第三章 基因工程的常規(guī)技術(shù)

1、第三章 基因工程的常規(guī)技術(shù)第一節(jié) 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳 它是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同時(shí)也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。 用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。 本節(jié)主要介紹瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。一、DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 儀器 電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍藥品 Agarose、 TAE buffer、EB（溴化乙錠）上樣緩沖液（6X）0.25% 溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰醇、40%蔗糖；水溶液4保存。二、瓊脂糖凝膠電泳基本原理在電場(chǎng)的作用下，帶有負(fù)電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖

2、凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過(guò)電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。 DNA分子的遷移速度與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。 當(dāng)用EB對(duì)DNA樣品染色時(shí)，加入的EB就插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物，熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比，如果用DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)品作電泳對(duì)照，就可以估計(jì)出待測(cè)樣品的分子量大小和濃度。三、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素除樣品DNA本身的大小外，瓊脂糖凝膠電泳的分辨能力與膠的濃度、緩沖液、電壓等有很大關(guān)系。瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)緩沖液：TAE（醋酸緩沖液）、TBE （硼酸鹽緩沖液） 凝膠的含

3、量：根據(jù)檢測(cè)的DNA大小 加DNA樣品：<1g，指示劑 電泳條件：大片斷低電壓長(zhǎng)時(shí)間，小片段高電壓短時(shí)間染色和觀察：溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波長(zhǎng)的紫外下觀察（凝膠成像儀）。 能看到0.05 g的微量DNA DNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比。第二節(jié) 分子雜交技術(shù)所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。 核酸雜交技術(shù)主要有Southern雜交、Northern雜交和菌落原位雜交等。一、探針與探針標(biāo)記 雜交的主要目的是為了檢測(cè)出同源DNA序列，而為了達(dá)到這一目的，必需要

4、有標(biāo)記的探針。 帶有能檢測(cè)的標(biāo)記物的DNA或RNA叫探針。 使DNA或RNA帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物的過(guò)程叫探針標(biāo)記。1.切口平移標(biāo)記 用一定濃度的DNaseI在雙鏈DNA的一條鏈的有限位置上打開切口。 利用DNA聚合酶I的5 3的核酸外切酶活性將DNA一條鏈上的核苷酸一個(gè)一個(gè)的切除，同時(shí)暴露出另一條單鏈DNA。 以這條單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶I的5 3的DNA聚合功能把一個(gè)一個(gè)帶有標(biāo)記的dNTP合成上去。2.隨機(jī)引物標(biāo)記 能與任何DNA模板的多個(gè)位點(diǎn)配對(duì)互補(bǔ)的多個(gè)不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫隨機(jī)引物。 DNA聚合酶Klenow大片段能在隨機(jī)引物的引導(dǎo)下以帶有標(biāo)記的dNTP為原料合成新

5、的與模板DNA互補(bǔ)的探針。二、Southern雜交是根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫Southern DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。 雜交步驟：1.酶切2.電泳3.轉(zhuǎn)膜4.雜交5.顯影三、Northern雜交1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與Southern

6、印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northern印跡技術(shù)（Northern blotting）。 Southern雜交和Northern雜交的主要差別：1.對(duì)象不同（DNA/RNA）2.DNA在凝膠電泳分離后，用堿處理變性，形成單鏈。 RNA一般是進(jìn)行變性電泳，在分離RNA的同時(shí)消除二級(jí)結(jié)構(gòu)。 RNA變性電泳方法主要有甲醛變性電泳、羧甲基變性電泳和乙二醛變性電泳三種。四、Western雜交Western blotting是用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)廣泛用于基因在蛋白質(zhì)水

7、平上的表達(dá)研究。五、菌落原位雜交也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。 是直接菌落或噬菌斑為對(duì)象來(lái)檢測(cè)重組子的技術(shù)。第三節(jié) PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的方法始于20世紀(jì)70年代早期，由Khorana和他的同事最先提出的建義。 在1983年，美國(guó)Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明的。 PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴(kuò)增法。一、PCR技術(shù)的基本成分PCR的成分包

8、括：待擴(kuò)增的模板、引物、DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸的混合物以及反應(yīng)緩沖液。模板：模板是含有待擴(kuò)增序列的DNA或從mRNA反轉(zhuǎn)錄來(lái)的cDNA。PCR的引物：是指與待擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸片斷。引物的設(shè)計(jì)原則：1.引物堿基GC含量以45%55%為宜。 2.其長(zhǎng)度通常在1530個(gè)核苷酸之間。 3.Tm值應(yīng)高于55。 4.PCR擴(kuò)增的長(zhǎng)度一般：<2kb。 5.引物3端堿基要求嚴(yán)格配對(duì)。 6.盡量減少自身配對(duì)。 7.避免兩條引物互補(bǔ)。 8.引物要特異。 9.可以在引物的5端加上合適的酶切位點(diǎn)。二、PCR技術(shù)的原理和過(guò)程 1.PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期 PCR 反應(yīng)的每一

9、個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。PCR反應(yīng)體系的確立2.20uL反應(yīng)體系中各成分的母液濃度及加入量WaterBuffer（10×）Mg+（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets12.821.60.4110.213.PCR擴(kuò)增程序舉例Tem.9494607272Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:

10、0000:07:00Cycles30三、熒光定量PCR是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程結(jié)合相應(yīng)軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的軟件。標(biāo)記方法主要有：內(nèi)插染料 、雙標(biāo)記探針、分子信標(biāo)等。熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)1.全封閉的PCR過(guò)程，無(wú)需跑膠。2.采用dUTPUNG酶防污染，有效降低污染機(jī)會(huì)。3.對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。4.使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性。5.在樣品擴(kuò)增反應(yīng)的最佳階段進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，增加

11、了定量的精確性。6.線性關(guān)系直接。7.結(jié)果分析更加快捷方便。第四節(jié) 生物芯片美國(guó)財(cái)富雜志載文指出，在20世紀(jì)科技史上有兩件事影響深遠(yuǎn)，一是微電子芯片，它是計(jì)算機(jī)和許多家電的心臟，它改變了我們的經(jīng)濟(jì)和文化生活，并已進(jìn)入每一個(gè)家庭；另一件事就是生物芯片，它將改變生命科學(xué)的研究方式，革新醫(yī)學(xué)診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號(hào)，用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)結(jié)果。目前制備芯片的固相材料有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等。 生物芯片主要分為基因芯片和蛋白芯片。一、基因芯片 基因芯片技術(shù)是指將大量寡核苷酸或DNA探針（與核酸分

12、子雜交相反，亦稱靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，與標(biāo)記的特異的單鏈DNA或RNA（待測(cè)樣品）分子雜交形成雙鏈，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。 由于基因芯片上固定的探針可以是cDNA、寡核苷酸或來(lái)自基因組的基因片段，且這些探針固化于芯片上形成基因探針陣列，故基因芯片又被稱為DNA芯片、DNA陣列、cDNA芯片、寡核苷酸陣列等 。 DNA芯片技術(shù)工作流程主要包括：芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備與標(biāo)記、雜交、信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析處理，其中最關(guān)鍵的是芯片的制備。 DNA芯片基本應(yīng)用可分為兩個(gè)主要方面：定量分析（主要指測(cè)序和突變檢測(cè)）與定性分析（主

13、要指對(duì)基因表達(dá)的研究）。 如： 1.DNA序列測(cè)定 2.突變及多肽性分析 3.基因表達(dá)分析 4.基因組研究 5.基因診斷 6.藥物研究與開發(fā)二、蛋白芯片蛋白芯片是以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測(cè)對(duì)象。其原理是將各種蛋白質(zhì)有序的固定于某種介質(zhì)的載體上成為檢測(cè)的芯片，然后用標(biāo)記了有特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配的抗體將與其對(duì)于的蛋白質(zhì)結(jié)合，在將未與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)的抗體洗去之后利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，檢測(cè)芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，在通過(guò)計(jì)算機(jī)分析蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系以及基因表達(dá)功能等。第五節(jié) 基因文庫(kù)構(gòu)建基因文庫(kù)的基本概念從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形

14、式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為： 基因組文庫(kù)（含有全部基因） cDNA文庫(kù)（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） 一、基因組文庫(kù)基本步驟: 1.分離基因組 DNA 2.DNA 的斷裂 物理剪切 (包括吹吸、振蕩和超聲波）和限制性酶解 3.DNA 片斷的分離與連接 4.包裝，轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化二、cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建 基本步驟： 1) mRNA 分離、純化和分級(jí) 分離 2) cDNA的合成 3) 與載體的連接 4) 轉(zhuǎn)化第六節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)一、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺(tái)，在近幾年來(lái)得到了廣泛運(yùn)用。 酵母雙雜交技

15、術(shù)既可以用來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來(lái)研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，DNA-AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能

16、，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。 根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、A

17、DE，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái)，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。 二、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能 2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥 物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 4、鑒定不同突變子與靶蛋白的反應(yīng)能力。 5、篩選特異克隆

18、。第七節(jié) DNA測(cè)序一、.Sanger雙脫氧鏈終止法DNA序列分析 在用DNA聚合酶復(fù)制核苷酸鏈時(shí)，如果在反應(yīng)物中加入一定量的某一種2，3-雙脫氧核苷酸, 如ddTTP，就會(huì)在應(yīng)當(dāng)摻入dT的位置摻入ddT。由于ddT核苷酸的3碳原子不含有羥基而不能和下一個(gè)核苷酸的5碳原子上的磷酸根結(jié)合形成磷酸二脂鍵，所以DNA鏈就不能繼續(xù)向后延伸。 Sanger據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了DNA測(cè)序的鏈終止法。測(cè)序時(shí)要進(jìn)行4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)中有一種dNTP用32P標(biāo)記，并且在4個(gè)反應(yīng)中分別加入一定比例的ddATP, ddTTP, ddGTP和ddCTP。 這樣反應(yīng)一段時(shí)間后，每個(gè)反應(yīng)中都會(huì)生成一系列由對(duì)應(yīng)的那種ddNTP結(jié)尾的長(zhǎng)短不一的DNA片段，而且這些片段的5端序列是相同的。最后，將反應(yīng)物變性后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)放射自顯影后就可以讀出DNA的堿基順序。二、.Maxam-Gilbert化學(xué)分析法1977年由美國(guó)大學(xué)A.M.Maxam和W.Gilbertf發(fā)明。 其原理是用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片斷，造成堿基的特異性切割。由此產(chǎn)生的一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混合