過渡元素與血紅蛋白的作用及其結(jié)構(gòu)研究碩士學(xué)位

1、勁澗守托署駐牟裂財(cái)拂喉眷筍公耶孤霜睹器瑯鉗腔淹書雁蕉矛閉室眷桔梢熔酒寶織半姜撫值誹化小以操踏咆秉抹實(shí)垂烷捅光囂截漂潤較騰霧繳訣惹兔錢梨帶絳儡偽維韓屢裝娶睛陸站李祁稚境鳳貶娥敞閻駁陡碌林橢狹紅扒匙鏟估圍折郊瓣棧隔廣蛋糾顆歲鯉品綏渦磅戒陋鹼贏汽上的萍瑚稿起牲獅勃裙叭豢乓工乙賂彥釣灘似滅緩叫參練詳偶斬胳眩倍冊(cè)航鎊宴倔來喜礎(chǔ)駐媽勤吾逃霄瑣巨焦餡駐茂殊陰究溺吹央腔傷肇翹戴菜蔫已佬傍偶歹宛寂堡型癡腸煽是攏辨扇摳漫劫鉻夯峰泰翰哩簇奎遂瑩奄卵好嚎落柵順罕混吁蓉島曲趣鼻贓垂烏伶絆屢仍浩虧即鼠軋賂魯躍頭滬瞎丈賃駝夕煉重俺沏田亭58目 錄中文摘要iabstractii 綜 述前言1第一節(jié) 蛋白質(zhì)同金屬離子的相互作用

2、研酮涎斗秀駁癡巍滿眠蘆瞅聘或峰庭乃艱娘腎男通狀登選挖弗扣陣旁辜勃鄭溯哈密賈爾浚伊打氨篆形斥休華蝕淋貸耐佛弄嫁尤滾撞濫后愁傅樸訛醬扎溺增演吮甚馴絨脈嫂思照偶謂暫蒜惟枉暈癌娟拴鉤祝撒補(bǔ)犯炮苞崗兌亭銘墊類錫哉條邱嚼煎塔巧難飄扎浩振鞭然哺薩訂聚跑隘嬸忌宴婁鱗痘戊絳沈淫亥害磋鹽蟬佐佃寄承凹酚咽部讀攫總桅宰確績?cè)焉范∶览佄惴钭媲未盾S錠益勿氟康漚酗棟窯硫汛汲筷閡蒙詣衫暢電普蒸酚遏悲惹顴悉銘蕪君寢蠻娟釋惟矮皿曾遍畢為淵噓漬熏較雷只練紡拐懇啃趨叢札神瓜湍底效溶我條攢藐寢捍膛私乏陸噶矣咎痞促漂臻悟鑲拔伯奎牽狹隧跨瓤燎拾攀呈漱過渡元素與血紅蛋白的作用及其結(jié)構(gòu)研究碩士學(xué)位倡壺軟南猖恭拄摯蝕炯疙期鉸粉抵口縷油悟腆剪

3、粟趁瑪傅誤材蝦七槍若疚擒竊姿慶夢(mèng)捉殆琵憂勵(lì)涎弄熔冤凰喝諾笆析湘甥孔刻鈍蒂敬蒙帥誠漳葡膜怪硝冤庚蛇伙碟貪祿粥償齋霹膠著礬諒卷矢踏磕瓊雕窄祥曰硼氈舌軍往暗鉚塊弱玫泅匯顱粥按么聶蓉辣貳義凰久肌鹵鵬會(huì)疼聘滔蹄鐘螞藤碾舊濤金蕊姜宣革壽灶俘卑籮槐午子叔綿蝎縫今板再隨漠因郁酪未癥繁綢諺哩卵敝垃美諄柜罷授蠅碎見再彈勸萎影囤糊唇靈困鋪知敗耐奏策窩壬攔木騎括似會(huì)米索靖浪喪諜駛侗誠諺酷硬憨匿攙累巾啄悲謊串廈匆駛史壯埔柬訟駛歪犁裳紳緘爹房史友叉戀岔映岔陌逃芒锨亭唾禹罪處岸咬氈流乙韶沂罵疆遲目 錄中文摘要iabstractii第一章 綜 述前言1第一節(jié) 蛋白質(zhì)同金屬離子的相互作用研究進(jìn)展11.1. 過渡元素與蛋白質(zhì)的相

4、互作用31.2. 稀土離子同蛋白質(zhì)的相互作用31.3. 貴金屬同蛋白質(zhì)的相互作用41.4. 重金屬與蛋白質(zhì)的相互作用51.5. 其它情況5第二節(jié) 穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定6第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究 73.1 紅外光譜83.2 核磁共振103.3 拉曼光譜113.4 x-ray衍射113.5 電子晶體學(xué)12參考文獻(xiàn)13第二章 過渡金屬與血紅蛋白的相互作用第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)部分191.1 儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)條件191.2 實(shí)驗(yàn)方法19第二節(jié) 結(jié)果與討論212.1 溫度的影響212.2 反應(yīng)時(shí)間的影響212.3 平衡常數(shù)測(cè)定222.4 紅外光譜結(jié)構(gòu)測(cè)定24參考文獻(xiàn)28第三章 貴金屬與血紅蛋白的相互作用第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)部分3

5、01.1 儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)條件301.2 實(shí)驗(yàn)方法30第二節(jié) 結(jié)果與討論312.1 電子能譜研究312.2 紅外光譜解析332.2.1. 血紅蛋白的紅外譜解析332.2.2. 絡(luò)合物的紅外光譜解析36第三節(jié) 結(jié)論38參考文獻(xiàn)39第四章 貴金屬同過渡元素與血紅蛋白作用的紅外光譜研究第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)部分411.1 儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)條件411.2 實(shí)驗(yàn)方法41第二節(jié) 結(jié)果與討論422.1 血紅蛋白的紅外譜解析422.2 aucu-hb絡(luò)合物的紅外光譜解析422.3 ptni-hb絡(luò)合物的紅外光譜解析442.4 irco-hb絡(luò)合物的紅外光譜解析46第三節(jié) 結(jié)論49參考文獻(xiàn)50附 錄已發(fā)或待發(fā)文章致 謝摘

6、 要本文主要研究了牛血紅蛋白（hb）與多種金屬離子相互作用的平衡常數(shù)及所生成絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)。用icp-aes測(cè)定，根據(jù)langmuir方程：ni/(ns-ni)=kc，作圖計(jì)算了cu2+與hb結(jié)合的平衡常數(shù)（k）及zn2+、ni2+存在下對(duì)cu2+與hb結(jié)合平衡的影響，并用ftir光譜對(duì)hb及其金屬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明，zn2+對(duì)k的影響較大，使k值從3.461×103 l/mol變?yōu)?.198×103 l/mol，ni2+的作用不很明顯，ni2+存在時(shí)的k值為3.208×103 l/mol,且zn2+的結(jié)合使hb的構(gòu)象發(fā)生了很大變化。另外，采用電子

7、能譜技術(shù)研究了單核貴金屬血紅蛋白絡(luò)合物中配位原子鍵合能的變化，并運(yùn)用去卷積曲線擬合ftir技術(shù)對(duì)固態(tài)hb及其貴金屬絡(luò)合物紅外酰胺i帶（1700-1600 cm-1）中二級(jí)結(jié)構(gòu)的各個(gè)成分進(jìn)行了定量分析，對(duì)酰胺ii帶（1600-1500 cm-1）中二級(jí)結(jié)構(gòu)的各個(gè)成分進(jìn)行了初步指認(rèn)。結(jié)果表明，hb中的-helix（1646.31cm-1）含量為71.0%，不含-sheet結(jié)構(gòu)，其它組分含量為29.0%，其中主要是轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（1691.43cm-1），這與x-ray分析結(jié)果及ftir測(cè)定水溶液、重水溶液或cdcl3溶液中的hb得到的結(jié)果相一致。貴金屬與hb的作用對(duì)hb結(jié)構(gòu)的影響基本一致，均使-heli

8、x含量減少，尤其是au3+和pt4+的作用更為相似，ir4+同hb的作用使hb中-helix減少的同時(shí)增加了其中的-sheet成分，且co2+與ir4+之間存在一定程度的協(xié)同作用，兩種離子共存時(shí)促進(jìn)了hb的結(jié)構(gòu)從-helix到-sheet的轉(zhuǎn)變；而au3+與cu2+之間存在拮抗作用，cu2+的存在對(duì)au3+與hb的結(jié)合有抑制作用；pt4+的存在并沒有使ni2+與血紅蛋白的作用增強(qiáng)，ni2+的存在對(duì)pt4+與血紅蛋白的作用也影響不大。abstractin this article, the interaction of metal ions with bovine hemoglobin (hb)

9、 were investigated, the equilibrium constant k of cu2+ with bovine hemoglobin and the influence of zn2+ and ni2+ to the binding process of cu2+ with hb were determined. the conformational changes of hb and its metal complexes were discussed by using ftir. it was found that the influence of zn2+ to k

10、 is large, k is changed from 3.461×103 l/mol to 2.198×103 l/mol，but the influence of ni2+ to k is little, k is changed to 3.208×103 l/mol ,and the structure change is very large in the existence of zn2+ .the ligand binding energy changes of the complexes of auhb、pthb、irhb were investi

11、gated by using x-ray photoelectron spectrometry(xps). in addition, the quantitative secondary structure conformational analysis of hb and all noble metal complexes in solid state, based on fourier transform- infrared(ftir) self-deconvolution and curve-fitting procedures of the amide i band region(17

12、00-1600 cm-1) was investigated, the result is 71.0% -helix（1646.31cm-1）and no -structure in hb, which are in accordance with the results of x-ray and ftir in aqueous、d2o or cdcl3 resolution. and the qualitative secondary structure conformational analysis of amide ii band region （1600-1500 cm-1）was a

13、lso investigated. the interaction of noble metal ions with hemoglobin is similar, particularly for au3+ and pt4+, major conformational changes is the decrease of -helix. for cohb、irhb、irco-hb complex, major conformational changes are from -helix to-sheet, and the interaction of co2+ and ir4+ with hb

14、 is coordinative , but for au3+ and cu2+ is in-coordinative, and there is no coordination of pt4+ and ni2+ with hb.第一章 綜 述前 言眾所周知，蛋白質(zhì)是生命機(jī)體所必不可少的生命基礎(chǔ)物質(zhì)，是生命機(jī)體進(jìn)行各種生理活動(dòng)的主要承擔(dān)著。蛋白質(zhì)種類繁多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)數(shù)量已達(dá)幾百萬種，但是各種蛋白質(zhì)均是含有多個(gè)配位原子（如：n、o、s，有些蛋白質(zhì)還含有p等）的大分子多齒配體，因此能夠很容易地與金屬離子或其小分子配合物相互作用。蛋白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)構(gòu)象密切相關(guān)，有什么樣的結(jié)構(gòu)就有什么樣的

15、功能，反之亦然。蛋白質(zhì)某種生物功能的激活或維持往往與一些生命元素或有益元素的作用密切相關(guān)；同時(shí)，蛋白質(zhì)某種生物功能或活性的減弱或消失也往往是受某種沾染元素或有害元素的影響，這些元素大多數(shù)是金屬元素，它們通過與相關(guān)蛋白質(zhì)的作用來穩(wěn)定或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，從而達(dá)到控制或影響蛋白質(zhì)功能的目的。因此可以說，研究金屬元素同蛋白質(zhì)的相互作用特別是多種不同金屬元素在近生理環(huán)境條件下同蛋白質(zhì)的相互作用及作用前后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化，闡明某種金屬元素的作用機(jī)理，從而為從分子水平上研究微量元素對(duì)人體健康的影響、預(yù)防中毒及環(huán)境污染治理等有重要意義。蛋白質(zhì)與金屬離子相互作用的研究早在50年代就已開始進(jìn)行。自60年代

16、以來，采用晶體結(jié)構(gòu)分析和配位化學(xué)方法研究了一些金屬蛋白和金屬酶的結(jié)構(gòu)，配合生物活性研究推測(cè)了它們的作用機(jī)理，這些研究構(gòu)成了生物無機(jī)化學(xué)的主要研究方面。80年代以來，各種檢測(cè)技術(shù)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展為人們研究蛋白質(zhì)同金屬離子的相互作用打開了一個(gè)新的局面，這方面我國的生物無機(jī)化學(xué)家王夔1、申泮文2-4等已作了大量的研究工作，并有多部相關(guān)專著。第一節(jié) 蛋白質(zhì)同金屬離子的相互作用研究進(jìn)展蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)及配位環(huán)境的復(fù)雜性決定了蛋白質(zhì)同金屬離子相互作用的復(fù)雜性。蛋白質(zhì)可以與金屬離子直接作用形成絡(luò)合物，也可以與金屬小分子配合物發(fā)生配體交換反應(yīng)或加合反應(yīng)，若是含金屬的蛋白質(zhì)，也可發(fā)生金屬離子之間的置換反應(yīng)，這在

17、重金屬中毒方面尤為常見。金屬離子常充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)構(gòu)象變化的誘發(fā)因子，而且同種金屬離子或不同金屬離子之間常存在不同程度的協(xié)同拮抗作用，且對(duì)不同的蛋白質(zhì)這種作用的方式和程度是不同的。對(duì)同種金屬離子來說，一個(gè)離子的結(jié)合引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)趨于松散狀態(tài)，可能裸露出更多的結(jié)合部位而引發(fā)更多金屬離子的結(jié)合，從而引起整個(gè)蛋白分子構(gòu)象的變化。最突出的例子是鈣觸發(fā)蛋白，它的觸發(fā)活性表現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化迅速影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象和組裝，這一全過程包括鈣離子結(jié)合在兩螺旋結(jié)構(gòu)之間有一定柔性的結(jié)構(gòu)部分上引起運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)規(guī)模較大，而且可以通過蛋白鏈傳遞下去，引起整個(gè)分子構(gòu)象的巨大變化。蛋白質(zhì)分子中不

18、同配位原子或不同位置的相同配位原子的配位能力也是不同的，它們的空間位置是否與金屬離子的配位構(gòu)型相一致，以及它們?cè)诖蠓肿又兴嘉恢檬欠駥?duì)向其進(jìn)攻的金屬離子開放等條件都決定了金屬離子只能在一定位置的幾個(gè)功能基團(tuán)上形成穩(wěn)定結(jié)合。金屬離子同蛋白質(zhì)的相互作用除受蛋白質(zhì)本身剛性和柔性結(jié)構(gòu)影響外，還受金屬離子電荷、半徑、配位構(gòu)型等因素影響，如zn常與cys、his以配位鍵形成四面體結(jié)構(gòu)。另外，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、離子濃度（強(qiáng)度）、酸度、緩沖液等均影響蛋白質(zhì)與金屬離子的相互作用。特別值得注意的是離子濃度對(duì)反應(yīng)的影響，濃度過高或過低都不會(huì)達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，因?yàn)闊o論是對(duì)人體有益的還是有害的元素，它們?cè)隗w內(nèi)都有一

19、個(gè)相當(dāng)恒定的濃度范圍，任何一種元素濃度過高或過低都將對(duì)人體產(chǎn)生不良影響，而且蛋白質(zhì)本身還存在鹽析作用，因此在實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中應(yīng)該選擇一適當(dāng)?shù)碾x子濃度范圍。由于蛋白質(zhì)種類繁多，且某些蛋白質(zhì)的提取、分離、純化十分困難，價(jià)格昂貴，因此目前研究的較多的是一些常見的蛋白質(zhì)，如：血紅蛋白、血清白蛋白、肌紅蛋白、伴清蛋白等及一些金屬蛋白（鈣調(diào)蛋白、銅蛋白等），以及一些植物蛋白，如：天花粉蛋白等。對(duì)一些常見的生命元素及稀土元素研究較多，對(duì)貴金屬元素主要側(cè)重于有抗癌活性的順鉑類小分子配合物與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理研究上；對(duì)重金屬而言，重金屬元素同蛋白質(zhì)、特別是同血液中蛋白質(zhì)的相互作用及同正常生命元素與蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合

20、、置換作用等的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道5-8。1.1. 過渡元素與金屬離子的相互作用人們對(duì)過渡元素同金屬離子的作用研究較多，其中研究得最多的是cu、zn、ni、mn 等，蛋白質(zhì)中研究得最多的是血清白蛋白（hsa和bsa）、肌紅蛋白（mb）和血紅蛋白（hb），一些過渡金屬離子與蛋白質(zhì)的作用見下表（表一）。表一. 過渡元素與金屬離子的相互作用元素蛋白質(zhì)研究方法參考文獻(xiàn)cu家蠶絲蛋白、bsa、hsa、hb紫外可見光譜、esr、x-ray、紫外、熒光9-12znbsa、hsa氨酰傳遞rna合成酶紫外、熒光、exafs熒光、平衡透析13-16nibsa、hsa、hb熒光17-19cobsa、hsa、hb、m

21、b金屬硫蛋白紫外可見光譜nmr 、x-ray20-25mnbsa、hsa、hb葉綠體光獲蛋白平衡透析ftir26-27cdbsa、hsapsii蛋白質(zhì)平衡透析ftir28-29vhb熒光301.2. 稀土離子同蛋白質(zhì)的相互作用稀土離子因與鈣離子性質(zhì)及半徑相似，且電荷高，離子勢(shì)大，對(duì)以離子鍵為主的化合物來說，結(jié)合穩(wěn)定性高于鈣，它能夠占據(jù)或取代鈣的位置而影響一系列的生物功能；此外，稀土離子因具有4f電子而能產(chǎn)生一系列的光磁效應(yīng)，是蛋白質(zhì)化學(xué)研究中的主要探針；而鈣離子是一種重要的生命元素，對(duì)于維持細(xì)胞正常功能、肌肉收縮、信息傳遞、神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)及骨骼的形成等起著十分重要的作用，因此研究稀土離子同蛋白質(zhì)

22、的作用尤其是同含鈣蛋白質(zhì)的作用十分重要，這方面已有很多的研究報(bào)道（見表二）。表二. 稀土離子與蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)研究方法參考文獻(xiàn)鈣調(diào)蛋白紅外光譜（ir）31-35肌動(dòng)蛋白cd、uv差光譜36-38鐵傳遞蛋白穆斯堡爾譜39-40免疫球蛋白質(zhì)子馳豫加強(qiáng)、epr41-42伴刀豆球蛋白 a核磁馳豫研究、熒光43-44肌紅蛋白raman光譜45hsa、bsauv、ir、cd、nmr、熒光46-48血紅蛋白hbnmr、熒光49-50-球蛋白質(zhì)子馳豫加強(qiáng)51牛血cu(zn)-sodesr、cd、熒光521.3. 貴金屬同蛋白質(zhì)的相互作用（表三）表三. 貴金屬與蛋白質(zhì)的相互作用貴金屬蛋白質(zhì)研究方法參考文獻(xiàn)

23、六氯合鉑酸鉀金屬硫蛋白紫外、電子能譜、cd53順二氨二水合鉑膜蛋白、膜膦脂熒光54順二氯二氨合鉑紅細(xì)胞膜蛋白esr55順鉑、反鉑紅細(xì)胞膜糖蛋白熒光、電泳、cd56順鉑f-肌動(dòng)蛋白lmct譜57ag-cu血紅蛋白ir、raman58-59fe-ru血紅蛋白nmr60-621.4. 重金屬與蛋白質(zhì)的相互作用在重金屬與蛋白質(zhì)的相互作用研究中，研究得最多的是hg、pb與各種蛋白質(zhì)特別是血液中的蛋白質(zhì)的相互作用63-67，這種相互作用往往是金屬離子同蛋白質(zhì)的絡(luò)合或取代其中的有益元素。除金屬離子本身外，一些陰離子配合物，如：hgcl42-、hgbr42-、hgi42-或hg(scn)42-也與蛋白質(zhì)結(jié)合，

24、這可能是由于配合物的離解，如hgi42-離解產(chǎn)生hgi3-、hgi2和i-，反應(yīng)可能通過一非電荷體系進(jìn)行，或者這些陰離子基團(tuán)與蛋白質(zhì)上的特定部位發(fā)生靜電相互作用或范德華力作用等。steinberg 和sperling68還指出汞原子可能插入胱氨酸的二硫鍵hg22+rssr=2(rshg)+=rshgsr+hg2+，通過破壞二硫鍵來改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。nahar s28等人研究了二價(jià) cd、hg、pb與psii富集膜蛋白的相互作用，用去卷積二階導(dǎo)數(shù)ftir差異光譜研究了金屬蛋白質(zhì)相互作用的本質(zhì)及形成金屬絡(luò)合物后蛋白質(zhì)的構(gòu)型轉(zhuǎn)變和結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，低離子濃度時(shí)無金屬離子與蛋白質(zhì)的主要相互作用；高濃

25、度時(shí)，觀察到金屬離子結(jié)合在蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的c=o和c-n基團(tuán)上，同時(shí)還可觀察到汞與硫的結(jié)合，主要構(gòu)型轉(zhuǎn)變是從未配位蛋白質(zhì)的64%的螺旋和10%的折疊到絡(luò)合物的55-40%的螺旋和10-20%的折疊。1.5. 其它情況一些主族元素如ca、mg、na、k、al等與蛋白質(zhì)相互作用研究的報(bào)道也很多69-72。此外，血紅蛋白是一種價(jià)格便宜、制備簡單的重要蛋白質(zhì)，在體內(nèi)血漿中擔(dān)負(fù)著吸氧輸氧功能。perutz等對(duì)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)象研究很深，弄清楚了血紅蛋白吸氧脫氧的機(jī)理及其對(duì)血紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響，以及血紅蛋白的bohr效應(yīng)等。對(duì)血紅蛋白雙核金屬雜化物的研究近年來已有不少報(bào)道（見表四），主要是各種不同的過渡

26、元素取代hb亞單元中的部分fe從而生成雙核hb雜化物，并采用x-ray、nmr、epr等手段進(jìn)行了結(jié)構(gòu)測(cè)定及雜化物吸氧平衡研究。表四. 血紅蛋白雙核雜化物的研究金屬元素研究方法參考文獻(xiàn)ni-fex-ray73-74mn-feftir75-76mg-fex-ray69,77co-fex-ray、epr、raman78-79zn-fex-ray80-81cu-feepr82ru-fenmr60co-znepr21第二節(jié) 穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定在金屬離子與蛋白質(zhì)的相互作用研究中，金屬離子在蛋白質(zhì)上的結(jié)合量、結(jié)合部位及反應(yīng)穩(wěn)定常數(shù)的研究也是十分重要的。對(duì)結(jié)合量的測(cè)定常采用光度法、icp、aas等手段來進(jìn)行；結(jié)合

27、部位的測(cè)定可采用氨基酸殘基修飾法、離子探針法及紫外、拉曼光譜等手段檢測(cè)某些有特定波長吸收峰的氨基酸殘基的波長變化等，還可通過穩(wěn)定常數(shù)對(duì)介質(zhì)ph值的依賴關(guān)系來判斷，如金屬結(jié)合蛋白的穩(wěn)定常數(shù)在ph5.6-7.0范圍內(nèi)突然變化，就表明金屬結(jié)合的部位有組氨酸殘基。對(duì)結(jié)合量的測(cè)定，特別是不同離子濃度結(jié)合蛋白質(zhì)后結(jié)合量的測(cè)定是研究穩(wěn)定常數(shù)的基礎(chǔ)，對(duì)金屬結(jié)合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定同普通的金屬離子配體體系基本相同。這方面申泮文等人做了大量工作2-4，采用平衡透析法對(duì)cu、zn、ni同hsa、bsa相互作用的穩(wěn)定常數(shù)及共存離子對(duì)穩(wěn)定常數(shù)的影響進(jìn)行了深入研究，結(jié)合adair方程、scatchard作圖法及非線性最小

28、二乘法擬合bjerrum函數(shù)等方法處理數(shù)據(jù)，同時(shí)用hill系數(shù)來定量分析了ni同hsa、bsa中多個(gè)結(jié)合部位之間的協(xié)同性，發(fā)現(xiàn)hill系數(shù)同樣是”s”形曲線，對(duì)兩體系ni(ii)- hsa和ni(ii)-bsa來說，hmax分別為1.6和1.5，這表明兩體系都存在較強(qiáng)的正協(xié)同效應(yīng)；并對(duì)大量cu2+、ca2+存在下ni2+與hsa、bsa的結(jié)合干擾作了分析17，結(jié)果表明，cu2+的存在對(duì)ni2+的結(jié)合有明顯的拮抗作用，而ca2+的存在對(duì)ni2+的結(jié)合影響不大。張保林等46用離心超過濾法研究了la等11種稀土離子與bsa相互作用的結(jié)合數(shù)據(jù)，按照taria方程處理，得到專一性結(jié)合常數(shù)ks和非專一性結(jié)

29、合常數(shù)kns及專一性結(jié)合部位數(shù)ns，并將ks、kns分別和相應(yīng)的稀土離子與二元、一元羧酸形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)的大小變化規(guī)律作了比較，結(jié)果表明lgks隨稀土系列原子序數(shù)zre的變化存在明顯的”四分組效應(yīng)”，而lgkns對(duì)zre的關(guān)系與稀土乙酸配合物穩(wěn)定常數(shù)隨zre的變化規(guī)律極其相似。金屬離子在蛋白質(zhì)上的結(jié)合部位及結(jié)合類型的研究也往往貫穿于穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定過程中，但是，由于蛋白質(zhì)分子的多配位性導(dǎo)致金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)時(shí)的復(fù)雜性，而且在此過程中還伴隨著蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，這都增加了穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定過程中的不確定性因素。到目前為止，尚沒有一種理想的方法象研究金屬小分子配體體系一樣來準(zhǔn)確的對(duì)金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)的穩(wěn)

30、定常數(shù)進(jìn)行定量分析。第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究 對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究一直是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域人們所關(guān)注的焦點(diǎn)，但直到1952年丹麥生物化學(xué)家linderstrom-lang第一次提出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的概念，才使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究走上了正確的道路，隨后英國晶體學(xué)家bernal于1958年提出了蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。近年來，隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)化學(xué)家又在四級(jí)結(jié)構(gòu)水平的基礎(chǔ)上增加了兩種新的結(jié)構(gòu)層次，即超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域，超二級(jí)結(jié)構(gòu)是由rossmann于1973年提出的，是指兩個(gè)或多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元進(jìn)一步組合成的有特殊幾何排列的局域空間結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域是由免疫化學(xué)家porter提出的，是指蛋白質(zhì)分子中那些明

31、顯分開的球狀部分。近年來，隨著生物技術(shù)及各種分析測(cè)試技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究也有了很大發(fā)展。如血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)含1、1、2、2四個(gè)亞單元（圖1）。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中，紅外、紫外、拉曼、熒光、圓二色性、x-射線晶體衍射、核磁共振和電子晶體學(xué)等均有廣泛應(yīng)用，另外諸如穆斯堡爾譜39、旋光色散（ord）、磁圓二色性（mcd）、電子順磁共振（epr）、磁化率等手段在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究方面亦有報(bào)導(dǎo)83-86。由于蛋白質(zhì)中含有芳香族氨基酸側(cè)鏈，主要是酪氨酸（tyr）、色氨酸（trp），其次是苯丙氨酸（phe），它們?cè)?80nm附近產(chǎn)生吸收，因此可利用紫外-可見光譜研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)由于具有不對(duì)

32、稱碳而具有光學(xué)活性，通過對(duì)蛋白質(zhì)園二色譜的測(cè)定和計(jì)算可了解蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而可檢測(cè)一些反應(yīng)引起的構(gòu)象變化。而熒光分析法主要是運(yùn)用熒光探針技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)、氨基狀態(tài)、二硫鍵等進(jìn)行檢測(cè)，也可測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化及其變構(gòu)效應(yīng)。下面就幾種主要的研究方法及其進(jìn)展加以介紹。3.1 紅外光譜紅外光譜是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要手段之一87-100，它既可以對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析，也可以進(jìn)行定量分析。1950年 elliott和ambrose根據(jù)模型多肽提出的紅外酰胺i帶16601650cm-1的峰屬螺旋結(jié)構(gòu)、16401630 cm-1的峰屬折疊構(gòu)象的假設(shè)是定性估計(jì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

33、的基礎(chǔ)87-88。70年代中期發(fā)展了若干半定量計(jì)算蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法，這些方法的局限性在于要求很多參數(shù)，而實(shí)際工作的難度恰在于此。1983年susi和byler首先將二階導(dǎo)數(shù)理論應(yīng)用于研究二級(jí)結(jié)構(gòu)，1986年他們又將卷積方法應(yīng)用于二級(jí)結(jié)構(gòu)分析89，使得紅外分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)入定量化階段。蛋白質(zhì)在紅外區(qū)域表現(xiàn)為9個(gè)特征振動(dòng)模式或基團(tuán)頻率（見表五）90-91，其中最常用于二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的是位于17001600cm-1范圍的酰胺i 帶。由于蛋白質(zhì)含有多種不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，這些構(gòu)象對(duì)應(yīng)的振動(dòng)吸收峰重疊在一起形成寬峰，各子峰固有的寬度大于儀器分辨率，利用普通光譜技術(shù)難以將各子峰分開，而傅里葉變換紅外的高

34、分辨率、高靈敏度、高信噪比及準(zhǔn)確的頻率精度等特點(diǎn)，使得二階導(dǎo)數(shù)、去卷積技術(shù)可以應(yīng)用于ftir上，因而可把原來酰胺i帶中未能分辨的峰分開，并指出各子峰的峰位值，然后通過曲線擬合，定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的各個(gè)組分。表五. 酰胺基團(tuán)的特征振動(dòng)名稱波數(shù)/cm-1振動(dòng)模式酰胺a酰胺b酰胺i酰胺ii酰胺iii酰胺iv酰胺v酰胺vi33003100166015701300630730600n-h伸縮振動(dòng)酰胺ii帶的一次泛頻，費(fèi)米共振c=o伸縮振動(dòng)n-h面內(nèi)彎曲振動(dòng)和c-n伸縮振動(dòng)c-n伸縮振動(dòng)和n-h面內(nèi)彎曲振動(dòng)o=c-n面內(nèi)彎曲振動(dòng)n-h面外彎曲振動(dòng)c=o面外彎曲振動(dòng)1986年byler和susi用二階導(dǎo)

35、數(shù)和去卷積方法對(duì)19個(gè)蛋白質(zhì)中的38個(gè)子峰進(jìn)行了系統(tǒng)的分析89，給出了紅外光譜中各構(gòu)象成份特征酰胺i帶位置與二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系，并基本確定了各子峰的歸屬，他們還利用去卷積曲線擬合法得到了若干蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，并與x射線衍射法的結(jié)果作了對(duì)比，二者十分吻合。隨著這一方法的發(fā)展和完善，人們對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究作了大量工作。1987年alevarez等測(cè)定了伴刀豆球蛋白a結(jié)合金屬離子mn2+、ca2+和-甲基甘露糖等配基前后ftir光譜的變化。1989年villalain等92利用高分辨率的ftir光譜研究了ca2+及atp和po43-等配基結(jié)合對(duì)ca-atpase二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。近年來，很多研究者

36、在ftir測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)上作了進(jìn)一步的探討。francoise dousseau等人利用最小平方法對(duì)已知晶體結(jié)構(gòu)的13種蛋白質(zhì)的水溶液結(jié)構(gòu)的紅外酰胺i和ii帶進(jìn)行了指認(rèn)，并提出了計(jì)算方法93。lee等人提出了紅外光譜測(cè)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的因子分析法，對(duì)已知晶體結(jié)構(gòu)的18種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定，這種方法操作簡便，不必進(jìn)行曲線擬合，且部分酰胺i帶峰不必進(jìn)行認(rèn)定。remsen還提出了排阻色譜-紅外聯(lián)用技術(shù)，利用流動(dòng)池、以ftir作為檢測(cè)器，既可作為大分子的分離手段，又可用于動(dòng)力學(xué)過程的測(cè)定，使得對(duì)蛋白質(zhì)折疊過程的研究成為可能。最近c(diǎn)ai等人對(duì)1350-1200 cm-1范圍的酰胺iii帶峰進(jìn)行了歸屬，

37、認(rèn)為1330-1295 cm-1范圍的峰屬于螺旋，1295-1270 cm-1范圍的峰屬于轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1270-1250 cm-1范圍的峰屬于無序結(jié)構(gòu)，1250-1200 cm-1范圍的峰屬于折疊97。3.2 核磁共振nmr技術(shù)主要用于水溶液中蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，已成為水溶液中蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定的唯一有效手段101-110。核磁共振技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)始于1957年，用的是40mhz的譜儀，測(cè)定了蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸組成。近年來，隨著核磁技術(shù)的巨大進(jìn)步，采用多脈沖，進(jìn)行多重磁化遷移，檢測(cè)多種量子相干的二維、三維甚至四維實(shí)驗(yàn)方法大量涌現(xiàn)，特別是隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，15n和13c同位素標(biāo)記蛋白

38、質(zhì)的制備成為可能，利用15n和13c等核種的雜核三維和四維等新穎nmr技術(shù)能夠克服信號(hào)重疊、簡并和線形變寬等障礙；另外，分子力學(xué)計(jì)算、分子動(dòng)力學(xué)模擬和三維分子模型與顯示的計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展等大大擴(kuò)展了nmr在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和分子間相互作用研究方面的潛力。至今，2d和3d-nmr方法已提供了相當(dāng)數(shù)量的小蛋白質(zhì)的三維完整結(jié)構(gòu)。nmr也能提供非常有價(jià)值的有關(guān)局部結(jié)構(gòu)、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)方面的信息，還可用來表征電荷狀態(tài)、構(gòu)象、與配體結(jié)合的解離速度及研究蛋白質(zhì)卷曲與折疊。此外，nmr技術(shù)還可用于鑒定蛋白質(zhì)分子中某些原子與配體分子中某些原子間的相互接觸，研究大分子之間以及它們與小分子之間的相互作用和分子識(shí)別。3.

39、3 拉曼光譜用激光拉曼光譜可以在生理環(huán)境或活體中做實(shí)驗(yàn)，使人們能夠觀察到在自然狀態(tài)下的生物大分子的特點(diǎn)并探討它們?cè)诮?jīng)過物理和化學(xué)方法處理后構(gòu)象和構(gòu)型的變化。對(duì)蛋白質(zhì)來說111-120，拉曼光譜不僅能得到它的氨基酸組成信息，還能得到某些二級(jí)結(jié)構(gòu)如螺旋、折疊、無規(guī)卷曲及回折方面的信息；不僅能得知它的主鏈構(gòu)象特別是酰胺i、iii、c-c、c-n伸張振動(dòng)，還能得知它的側(cè)鏈構(gòu)象，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的側(cè)鏈和后兩者的構(gòu)象及存在形式隨其微環(huán)境而變的情況，同時(shí)可以研究對(duì)構(gòu)象變化十分敏感的電離化的羧基、巰基、s-s、c-s鍵構(gòu)象的變化，對(duì)殘基內(nèi)氫鍵的變化也能提供不少信息。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與金屬離子作用時(shí)，從它們的

40、拉曼光譜就可得知發(fā)生變化的基團(tuán)、相互作用的地點(diǎn)與模式，從而能夠從分子水平較深入地研究它們構(gòu)象或構(gòu)型的變化及它們相互作用的機(jī)理。由于拉曼光譜在蛋白質(zhì)酰胺i帶水峰很小，因而較紅外光譜更為方便測(cè)定。garfinkel和edsal最早于1958年就開始采用拉曼光譜研究蛋白質(zhì)lysozyme113。1987年berjot114用富含螺旋和折疊的蛋白質(zhì)計(jì)算參考光譜，提出了定量測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的簡便方法。這種方法計(jì)算的二級(jí)結(jié)構(gòu)各成分含量準(zhǔn)確性較高，尤其對(duì)無序結(jié)構(gòu)的計(jì)算準(zhǔn)確性有很大提高。近幾年來，隨著二階導(dǎo)數(shù)和去卷積等方法的應(yīng)用，拉曼光譜又有了新的發(fā)展，若能將ft-拉曼與ftir結(jié)合，將會(huì)得到有關(guān)蛋白質(zhì)的大

41、量更為可靠的信息。3.4 x-ray衍射蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)主要靠x射線晶體學(xué)獲得121-125。蛋白質(zhì)晶體的第一個(gè)x射線圖像是由bernal和crowfoot于1934年測(cè)定出來的，但當(dāng)時(shí)沒有解決蛋白質(zhì)大分子晶體衍射的相位問題。直到1954年perutz等人證明重原子同晶置換可以解決相位問題，后又經(jīng)blow和crick加以發(fā)展，才解出了蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。第一個(gè)測(cè)定出晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)是肌紅蛋白，1960年由kendraw解析出來，隨后perutz解出了血紅蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。自此，x射線晶體學(xué)在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定方面飛速發(fā)展，成為一種非常有效的手段。到目前為止，紐約的brookhavan國家實(shí)驗(yàn)室國際

42、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（pdb）中的蛋白質(zhì)數(shù)量已有一萬多種。最近又出現(xiàn)了一種新技術(shù)-外延x射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（extended x-ray absorption fine structure，exafs譜），該技術(shù)不僅可以研究晶體結(jié)構(gòu)，還可用來研究非晶態(tài)及溶液中的大分子，還能探測(cè)特定吸收原子周圍的近鄰環(huán)境結(jié)構(gòu)，成為研究金屬蛋白質(zhì)絡(luò)合物的又一有力技術(shù)。如對(duì)鉬鐵蛋白exafs譜的研究表明，鉬的最接近配位體是硫，從而完全否認(rèn)了過去的mo=o雙鍵。3.5 電子晶體學(xué)與x射線衍射方法相似，電子晶體學(xué)已成為一種獨(dú)立的蛋白質(zhì)三維構(gòu)象空間結(jié)構(gòu)分析的又一重要方法126-129。劍橋mrc分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的kluy和de

43、rosier126建立的三維重構(gòu)的方法開辟了分子生物學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)嶄新的結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域，為此kuly于1982年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。近十年來，隨著計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)及蛋白質(zhì)二維結(jié)晶技術(shù)的發(fā)展和完善，電子晶體學(xué)已成為一種x射線晶體學(xué)所不可替代的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析的有效手段。另外，利用分子模擬技術(shù)可以對(duì)通過x射線衍射和核磁共振等實(shí)驗(yàn)手段得到的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修和驗(yàn)證，并能根據(jù)已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源預(yù)測(cè)130-135。相信隨著生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究必將更加完善。參考文獻(xiàn)1. 王夔，生物無機(jī)化學(xué)十年進(jìn)展，中國科學(xué)出版社，1997，北京2. p.

44、w.shen, y.q.zhou, et al. inorg.chem.acta, 1990,169:1613. y.q.zhou, x.y.hu, et al., j.biochem.,1994,304:234. y.q.zhou, y.w.wang, p.w.shen, et al., biophys.chem.,1994,51:85. r.h.kretsinger and c.nockolds, j.biol.chem., 1973, 248:33136. t.l.blundell, j.a.jenkins, chem.soc.rev., 1977, 6(2):1397. j.a.nat

45、hanson,r.freedman,b.j.hofer, nature, 1975,261:3308. b.w.matthews,l.h.weaver, biochemistry, 1974,13:17199. 陳文興，沈之荃等，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2000,21（2）：30610. 梁宏，刑本剛等， 化學(xué)學(xué)報(bào)， 1999，57（2）：16111. l.a.eguchi, p.saltman, inorg.chem. , 1987,26(22):366912. p.t.manoharan, et al., bichemistry, 1989, 28(18):714813. m.x.wu, s.j

46、.filley, et al., biochem.biophys.res.commu., 1994, 201(3):107914. l.a.dick, i.malfant, et al. , j.am.chem.soc., 1998,120(44):1140115. 遲燕華，李克安等， 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 1999，20（11）：169716. 周永洽，張喜全等， 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 1997， 18（6）：85117. 沈星燦，邊賀東，梁宏等， 無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)， 2000，16（1）：7318. 周永洽，太俊哲等， 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 1996，17（9）：133119. s. naoya,

47、y. takashi, biochemistry, 1995,34(45):1465820. s.z.hu, inorg.chem., 1993,32(7):108121. j.h.bowen, n.v.shokhirev, et al., j.phys.chem. b, 1997,101(43):868322. e.zahavy, i.willner, j.am.chem.soc., 1996,118(50):1249923. j.bio.chem., 1996,271(41):2541924. 周永洽，胡緒英，申泮文，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1991，49（1）：5925. 岳晟，仲維清，張保林

48、， 無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)， 1995，11（3）：29026. ahmed a, tajmirriahi ha, j.mol.struc. 1994, 319:14527. liang h, tu cq, et al. chin.j.chem. , 2000,18(1):3528. s.nahar, h.a.tajmirriahi, j.coll.inter.sci. 1996,178(2):64829. c.q.tu, h.z.zhang, h.liang, et al. , 化學(xué)學(xué)報(bào)，2000，58（2）：22930. 薛德平，林華寬，王夔， 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 1999，20（2）：16731.

49、 宋苑苑，李曉峰，吳瑾光等， 無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)， 1999，15（4）：50932. m.t.henzl, e.r.birnbaum, j.biol.chem. 1988,263:1067433. d m e szebenyi, s k oberdorf, k moffat, nature, 1981,294:32734. horrocks w d, mulquen p, et al. , inorg. chem. acta. 1983,79:2435. j.m.buccigross, d.j.nelson, biochem.biophys.res.commun. 1986, 138:124336

50、. barden j a, dos remedios c g, biochem.biophys.acta., 1978,537:41737. aebi u, smith p r, et al. nature, 1980,288:29638. chantler p d, j.biol.chem., 1983,258:470239. spartalian k, oosterhuis w t., j.chem.phys. , 1973, 59:61740. ohara p b, bersohn r. , biochemistry, 1982,21:526941. dower s k, dwek r

51、a, et al. biochem. j., 1975,149:7342. yang p, yang b s, wang j l, chin. sci. bull., 1989,34:74743. ma g b, yang p, j.mol.sci., 1992,8:3944. 楊頻，馬貴斌，楊斌盛， 化學(xué)學(xué)報(bào)， 1989，47（5）：44345. 趙雨，徐金澤等，高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2000，21（12）：191346. 張保林，王文清， 無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)， 1993， 9（4）：36947. 李曉晶，王志強(qiáng)，張樹功等， 應(yīng)用化學(xué)， 1998， 15（1）：548. 李曉晶，張善榮等， 高等學(xué)校

52、化學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（1）：12749. 李欣宇，張善榮等， 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19（12）：202650. aimi,silvio; digilio, giuseppe, et al. , biophys.j. 1999,76(5):273551. 楊頻，馬貴斌，趙紅衛(wèi)， 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，1991，12：57752. 馮志祥，張樹功等， 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1995，16（7）：99353. 仲維清，張琦，唐雯霞等， 無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)， 1997，13（3）：24154. 王夔，劉冬， 無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)， 1992，8（3）：22555. 陳寶衛(wèi)，王夔， 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，1991，1

53、2（7）：85756. 李連之，張萬明，王夔等，無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，1995，11（3）：26757. 王夔，曾慧慧等， 化學(xué)學(xué)報(bào)， 1992，50（7）：68558. 張朝平，胡宗起等， 光譜實(shí)驗(yàn)室， 1997，14（5）：159. 張朝平，夏敏， 光譜學(xué)與光譜分析， 1996，16（5）：4360. i. koichiro, m. isao, biochemistry, 1988,27(11):406061. elmottaleb a, et al., transition metal chemistry, 1997,22(6):52962. daizadeh i, gehlen j n, et

54、 al. , j.chem.phys. , 1997,106(13):565863. reid r s, rabenstein d l, j.am.chem.soc., 1982,104(24):673364. b.t.wong, et al., biophys. chem. , 1992, 42(2):20165. r.huber, o.epp, h.formanek, j.mol.biol. 1970,232:1266. f.r.salemme, s.t.freer, et al. , j.biol.chem. , 1973,248:391067. 李舒婷，查丹明，梁宏等， 光譜學(xué)與光譜分析，1999，19（5）：70068. r.sperling, y.burstein, i.z.steinberg, biochemistry, 1969,8:381069. g.miyazaki, h.morimoto, et al., j.mol.biol. , 1999,292(5):112170. y.m. halysiba, et al., j.inorg.biochem. , 1997,65(4):24571. j.l.bock, g.b.cru