理論3：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及引物設(shè)計(jì)

1、 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班主講人：劉彩云主講人：劉彩云 理論三：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)理論三：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及引物設(shè)計(jì)及引物設(shè)計(jì)2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班p 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 的技術(shù)原理的技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)操作p PCR引物設(shè)計(jì)軟件的使用（引物設(shè)計(jì)軟件的使用（ Primer Premier 5.0 ）C2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)原理（PCRPCR及引物設(shè)計(jì)）及引物設(shè)

2、計(jì)）2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)?zāi)康膙 了解了解PCR的基本原理的基本原理v 掌握掌握PCR的基本操作技術(shù)的基本操作技術(shù) v 學(xué)習(xí)引物設(shè)計(jì)的原則及引物設(shè)計(jì)軟件學(xué)習(xí)引物設(shè)計(jì)的原則及引物設(shè)計(jì)軟件Primer5的使用的使用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)原理（PCRPCR及引物設(shè)計(jì)）及引物設(shè)計(jì)）2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4

3、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)原理 PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班PCR技術(shù)原理v 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。v PCR不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，

4、還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班PCR技術(shù)原理 以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5末端和3末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班PCR技術(shù)原理模板與引物的復(fù)性,引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。Tm-5Tm-5C C在

5、加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA9494C C從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，按53的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈7272C C變性變性退火退火延伸延伸2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班PCR技術(shù)原理2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 PCR出現(xiàn)的問題： PCR擴(kuò)增未得到目的條帶？ 擴(kuò)增出目的條帶之外的多條帶（非特異性）？ 擴(kuò)增的目的條帶很弱？引物是否合引物是否合適適? ?引物設(shè)計(jì)是引物設(shè)計(jì)是PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全

6、國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)原理 PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。 基本原則：基本原則：2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引物設(shè)計(jì)的原則一般原則：一般原則：1. 引物的長度：配對引物的

7、長度一般在15-30bp之間比較合適。v 盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過 5） vTm值的計(jì)算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的GC%含量：一般為40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引物設(shè)計(jì)的原則3. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。4. 引物3端的末位堿基避開密碼子的第3位，且最好不選擇A5. 引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引

8、物設(shè)計(jì)的原則6. 引物無回文對稱結(jié)構(gòu)，否則會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)； 引物自身不能配對，否則易形成約兩個(gè)引物長度的引物二聚體； 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)原理 PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班1. 緩沖液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 維持 Taq 酶作用環(huán)境 25 50 mM KCl 促進(jìn)引物退火 10

9、0g / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 對酶有一定的保護(hù)性 0.5 2.5 mM MgCl2 Taq 酶具有 Mg2+依賴性2. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物 0.5 2.5 M PCR的成分和作用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 3. 引物 (Primer-P)： 預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。 0.1 1 M 4. 模板DNA (Template): 最低102 105 DNA片段，實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量，用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。1 5 lPCR的成分和作用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞

10、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班5. Taq DNA 聚合酶 耐高熱 0.5 5 U / 100 l 1U / 25 50l6. 水： 去離子水，補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。PCR的成分和作用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)原理 PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班常用30l 各種成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行

11、核算。PCR反應(yīng)體系2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 操作： 5份標(biāo)本 總體積 30l 6 = 180l 1. 取一 0.5 ml Ep 管，加入下列試劑： 10buffer： 3l 6 = 18l dNTPs: 1.0l6 = 6.0l 引物P1： 1.0l 6 = 6.0l 引物P2： 1.0l 6 = 6.0l Taq 酶 (5U/l)： 0.2l 6 = 1.2l 水： 22.8l 6 = 136.8l 共174l，先用移液器 / 指彈混勻，后用離心機(jī)瞬時(shí) 混勻（管壁上液體沉至管底）。PCR反應(yīng)體系冰上操作！冰上操作！2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)

12、驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班2. 另取 5 支0.2ml PCR管，分別加入上述液體29l。3. 分別取標(biāo)本模板各1l，加入上述5支PCR 管中，混勻，離心機(jī)瞬時(shí)離心，備用。4. 反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增儀 PCR反應(yīng)體系 945 945 94 3094 30 55 30 55 30 72 72 453030個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán) 72 572 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)原理 PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 P

13、CRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 變性溫度和時(shí)間：變性溫度和時(shí)間： 保證模板DNA解鏈完全是保證整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。 加熱9095，30 60 s，再復(fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94 30 ，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 退火溫度和時(shí)間：退火溫度和時(shí)間： PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板 的結(jié)合。 退火溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和G+C含量確定，一般位于

14、40 60，30 60 s。 退火溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。退火溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。 設(shè)置退火溫度梯度，摸索最佳退火溫度！設(shè)置退火溫度梯度，摸索最佳退火溫度！ PCR反應(yīng)條件優(yōu)化2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 延伸溫度和時(shí)間：延伸溫度和時(shí)間： 延伸溫度一般位于Taq酶最適作用溫度70 75 之間，常用72 延伸時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的擴(kuò)增效率是1kb/1min 延伸時(shí)間過長可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班 循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)： 其他參

15、數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。 理論上說20 25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20 30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。 循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)原理 PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)

16、實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班1、目的基因的克隆：、目的基因的克?。?PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。 2、基因的體外突變：、基因的體外突變：可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班3、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析： PCR技術(shù)高度敏感，對模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。實(shí)際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個(gè)細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。4、基因轉(zhuǎn)錄水平檢測、基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 RT-PCR可檢測

17、不同組織或細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄水平5、基因突變分析：、基因突變分析：利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。PCR的應(yīng)用2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)原理（PCRPCR及引物設(shè)計(jì)）及引物設(shè)計(jì)）2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材v 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 PCR儀、移液器、0.2 mL PCR管、各種規(guī)格的吸頭。2014全國分子細(xì)胞生物

18、學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材v 實(shí)驗(yàn)試劑 10PCR buffer (Mg2+ Plus)（YRBIO）； dNTP mix (2.5 mM each) （YRBIO）； Taq DNA Polymerase (2U / L) （YRBIO）； 引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液濃度為10 M； Tpm4基因模板質(zhì)粒: （購自YRBIO基因庫）； 無菌超純水； 瓊脂糖。2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)原理（PCRPCR及引物設(shè)計(jì)）及引物設(shè)計(jì)）2 實(shí)

19、驗(yàn)儀器、試劑及耗材實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)步驟v準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液，取0.2 mL PCR管，按以下順序加入各試劑： PCR反應(yīng)體系 無菌超純水 38 L 10buffer 5.0 L dNTP mix 2.5 L 引物Tpm4-F 1 L 引物Tpm4-R 1 L 模板（ TS-Tpm4 ） 2 L Taq酶 0.5 L 合計(jì) 50 L2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)步驟v 調(diào)整好反應(yīng)程序，將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀

20、上，執(zhí)行擴(kuò)增。v 反應(yīng)程序：94 5 min；94 30 sec；55 30 sec；72 45 sec；30個(gè)循環(huán)，最后72延伸10 min。v 每人做一管，反應(yīng)完畢后，各取3-5 L進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1.0%）電泳檢測。2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)原理（PCRPCR及引物設(shè)計(jì)）及引物設(shè)計(jì)）2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及耗材3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論P(yáng)CR 產(chǎn)物瓊脂糖檢測

21、結(jié)果1、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班1. 1. 無擴(kuò)增產(chǎn)物無擴(kuò)增產(chǎn)物 模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 Buffer對樣品不合適對樣品不合適 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 退火溫度太高退火溫度太高2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班2. 2. 非特異性擴(kuò)增非特異性擴(kuò)增 引物特異性差引物特異性差 模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高 酶量過多酶量過多 退火溫度偏低退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)

22、驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班3. 3. 拖尾拖尾產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)狀態(tài) M 1 2模板不純或降解模板不純或降解BufferBuffer不合適不合適退火溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班4. 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)交叉污染交叉污染 對策對策 操作時(shí)防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或操作時(shí)防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；濺出離心管外； 除不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑器除不能耐高溫的物質(zhì)外，所有

23、試劑器材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次性使用。性使用。 各種試劑先進(jìn)行分裝，低溫貯存。各種試劑先進(jìn)行分裝，低溫貯存。 設(shè)置陽性和陰性對照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽性和陰性對照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班Contentp 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 的技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)操作p PCR引物設(shè)計(jì)軟件的使用（ Primer Premier 5.0 ）2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班常用的引物設(shè)計(jì)軟件v Primer Premier 5.0（自動(dòng)搜索）*v Oligo 6 （引物評價(jià)）*v Ve

24、ctor NTI Suitv Dnasisv Omigav D2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班Primer Premier 5.0 簡介主要功能:1、引物設(shè)計(jì)2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班Primer Premier 5.0使用介紹使用介紹Preimer Premier 啟動(dòng)界面Load 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班Sequence nameOriginal sequenceUse these tw

25、o button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8種密碼子偏好Choose a function 引物設(shè)計(jì)界面2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引物設(shè)計(jì)界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the 2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5引物位置范圍3引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物2014全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班全國分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)班引物信息回到