蛋白質的結構和功能

1、生物化學與分子生物學生物化學與分子生物學department of biochemistry and molecular biology, cmu緒緒 論論n生物化學，是研究生物體內化學分子與化學生物化學，是研究生物體內化學分子與化學反應的科學，從分子水平探討生命現象的本反應的科學，從分子水平探討生命現象的本質質n分子生物學，研究核酸、蛋白質等生物大分分子生物學，研究核酸、蛋白質等生物大分子的結構、功能及基因結構、表達與調控，子的結構、功能及基因結構、表達與調控，揭示了生命本質的高度有序性和一致性揭示了生命本質的高度有序性和一致性生物化學發(fā)展簡史生物化學發(fā)展簡史分為三個階段：分為三個階段：n敘

2、述生物化學階段敘述生物化學階段主要研究生物體的化學組成主要研究生物體的化學組成n動態(tài)生物化學階段動態(tài)生物化學階段營養(yǎng)方面、內分泌方面、酶學方面、物質代謝營養(yǎng)方面、內分泌方面、酶學方面、物質代謝方面方面生物化學發(fā)展簡史生物化學發(fā)展簡史n分子生物學的崛起分子生物學的崛起dna雙螺旋結構的發(fā)現雙螺旋結構的發(fā)現dna克隆克隆(重組重組dna技術技術)基因組學和其他組學基因組學和其他組學人類基因組計劃人類基因組計劃 hgp（ human genome project ）是由美國是由美國科學家于科學家于1985年率先提出，于年率先提出，于1990年正式啟動的。年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我

3、國科學家共同美國、英國、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一價值達參與了這一價值達30億美元的人類基因組計劃。與億美元的人類基因組計劃。與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學計曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學計劃。劃。研究內容：研究內容：遺傳圖譜遺傳圖譜 物理圖譜物理圖譜序列圖譜序列圖譜 基因圖譜基因圖譜n研究人員曾經預測人類約有研究人員曾經預測人類約有710萬個基因，萬個基因，但人類基因總數實際在但人類基因總數實際在2.6383萬到萬到3.9114萬個之間，不超過萬個之間，不超過40,000，只是線蟲或果，只是線蟲或果蠅基因數量的兩倍，人有而鼠沒有的基因蠅基因數量的兩倍

4、，人有而鼠沒有的基因只有只有300個。個。生物化學研究的主要內容生物化學研究的主要內容n生物分子的結構與功能生物分子的結構與功能n物質代謝及其調節(jié)物質代謝及其調節(jié)n基因信息傳遞及其調控基因信息傳遞及其調控生物化學與醫(yī)學生物化學與醫(yī)學n生物化學滲透到醫(yī)學的各個領域生物化學滲透到醫(yī)學的各個領域n生物化學是生命科學的基礎學科生物化學是生命科學的基礎學科n生物化學的發(fā)展推動臨床醫(yī)學診斷、檢驗、生物化學的發(fā)展推動臨床醫(yī)學診斷、檢驗、治療手段的發(fā)展治療手段的發(fā)展教材綱要教材綱要n生物大分子的結構與功能生物大分子的結構與功能蛋白質的結構與功能蛋白質的結構與功能核酸的結構與功能核酸的結構與功能酶酶教材綱要教材

5、綱要n物質代謝及其調節(jié)物質代謝及其調節(jié)生物氧化生物氧化糖代謝糖代謝脂類代謝脂類代謝氨基酸代謝氨基酸代謝核苷酸代謝核苷酸代謝教材綱要教材綱要n基因信息的傳遞基因信息的傳遞dna的生物合成的生物合成(復制復制)rna的生物合成的生物合成(轉錄轉錄)蛋白質的生物合成蛋白質的生物合成(翻譯翻譯)基因表達調控基因表達調控基因重組與基因工程基因重組與基因工程教材綱要教材綱要n專題篇專題篇細胞信號轉導細胞信號轉導癌基因、抑癌基因癌基因、抑癌基因血液的生物化學血液的生物化學肝的生物化學肝的生物化學 蛋白質的結構和功能蛋白質的結構和功能 structure and function of protein 蛋白質

6、蛋白質(protein)是許多氨基酸是許多氨基酸(amino acid)通過肽鍵通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分相連形成的高分子含氮化合物子含氮化合物蛋白質的生物學重要性蛋白質的生物學重要性n蛋白質是生物體的基本組成部分蛋白質是生物體的基本組成部分含量高含量高人體固體成分的人體固體成分的45%，細胞干重的，細胞干重的70%以上以上分布廣分布廣所有的器官組織都含有蛋白質，細胞的各個部所有的器官組織都含有蛋白質，細胞的各個部分都含有蛋白質分都含有蛋白質p種類多種類多蛋白質的生物學重要性蛋白質的生物學重要性n蛋白質具有重要的生物學功能蛋白質具有重要的生物學功能生物催化劑生物催化劑代

7、謝調節(jié)代謝調節(jié)免疫防護免疫防護物質的轉運與存儲物質的轉運與存儲運動與支持運動與支持細胞間信息傳遞細胞間信息傳遞n氧化供能氧化供能第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質的分子組成蛋白質的分子組成蛋白質的元素組成蛋白質的元素組成 組成蛋白質的元素主要有：組成蛋白質的元素主要有：c、h、o、n和和s有些蛋白質還含有少量有些蛋白質還含有少量p或金屬元素鐵、銅或金屬元素鐵、銅鋅、錳、鈷、鉬等，個別蛋白質還含有碘鋅、錳、鈷、鉬等，個別蛋白質還含有碘n體內主要的含氮物質是蛋白質體內主要的含氮物質是蛋白質n各種蛋白質的平均含各種蛋白質的平均含氮氮量為量為16% 100g樣品中蛋白質的含量樣品中蛋白質的含量 =每克樣品中含氮克數

8、每克樣品中含氮克數6.25 1001/16%一、氨基酸一、氨基酸n蛋白質的基本組成單位蛋白質的基本組成單位n組成人體蛋白質的氨基酸只有組成人體蛋白質的氨基酸只有20種，且都種，且都是是l- -氨基酸氨基酸( (甘氨酸甘氨酸除外除外) )h3n+hrccoo-l- -氨基酸通式氨基酸通式甘甘氨酸氨酸c+nh3coo-hrl- -氨基酸通式氨基酸通式ch3丙氨酸丙氨酸(一一)氨基酸的分類氨基酸的分類n根據側鏈的結構和理化性質分五類根據側鏈的結構和理化性質分五類：非極性脂肪族氨基酸：側鏈含烴鏈的氨基酸非極性脂肪族氨基酸：側鏈含烴鏈的氨基酸極性中性氨基酸：側鏈有極性但不帶電荷極性中性氨基酸：側鏈有極性

9、但不帶電荷芳香族氨基酸：側鏈含芳香基團芳香族氨基酸：側鏈含芳香基團酸性氨基酸：側鏈含負性解離基團酸性氨基酸：側鏈含負性解離基團堿性氨基酸：側鏈含正性解離基團堿性氨基酸：側鏈含正性解離基團非極性脂肪族氨基酸非極性脂肪族氨基酸 極性中性氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸 堿性氨基酸堿性氨基酸n特殊氨基酸特殊氨基酸脯氨酸脯氨酸(pro)，環(huán)型結構，屬于亞氨基酸，環(huán)型結構，屬于亞氨基酸脯氨酸在蛋白質合成加工時可被羥基化修飾成脯氨酸在蛋白質合成加工時可被羥基化修飾成羥脯氨酸羥脯氨酸甘氨酸甘氨酸(gly)無旋光性、無無旋光性、無l-、d-型之分型之分chh-ooc+h3n半胱

10、氨酸半胱氨酸(cys)+-ooc-ch-ch2-s+nh3s-ch2-ch-coo-+nh3-ooc-ch-ch2-s+nh3s-ch2-ch-coo-+nh3胱氨酸胱氨酸-hh-ooc-ch-ch2-sh+nh3-ooc-ch-ch2-sh+nh3hs-ch2-ch-coo-+nh3hs-ch2-ch-coo-+nh3n修飾氨基酸：蛋白質合成后通過修飾加工修飾氨基酸：蛋白質合成后通過修飾加工生成的氨基酸。沒有相應的編碼。如胱氨生成的氨基酸。沒有相應的編碼。如胱氨酸、羥脯氨酸酸、羥脯氨酸(hyp)、羥賴氨酸、羥賴氨酸(hyl)n非生蛋白氨基酸：蛋白質中不存在的氨基非生蛋白氨基酸：蛋白質中不存在

11、的氨基酸。如瓜氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸，酸。如瓜氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸，這些氨基酸是在代謝途徑中產生的。這些氨基酸是在代謝途徑中產生的。n習慣分類法習慣分類法：芳香族氨基酸芳香族氨基酸: trp, tyr, phe含羥基含羥基(-oh)氨基酸氨基酸: tyr, thr, ser含硫氨基酸含硫氨基酸: cys, met支鏈氨基酸支鏈氨基酸: val, leu, ile雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)族氨基酸: his雜環(huán)族亞氨基酸雜環(huán)族亞氨基酸: pro(二二)、氨基酸的理化性質、氨基酸的理化性質n兩性解離及等電點兩性解離及等電點n紫外吸收性質；含共軛雙鍵色氨酸，酪氨酸紫外吸收性質；含共軛雙鍵色氨酸，酪氨

12、酸n茚三酮反應：當氨基酸與茚三酮共熱時，茚三酮反應：當氨基酸與茚三酮共熱時，aa被氧被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮被還原，其還原產物與化脫氨、脫羧，而茚三酮被還原，其還原產物與氨結合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍紫色化氨結合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍紫色化合物，測合物，測a570nm二、肽二、肽(一一)肽肽(peptide) 肽鍵肽鍵(peptide bond)是由一個氨基是由一個氨基酸的酸的 -羧基與另一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的 -氨基脫氨基脫水縮合而形成的化學鍵水縮合而形成的化學鍵nh2-ch-chooh甘甘氨氨酸酸nh2-ch-chooh甘甘氨氨酸酸nh-ch-choho oh甘甘

13、氨氨酸酸+-hoh肽鍵nh2-ch-c-n-ch-coohhhhonh2-ch-c-n-ch-coohhhho甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸n二肽、三肽、五肽二肽、三肽、五肽n寡肽寡肽(oligopeptide)、多肽、多肽(polypeptide)n氨基末端氨基末端(amino terminal)，也叫，也叫n-端端n羧基末端羧基末端(carboxyl terminal)，也叫，也叫c-端端n氨基酸殘基氨基酸殘基(residue)n多肽鏈多肽鏈(polypeptide chain)n多肽鏈從氨基末端走向羧基末端多肽鏈從氨基末端走向羧基末端n多肽與蛋白質的分界多肽與蛋白質的分界n末端末端c末端末端牛

14、核糖核酸酶牛核糖核酸酶(二二)生物活性肽生物活性肽n谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione, gsh)n谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽n谷氨酸的谷氨酸的 -羧基羧基形成肽鍵形成肽鍵n-sh為活性基團為活性基團n為酸性肽為酸性肽n是體內重要是體內重要的還原劑的還原劑gsh的生物學功能的生物學功能ngsh的巰基具有還原性，保護體內蛋白質或的巰基具有還原性，保護體內蛋白質或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。態(tài)。n還原細胞內產生的還原細胞內產生的h2o2，使其變成，使其變成h2o。ngsh的巰基有嗜核特性，能與外源的

15、嗜電子的巰基有嗜核特性，能與外源的嗜電子毒物結合，阻斷這些化合物與毒物結合，阻斷這些化合物與dna、rna或或蛋白質結合，保護機體免遭毒物損害。蛋白質結合，保護機體免遭毒物損害。gsh過氧過氧化物酶化物酶h2o2 2gsh 2h2o gssg gsh還原酶還原酶nadph+h+ nadp+ 第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質的分子結構蛋白質的分子結構n蛋白質的分子結構包括蛋白質的分子結構包括： 一級結構一級結構(primary structure)二級結構二級結構(secondary structure)三級結構三級結構(tertiary structure)四級結構四級結構(quaternary stru

16、cture)高級結構高級結構或或空間構象空間構象一、蛋白質的一級結構一、蛋白質的一級結構n定義：定義： 在蛋白質分子中，從在蛋白質分子中，從n-端至端至c-端的氨基酸排列端的氨基酸排列順序順序n主要化學鍵：主要化學鍵： 主要化學鍵是主要化學鍵是肽鍵肽鍵，蛋白質分子中，蛋白質分子中二硫鍵的位置二硫鍵的位置也屬于一級結構的范疇也屬于一級結構的范疇二、蛋白質的二級結構二、蛋白質的二級結構n定義：定義： 蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象間位置，并不涉及氨基酸殘基側

17、鏈的構象n主要化學鍵：主要化學鍵：氫鍵氫鍵 (一一)肽單元肽單元 參與肽鍵的參與肽鍵的6個原子個原子c 1，c，o，n，h，c 2位于同位于同一平面，一平面， c 1和和c 2在平面上所處在平面上所處的位置為反式構型，的位置為反式構型，此同一平面上的此同一平面上的6個原子構成了所謂個原子構成了所謂的肽單元的肽單元cnhh0.1320.1460.151cr20.124r1choc-n: 0.149nmcn: 0.127nm相鄰肽單元的旋轉性相鄰肽單元的旋轉性nh3+co2-c肽鏈骨架肽單元蛋白質二級結構的模型蛋白質二級結構的模型n蛋白質二級結構的主要形式蛋白質二級結構的主要形式 -螺旋螺旋( -

18、helix) -折疊折疊( -pleated sheet) -轉角轉角( -turn)無規(guī)則卷曲無規(guī)則卷曲(random coil)n維系二級結構穩(wěn)定性的主要化學鍵維系二級結構穩(wěn)定性的主要化學鍵氫鍵氫鍵(二二) -螺旋螺旋( -helix):p多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。旋，側鏈伸向螺旋外側。p每圈螺旋含每圈螺旋含3.63.6個氨基酸，螺個氨基酸，螺距為距為0.54nm0.54nm。p每個肽鍵的亞氨氫和第四個每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長軸基本平行軸基

19、本平行。* *propro的的n n上缺少上缺少h h，不能形成氫，不能形成氫鍵，經常出現在鍵，經常出現在 - -螺旋的末螺旋的末端，它改變多肽鏈的方向并端，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋終止螺旋 脯氨酸脯氨酸(pro)(三三) -折疊折疊( -pleated sheet)n結構要點：結構要點：多肽鏈充分伸展，每個肽單元以多肽鏈充分伸展，每個肽單元以c c 為旋轉點，為旋轉點，依次折疊成鋸齒狀結構，側鏈交替地位于鋸齒依次折疊成鋸齒狀結構，側鏈交替地位于鋸齒狀結構的上下方狀結構的上下方兩段以上兩段以上 - -折疊結構平行排列，可以順向平行，折疊結構平行排列，可以順向平行，也可以反向平行也可以反向平

20、行每兩鏈之間的肽鍵形成氫鍵，從而維持每兩鏈之間的肽鍵形成氫鍵，從而維持 - -折疊折疊結構的穩(wěn)定結構的穩(wěn)定nncn n c cc順向平行順向平行反向平行反向平行(四四) -轉角和無規(guī)卷曲轉角和無規(guī)卷曲n - -轉角轉角( ( -turn) )肽鏈內形成肽鏈內形成180180回折回折通常含有通常含有4 4個氨基酸殘基，第一個殘基的羰個氨基酸殘基，第一個殘基的羰基氧與第四個殘基的氨基氫形成氫鍵基氧與第四個殘基的氨基氫形成氫鍵第二個氨基酸殘基通常為脯氨酸第二個氨基酸殘基通常為脯氨酸n無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構 n1chcc2chnho=c3chnc4chnrrh

21、ohrroho(五五)模體模體 蛋白質分子中二個或三個具有二級結構的肽段，在蛋白質分子中二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊功能的空間構象，被稱空間上相互接近，形成一個特殊功能的空間構象，被稱為模體為模體(motif)具有特殊功能的超二級結構具有特殊功能的超二級結構n一些常見的模體：一些常見的模體：鋅指鋅指螺旋螺旋-環(huán)環(huán)-螺旋螺旋螺旋螺旋-轉角轉角-螺旋螺旋堿性亮氨酸拉鏈堿性亮氨酸拉鏈dnadna結合蛋白的鋅指結構模體結合蛋白的鋅指結構模體鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體堿堿性性亮亮氨氨酸酸拉拉鏈鏈(六六)側鏈對二級結構形成的影響側鏈對二級結構形

22、成的影響n影響影響 -螺旋形成的因素螺旋形成的因素p脯氨酸的剛性五元環(huán)，影響氫鍵的形成，不脯氨酸的剛性五元環(huán)，影響氫鍵的形成，不形成形成-螺旋。螺旋。p多個酸性或堿性氨基酸殘基相鄰，由于同性多個酸性或堿性氨基酸殘基相鄰，由于同性電荷彼此相斥，妨礙電荷彼此相斥，妨礙-螺旋的形成。螺旋的形成。p側鏈較大的氨基酸殘基，如天冬酰胺、亮氨側鏈較大的氨基酸殘基，如天冬酰胺、亮氨酸等，也影響酸等，也影響-螺旋形成。螺旋形成。n影響影響 -折疊形成的因素折疊形成的因素p要求氨基酸的側鏈較小要求氨基酸的側鏈較小三、蛋白質的三級結構三、蛋白質的三級結構n定義：定義： 整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，整條肽

23、鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，也就是整條肽鏈所有原子在三維空間的排布位也就是整條肽鏈所有原子在三維空間的排布位置置n穩(wěn)定因素：穩(wěn)定因素： 次級鍵次級鍵疏水作用疏水作用、離子鍵、離子鍵(鹽鍵鹽鍵)、氫鍵和、氫鍵和van der waals力力 共價鍵共價鍵二硫鍵也參與維持三級結構二硫鍵也參與維持三級結構n 端端 c端端肌紅蛋白肌紅蛋白(mb)3-磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油醛脫氫酶磷酸丙糖異構酶磷酸丙糖異構酶結構域結構域 分子量較大的蛋白質三級結構?？烧鄯肿恿枯^大的蛋白質三級結構?？烧郫B成多個結構較為緊密的區(qū)域，各行其功疊成多個結構較為緊密的區(qū)域，各行其功能，稱為能，稱為結構域結構域(domai

24、n)纖連蛋白分子的結構域纖連蛋白分子的結構域 分子伴侶分子伴侶(chaperon)n定義：定義： 通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構的一類蛋折疊成天然構象或形成四級結構的一類蛋白質白質 許多的分子伴侶是許多的分子伴侶是atp酶酶n作用：作用：可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合后松開，可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合后松開，如此反復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈如此反復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊正確折疊與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊其正確折疊對蛋白質分子中二硫鍵

25、的正確形成起重要作用對蛋白質分子中二硫鍵的正確形成起重要作用四、四級結構四、四級結構n亞基亞基(subunit)： 每條具有完整的三級結構的多肽鏈，稱為亞基每條具有完整的三級結構的多肽鏈，稱為亞基n四級結構四級結構： 蛋白質分子中各個亞基的空間排布及亞基接觸蛋白質分子中各個亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構n各亞基間的結合力主要是氫鍵、離子鍵各亞基間的結合力主要是氫鍵、離子鍵五、蛋白質的分類五、蛋白質的分類n根據蛋白質組成成分根據蛋白質組成成分單純蛋白質單純蛋白質結合蛋白質結合蛋白質 = = 蛋白質部分蛋白質部分 + +

26、 非蛋白質部分非蛋白質部分n根據蛋白質形狀根據蛋白質形狀 纖維狀蛋白質纖維狀蛋白質球狀蛋白質球狀蛋白質 （輔基）（輔基）六、蛋白質組學六、蛋白質組學（一）蛋白質組學基本概念（一）蛋白質組學基本概念蛋白質組（蛋白質組（proteome）是指一種細胞）是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質，即或一種生物所表達的全部蛋白質，即“一一種基因組所表達的全套蛋白質種基因組所表達的全套蛋白質”。 蛋白質組學（蛋白質組學（proteomics）以細胞內全）以細胞內全部蛋白質的存在及其活動方式為研究對象。部蛋白質的存在及其活動方式為研究對象。蛋白質組學研究內容：蛋白質組學研究內容：蛋白質表達譜蛋白質表達譜蛋白

27、質翻譯后修飾譜蛋白質翻譯后修飾譜蛋白質亞細胞定位圖蛋白質亞細胞定位圖蛋白質蛋白質相互作用圖蛋白質蛋白質相互作用圖蛋白質組生物信息學及數據庫蛋白質組生物信息學及數據庫（二）蛋白質組學研究技術平臺（二）蛋白質組學研究技術平臺 技術路線：技術路線： 雙向電泳技術雙向電泳技術 基質輔助激光解析飛行時間質譜技術基質輔助激光解析飛行時間質譜技術（maldi-tof） 電噴霧質譜技術（電噴霧質譜技術（es-ms） 液相層析質譜技術（液相層析質譜技術（ls/ms/ms） 蛋白質芯片蛋白質芯片 蛋白質組學的研究是高通量，高效率的。蛋白質組學的研究是高通量，高效率的。1. 雙向電泳分離樣品蛋白質雙向電泳分離樣品蛋

28、白質 2. 蛋白質點的定位、切取蛋白質點的定位、切取 3. 蛋白質點的質譜分析蛋白質點的質譜分析 （三）蛋白質組學研究的科學意義（三）蛋白質組學研究的科學意義解析蛋白質的表達與功能的全貌，為生解析蛋白質的表達與功能的全貌，為生命活動規(guī)律提供物質基礎；為多種疾病發(fā)生命活動規(guī)律提供物質基礎；為多種疾病發(fā)生發(fā)展機制的闡明及攻克提供理論根據和解決發(fā)展機制的闡明及攻克提供理論根據和解決途徑。途徑。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質結構與功能的關系蛋白質結構與功能的關系一、蛋白質的一級結構與是高級結構與功能一、蛋白質的一級結構與是高級結構與功能的基礎的基礎(一一)一級結構是空間構象的基礎一級結構是空間構象的基礎牛核糖核

29、酸酶的牛核糖核酸酶的一級結構一級結構二二硫硫鍵鍵 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性ribonucleaseribonuclease a: amino acid sequence a: amino acid sequence ribonucleaseribonuclease a a8 m urea and -mercapotoethanoldialysis變性變性復性復性(二二)一級結構與功能的關系一級結構與功能的關系 大量實驗證明，一級結構相似的多肽和大量實驗證明，一級結構相似的多

30、肽和蛋白質，其空間構象以及功能也相似蛋白質，其空間構象以及功能也相似n蛋白質的一級結構是由遺傳信息決定的蛋白質的一級結構是由遺傳信息決定的 氨基酸殘基序號氨基酸殘基序號 胰島素胰島素 a5 a6 a10 b30 人人 thr ser ile thr 豬豬 thr ser ile ala 狗狗 thr ser ile ala 兔兔 thr gly ile ser 牛牛 ala gly val ala 羊羊 ala ser val ala 馬馬 thr ser ile ala不不同同生生物物來來源源的的細細胞胞色色素素c c中中不不變變的的aaaa殘殘基基141061001343230292718

31、17675952514845413887848280706891glyglyphecysglyglyglyarglysglycyslysphehisproleuglyargtyralaasntrptyr707580lyslyslysproprotyrileglythrmetasnleu血紅素血紅素細胞色素細胞色素c c分子的空間結構分子的空間結構不變不變的的aaaa殘基殘基 35個不變的個不變的aa殘基，是殘基，是cyt c 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構象；有的可缺少的。其中有的可能參加維持分子構象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與可能參與電子傳遞；有的可

32、能參與“識別識別”并結合并結合細胞色素還原酶和氧化酶。細胞色素還原酶和氧化酶。不同種屬不同種屬氨基酸殘基的差異數目氨基酸殘基的差異數目分歧時間分歧時間(百萬年百萬年)人人-猴猴150-60人人-馬馬1270-75人人-狗狗1070-75豬豬-牛牛-羊羊0馬馬-牛牛360-65哺乳類哺乳類-雞雞10-15280哺乳類哺乳類-猢猢17-21400脊椎動物脊椎動物-酵母酵母43-481,100細胞色素細胞色素c c分子中氨基酸殘基的差異數目及分歧時間分子中氨基酸殘基的差異數目及分歧時間 （三）氨基酸序列提供重要的生物進化信息（三）氨基酸序列提供重要的生物進化信息物種進化過程中越接物種進化過程中越接近

33、的生物，它們的細胞色近的生物，它們的細胞色素素c c一級結構越近似一級結構越近似n蛋白質的一級結構是空間構象和特異生物蛋白質的一級結構是空間構象和特異生物學功能的基礎，但不是決定蛋白質空間構學功能的基礎，但不是決定蛋白質空間構象的唯一因素象的唯一因素（四）重要的氨基酸序列改變可引起疾?。ㄋ模┲匾陌被嵝蛄懈淖兛梢鸺膊?鐮刀狀紅細胞貧血鐮刀狀紅細胞貧血-鏈鏈 1 2 3 4 5 6 7hb-a val-his-leu-thr-pro-glu-lyshb-s val-his-leu-thr-pro-val-lys鐮刀狀細胞貧血病是一種致死性鐮刀狀細胞貧血病是一種致死性疾病，但它能抵抗瘧疾。疾病

34、，但它能抵抗瘧疾。 分子病：分子?。?由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病 病因為基因突變所致病因為基因突變所致二、蛋白質功能依賴特定的空間結構二、蛋白質功能依賴特定的空間結構(一一)相似的空間結構有相似的功能相似的空間結構有相似的功能（二）血紅蛋白亞基構象變化可影響亞基與氧結合（二）血紅蛋白亞基構象變化可影響亞基與氧結合 協同效應協同效應(cooperativity) 一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為力的現象，稱為協同效應協

35、同效應。 促進作用稱為促進作用稱為正協同效應正協同效應 (positive cooperativity)抑制作用稱為抑制作用稱為負協同效應負協同效應(negative cooperativity)變構效應變構效應(allosteric effect)凡蛋白質（或亞基）因與某小分子物質相凡蛋白質（或亞基）因與某小分子物質相互作用而發(fā)生構象變化，導致蛋白質（或亞基）互作用而發(fā)生構象變化，導致蛋白質（或亞基）功能的變化，稱為蛋白質的功能的變化，稱為蛋白質的變構效應變構效應。(三三)蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象?。旱鞍踪|構象?。?若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不若蛋白質的

36、折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生嚴重時可導致疾病發(fā)生。n蛋白質構象病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相蛋白質構象病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變的病理改變n這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨丁頓舞蹈病、瘋牛病癥、亨丁頓舞蹈病、瘋牛病 瘋牛病：由朊病毒蛋白瘋牛病

37、：由朊病毒蛋白(prion protein, prp)引起引起的一組人和動物神經退行性病變的一組人和動物神經退行性病變 正常的正常的prp富含富含 -螺旋，稱為螺旋，稱為prpc， prpc在某種在某種未知的蛋白的作用下可轉變?yōu)槿珵槲粗牡鞍椎淖饔孟驴赊D變?yōu)槿珵?-折疊的折疊的prpsc，從而致病從而致病 prpc prpsc - -螺旋螺旋 - -折疊折疊 水溶性強，對蛋白酶不敏感，對熱穩(wěn)定水溶性強，對蛋白酶不敏感，對熱穩(wěn)定第四節(jié)第四節(jié)蛋白質的理化性質蛋白質的理化性質及其分離純化及其分離純化一、蛋白質的理化性質一、蛋白質的理化性質(一一)蛋白質的兩性解離蛋白質的兩性解離 蛋白質分子除兩端的氨

38、基和羧基可解蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液定的溶液ph條件下都可解離成帶負電荷或條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團正電荷的基團 蛋白質的等電點蛋白質的等電點(isoelectric point, pi) 當蛋白質溶液處于某一當蛋白質溶液處于某一ph時，蛋白質時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的性離子，凈電荷為零，此時溶液的ph成為成為蛋白質的等電點蛋白質的等電點prnh3+coohprnh3+coo- -prnh2coo- -oh-

39、-h +oh- -h +兼性離子ph=pi陽離子phpiamino acidpim.w.glycine5.9775alanine6.0089valine5.96117leucine5.98131isoleucine6.02131phenylalanine5.48165proline6.30115tryptophan5.89204serine5.68105tyrosine5.66181amino acidpim.w.cystein5.07121methionine5.74149asparagine5.41132glutamine5.65146cystein5.60119a s p a r t i

40、 c acid2.97133g l u t a m i c acid3.22147lysine9.74146arginine10.76174histidine7.59155n人體大部分蛋白質的人體大部分蛋白質的pi 點為點為 5.0左右左右, 因此因此在生理在生理ph7.4電環(huán)境下帶負電荷。電環(huán)境下帶負電荷。 npi 7.4: 堿性蛋白質，如堿性蛋白質，如 魚精蛋白、組蛋白魚精蛋白、組蛋白npi 7.4: 酸性蛋白質，如胃蛋白酶、絲蛋白酸性蛋白質，如胃蛋白酶、絲蛋白 利用蛋白質兩性解離的性質，可以通過利用蛋白質兩性解離的性質，可以通過電泳、離子交換層析等技術分離蛋白質電泳、離子交換層析等技術分

41、離蛋白質(二二)蛋白質的膠體性質蛋白質的膠體性質n蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至萬至100萬萬kd之間，其分子的直徑可達之間，其分子的直徑可達1100 nm，為膠粒范圍之內，為膠粒范圍之內n膠體性質：布朗運動、丁達爾現象、電泳膠體性質：布朗運動、丁達爾現象、電泳現象、不能透過半透膜、具有吸附能力現象、不能透過半透膜、具有吸附能力維持蛋白質膠體穩(wěn)定性的因素：維持蛋白質膠體穩(wěn)定性的因素：n表面電荷表面電荷n水化膜水化膜-+-+帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質

42、帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉溶液中蛋白質的聚沉(三三)蛋白質的變性蛋白質的變性n蛋白質的變性蛋白質的變性(denaturation) 在某些物理和化學因素的作用下，蛋在某些物理和化學因素的作用下，蛋白質分子的空間構象被破壞，從而導致其白質分子的空間構象被破壞，從而導致其理化性質的改變和生物活性的喪失，稱為理化性質的改變和生物活性的喪失，稱為蛋白質的變性蛋白質的變性n變性的本質：變性的本質： 二硫鍵和非共價鍵的破壞，不涉及一二硫鍵和非共價鍵的破壞，不涉

43、及一級結構中氨基酸序列的改變級結構中氨基酸序列的改變n蛋白質變性后性質的改變：蛋白質變性后性質的改變： 溶解度降低，粘性增加，結晶能力消溶解度降低，粘性增加，結晶能力消失，生物活性喪失，易被蛋白酶水解失，生物活性喪失，易被蛋白酶水解n導致變性的因素：導致變性的因素： 加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑重金屬離子及生物堿試劑n臨床應用：臨床應用：變性因素常被應用來消毒及滅菌變性因素常被應用來消毒及滅菌防止蛋白質變性是有效保存蛋白質制劑防止蛋白質變性是有效保存蛋白質制劑(如疫苗如疫苗等等)的必要條件的必要條件n蛋白質沉淀：蛋白質沉淀： 在一定

44、條件下，蛋白質疏水側鏈暴露在一定條件下，蛋白質疏水側鏈暴露在外，肽鏈融匯相互纏繞繼而聚集，因而在外，肽鏈融匯相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出，這一現象被稱為蛋白質沉從溶液中析出，這一現象被稱為蛋白質沉淀淀變性的蛋白質易于發(fā)生沉淀變性的蛋白質易于發(fā)生沉淀沉淀的蛋白質不一定變性沉淀的蛋白質不一定變性變性的蛋白質也不一定沉淀變性的蛋白質也不一定沉淀n復性復性(renaturation)： 若蛋白質變性程度較輕，去除變性因若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，的構象和功能，稱稱為復性為復性 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性

45、有催化活性尿素、尿素、-巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性n蛋白質的凝固蛋白質的凝固(protein coagulation)： 蛋白質變性后的絮狀物經加熱后可變蛋白質變性后的絮狀物經加熱后可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強堿和強酸中，這種現象稱為蛋白質的凝固堿和強酸中，這種現象稱為蛋白質的凝固* 凝固是蛋白質變性后進一步發(fā)展的不可逆凝固是蛋白質變性后進一步發(fā)展的不可逆的結果的結果(四四)、蛋白質的紫外、蛋白質的紫外吸收吸收 蛋白質分子中含有蛋白質分子中含有共軛雙鍵結構共軛雙鍵結構的的色氨酸色氨

46、酸和和酪氨酸酪氨酸，因此在，因此在280nm波長處有特征性波長處有特征性吸收。在此波長范圍內，吸收。在此波長范圍內，蛋白質的蛋白質的od280與其濃度與其濃度呈正比關系，因此可作呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定蛋白質定量測定(五五)、蛋白質的呈色反應、蛋白質的呈色反應n茚三酮反應：茚三酮反應： 蛋白質經水解后產生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反蛋白質經水解后產生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反應應n雙縮脲反應：雙縮脲反應： 蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，稱為雙縮脲反應銅共熱，呈現紫色或紅色，稱為雙縮脲反應*雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程

47、度雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度 某研究生利用紫外分光光度法測量一個某研究生利用紫外分光光度法測量一個八肽分子在溶液中的含量，測量得到的八肽分子在溶液中的含量，測量得到的od280的值接近于的值接近于0，該研究生認為溶液中，該研究生認為溶液中不含有此八肽分子。其檢測結果是否可信？不含有此八肽分子。其檢測結果是否可信？為什么？為什么？(八肽序列如下：八肽序列如下：ser-leu-glu-pro-asn-thr-gly-met)第五節(jié)第五節(jié)蛋白質的分離、純化蛋白質的分離、純化與結構分析與結構分析一、透析及超濾法一、透析及超濾法n透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分透析：利用透析袋把大分子蛋白質

48、與小分子化合物分開的方法子化合物分開的方法n超濾法：超濾法： 應用正壓或離心力使蛋白質溶液應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的縮蛋白質溶液的目的透析、超濾透析、超濾二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀n丙酮沉淀：丙酮沉淀： 使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀時，必須在時，必須在04低溫低溫下進行，丙酮用量一般下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀n鹽析鹽析(s

49、alt precipitation)： 將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀化膜被破壞，導致蛋白質沉淀n免疫沉淀：免疫沉淀： 將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白原蛋白三、電泳三、電泳(electrophoresis)

50、蛋白質在高于或低于其蛋白質在高于或低于其pi的溶液中為帶的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術，稱為電泳各種蛋白質的技術，稱為電泳n幾種重要的蛋白質電泳：幾種重要的蛋白質電泳：sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質分子：常用于蛋白質分子量的測定。量的測定。等電聚焦電泳等電聚焦電泳：通過蛋白質等電點的差異而分：通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。離蛋白質的電泳方法。雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳：是蛋白質組學研究的重要技術。：是蛋白質組

51、學研究的重要技術。sds-page電泳電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳：當蛋白質在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不當蛋白質在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。再移動。+5.06.07.0穩(wěn)定ph梯度5.06.07.0穩(wěn)定ph梯度通電+雙向電泳雙向電泳四、層析四、層析 層析層析(chromatography)分離蛋白質的原理分離蛋白質的原理 待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復等，

52、使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的離蛋白質的目的od280nmelution volumeelutionbufferprotein mixtureprotein 2protein 1solidphasecapableofreactingwithproteinsto beseparatedn蛋白質分離常用的層析方法蛋白質分離常用的層析方法離子交換層析離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。不同進行分離。凝膠過濾凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析：利用又

53、稱分子篩層析：利用各蛋白質分子大小不同分離。各蛋白質分子大小不同分離。親和層析親和層析：利用對配體的特異生物學親和力的：利用對配體的特異生物學親和力的純化方法純化方法離子交換層析離子交換層析ionic exchangecolumn withpositive chargemore negatively chargedproteins bind to the solidphase tightly, and strongerelution buffer is needed toelute them out the columnless negatively chargedproteins bind

54、to the solidphase loosely, and weakelution buffer can be used toelute them out the columnlarge proteins thatare unable to enterthe porous beads willpass by and flow outdirectlysmall proteins canenter the porousbeads, and have alonger stationarytimeporous beadsallow the smallproteins enter凝膠過濾層析（分子篩層

55、析）凝膠過濾層析（分子篩層析）exchange columnwith the ligandsfor bindingspecial proteinsproteins havingstrong bindingaffinity with theligadsproteins havingweak bindingaffinity with theligads親和層析親和層析五、超速離心五、超速離心 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)既可既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量白質的分子量* 蛋白質在離心場中的行為用蛋白質在離心場

56、中的行為用沉降系數沉降系數(sedimentation coefficient, s)表示表示,沉降沉降系數與蛋白質的密度和形狀相關系數與蛋白質的密度和形狀相關 。supernatantpellet(nuclei)600 g，3 minpellet(mitochondria, chloroplasts,lysosomes, peroxisomes)6,000 g，8 minsupernatantpellet(plasma membrane,fragments of golgi and er)40,000 g，30 minsupernatant(cytosol)pellet(ribosomal

57、subunits)100,000 g，90 minhomogenatesupernatant六、六、多肽鏈中氨基酸序列分析多肽鏈中氨基酸序列分析1. 分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成2. 測定多肽鏈的測定多肽鏈的n端與端與c端的氨基酸殘基端的氨基酸殘基3. 把肽鏈水解成片段，分別進行分析把肽鏈水解成片段，分別進行分析4. 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用 edman降解法降解法5. 經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果?；犴樞虻慕Y果。（一）改進的（一）改進的sanger法法將肽段順序進行疊聯以確定完整的順