有腫瘤的小鼠與正常小鼠區(qū)分開來。正常小鼠區(qū)分開來。 b. 人血清人血清 人血清的總熒光光譜也可被分為紫外人血清的總熒光光譜也可被分為紫外和可見兩個(gè)區(qū)域。在紫

32、外區(qū)的單一熒光峰和可見兩個(gè)區(qū)域。在紫外區(qū)的單一熒光峰是由于血清蛋白的強(qiáng)熒光峰所致，它的最是由于血清蛋白的強(qiáng)熒光峰所致，它的最大值為大值為287/337nm，它與相同實(shí)驗(yàn)條件下，它與相同實(shí)驗(yàn)條件下色氨酸的熒光峰完全一致。由于蛋白質(zhì)結(jié)色氨酸的熒光峰完全一致。由于蛋白質(zhì)結(jié)合的色氨酸的熒光強(qiáng)烈地受環(huán)境的影響，合的色氨酸的熒光強(qiáng)烈地受環(huán)境的影響，因此血清寬的熒光峰可能是由于各種血清因此血清寬的熒光峰可能是由于各種血清蛋白的熒光峰的加合。蛋白的熒光峰的加合。 fig.5在可見光區(qū)域觀察到的熒光峰可能是由下列物質(zhì)所致：在可見光區(qū)域觀察到的熒光峰可能是由下列物質(zhì)所致： nad(p)h (345/460nm)

33、蛋白質(zhì)結(jié)合的吡哆醛磷酸鹽蛋白質(zhì)結(jié)合的吡哆醛磷酸鹽(410/500nm) 蝶啶蝶啶(360/425nm) 蛋白質(zhì)結(jié)合的膽紅素蛋白質(zhì)結(jié)合的膽紅素(460/515nm) 黃素黃素fig.6(1)血清超濾液血清超濾液 血清超濾液的血清超濾液的uv部分顯示兩個(gè)熒光峰，部分顯示兩個(gè)熒光峰，280/302nm，286/357nm，這是自由的，這是自由的trp和和tyr所致，與全血樣品相比，所致，與全血樣品相比，tyr的熒光的小部的熒光的小部分被傳遞給分被傳遞給trp，因此顯示出它自己的熒光峰。，因此顯示出它自己的熒光峰。當(dāng)當(dāng)trp，tyr不被蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，不被蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，tyr和和trp相距相距較遠(yuǎn)。較遠(yuǎn)。 在在vis區(qū)域，血清超濾液的熒光因人而有區(qū)域，血清超濾液的熒光因人而有較大的差異，較大的差異， nad(p)h 和吡哆醛磷酸鹽的熒和吡哆醛磷酸鹽的熒光峰不可探測(cè)，這是因?yàn)樵诔瑸V中它們難以從光峰不可探測(cè)