細(xì)胞工程重點(diǎn)總結(jié)

1、細(xì)胞工程（1） 緒論 1根據(jù)研究對(duì)象的不同，細(xì)胞工程分為植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程。 2克隆羊多莉的誕生證明了動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性。（2） 第一章 基本技術(shù) 1. 培養(yǎng)基基本成分 大量元素 培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十毫克到幾千克。 無(wú)機(jī)鹽類 包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素 微量元素的用量一般低于10-5-10-7克分子濃度。植物所的 微量元素有 Fe、Cu、Zn、B、Mn、Mo、Co 有機(jī)成分：糖、維生素、肌醇、氨基酸、其他 植物激素：生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素 水：不同實(shí)驗(yàn)室要求使用不同級(jí)別的純化水 其它附加成分：瓊脂、活性炭、附加復(fù)合成分 2. 外植體(explan

2、t)：指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料。 外植體的三種來(lái)源：生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物 在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物 無(wú)菌環(huán)境下培養(yǎng)的植物 3. 外植體取材總體原則:根據(jù)培養(yǎng)需求選擇植物部位 多年生植物注意樹(shù)齡和季節(jié) 在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作為外 植體 4. 外植體滅菌順序：外植體清洗整理殺菌劑滅菌無(wú)菌水清洗 外植體滅菌后應(yīng)及時(shí)接種培養(yǎng) 5. 外植體培養(yǎng)條件的控制 光照 光照時(shí)間影響外植體再生狀態(tài)；光照強(qiáng)度因植物類型不同而異；光質(zhì) 研究報(bào)道較少 溫度 適溫有利于細(xì)胞分裂，而在一定范圍內(nèi)降低培養(yǎng)溫度則使細(xì)胞的質(zhì)量 增加。 pH 通常使用的pH值范圍是5.56.5。p

3、H在4.0以下或者7.0以上培養(yǎng) 物就不能正常生長(zhǎng)。由于外植體的吸收，引起培養(yǎng)過(guò)程中的pH變化； 高壓滅菌引起pH值變化 氣體 生長(zhǎng)量與氣體含量關(guān)系呈現(xiàn)倒“V”形，折點(diǎn)處的氣體含量對(duì)應(yīng)最大生 長(zhǎng)量 6. MS培養(yǎng)基適合培養(yǎng)的作物類型：適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基適合培養(yǎng)的作物類型：特別適合于禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)(3) 第二章 細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生 1. 細(xì)胞全能性： 一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整個(gè)體的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。 細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過(guò)細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表

4、達(dá)的最終體現(xiàn)。2. 細(xì)胞分化：所謂細(xì)胞分化（Differentiation），是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。 從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個(gè)處于不同時(shí)空條件下的細(xì)胞基因表達(dá)與修飾差異的反應(yīng)，所以分化也可以說(shuō)是相同基因型的細(xì)胞由于基因選擇性表達(dá)所反應(yīng)的不同表現(xiàn)型。3. 極性：所謂極性（polarity）是指植物的器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。4. .細(xì)胞脫分化: 培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的始脫分化的標(biāo)志。細(xì)胞的脫分

5、化過(guò)程可分為3個(gè)階段：?jiǎn)?dòng)階段：液泡蛋白體出現(xiàn)是啟動(dòng)脫分化的標(biāo)志。演變階段： 此時(shí)細(xì)胞核開(kāi)始向中央移動(dòng)，質(zhì)體演變成原質(zhì)體。終結(jié)期：細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開(kāi)始。激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素。 細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化具有同等重要的協(xié)同作用，它們的量與比值的不同配合，對(duì)細(xì)胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。先用生長(zhǎng)素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時(shí)處理，則可促使分化頻率的提高。5. 器官發(fā)生:植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過(guò)程。不定根、不定芽

6、是指在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷 組織上發(fā)生的根或芽。6. 器官發(fā)生方式：先芽后根；先根后芽；根芽同步發(fā)生。7. 器官發(fā)生過(guò)程：經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生；不經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生。8. 器官發(fā)生的影響因素：起始材料 母體植物的遺傳基礎(chǔ)和外植體類型及其生理狀態(tài)； 激素 生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位，CA3、PSK在器官分化中也具有一定調(diào)控作用；光照 光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時(shí)間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)器官分化均有影響； 基因調(diào)控 9. 體細(xì)胞胚的定義：離體培養(yǎng)下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚的 類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體

7、細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。10. 體細(xì)胞胚的界定：1）體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無(wú)融合生殖胚。2）體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚。3）體細(xì)胞經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程，以區(qū)別于離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑。11. 體細(xì)胞胚的形成途徑：1）體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生（誘導(dǎo)階段和胚胎發(fā)育階段）；2）間接發(fā)生 經(jīng)過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚形成經(jīng)過(guò)懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成；3）愈傷組織 誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期；4）懸浮細(xì)胞 愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚12. 影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素：1）激素的調(diào)控

8、作用 2,4-D是應(yīng)用最為廣泛的生長(zhǎng)素-球形胚期形成的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸對(duì)于體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育尤為重要 細(xì)胞分裂素在促進(jìn)細(xì)胞分裂，維持分生組織正常發(fā)育具有重要作用 2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基中的氮源亦會(huì)顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，體細(xì)胞胚的產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度的還原態(tài)氮 。 球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育 。 在胚性愈傷組織形成后，改用只含1/2MS無(wú)機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基，可顯著提高體細(xì)胞配的形成率。 在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度，可促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟。3）不同基因型間體細(xì)胞胚形成能力的差異 體細(xì)胞胚的產(chǎn)生在不同類型的植物間具有明顯差

9、異。 同類植物的不同基因型，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易、形成時(shí)間及單個(gè)外植體產(chǎn)生體細(xì)胞胚的數(shù)量上也存在明顯差異。（4） 第三章 體細(xì)胞遺傳變異1. 體細(xì)胞無(wú)性系：由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱為體細(xì)胞無(wú)性系。 體細(xì)胞無(wú)性系變異：由體細(xì)胞無(wú)性系表現(xiàn)出來(lái)的變異。2. 離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)：1）離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性 離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂，有絲分裂的DNA半保留復(fù)制和染色體的均等分裂機(jī)制，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)的另一個(gè)方面是即使發(fā)生某些變異，只需根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式進(jìn)行離體繁殖，即可以淘汰或選擇變異，或分離純合體。 2）離體

10、培養(yǎng)下的變異特點(diǎn) 變異的普遍性；變異的局限性；嵌合性。 3）影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素 供體植物 1、遺傳背景：倍性水平：二倍體單倍體（穩(wěn)定性） 基因型：植物種內(nèi)基因型間變異頻率差異較大 2、生理狀態(tài) 外植體：分生組織分化組織（穩(wěn)定性） 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式 1、激素 培養(yǎng)基激素濃度和不同激素配比對(duì)再生植株的染色體倍性有一定影響。激素引起的變異大多為倍性增加。少數(shù)情況下激素引起類減數(shù)分裂而使倍性減少。 2、物理狀態(tài) 一般來(lái)講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。 3、培養(yǎng)類型 原生質(zhì)體細(xì)胞組織器官。性細(xì)胞體細(xì)胞 繼代培養(yǎng)的次數(shù) 一般來(lái)講，繼代時(shí)間越長(zhǎng)，繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異的機(jī)率就越高。3

11、. 遺傳變異分為可遺傳變異和非遺傳變異。其中非遺傳變異：1）外遺傳變異：不涉及基因結(jié)構(gòu)的變化，而只是在基因表達(dá)水平上的變異。生長(zhǎng)素自養(yǎng)型變異，鴉屬植物。2）生理適應(yīng)性變異：培養(yǎng)基中硝酸鹽的存在引起的培養(yǎng)物硝酸還原酶活性增強(qiáng)，而硝酸鹽不存在時(shí)，硝酸還原酶活性又恢復(fù)到正常水平。4. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題、（5） 第四章 植物組織細(xì)胞培養(yǎng)1.植物脫毒的定義：利用植物組織培養(yǎng)的方法脫去植物體的病毒植物脫毒的基本原理：病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性（越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)，病毒濃度越低）機(jī)理解釋：能量競(jìng)爭(zhēng)；傳導(dǎo)抑制；激素抑制；酶缺乏；抑制因子植物脫毒的流程:1)母體植株的選擇和預(yù)處理；2)莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株（基本過(guò)

12、程：外植體消毒莖尖剝離莖尖培養(yǎng)）-莖尖的剝?nèi)?剝?nèi)ドL(zhǎng)點(diǎn)（錐）外圍的幼葉和葉原基，露出圓滑的生長(zhǎng)錐。剝?nèi)∏o尖時(shí)：迅速（防污染），準(zhǔn)確（防損傷生長(zhǎng)錐），用顯微鏡 3)脫毒效果檢測(cè) 指示植物鑒定：指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?；园Y狀的寄主植物。 血清鑒定：試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）。 4)脫毒苗的保存與繁殖 脫毒苗的離體保存與繁殖 建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系 木本植物建立隔離的脫毒苗母本園影響脫毒效果的因素：母體材料病毒侵染的程度 ；外植體的生理狀態(tài) ；起始培養(yǎng)的莖尖大小2常用的植物脫毒方法有微莖尖培養(yǎng)法、珠心組織培養(yǎng)法和熱處理法。3. 離體無(wú)性繁殖：是在人

13、工控制的無(wú)菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)。跟常規(guī)的繁殖方法相比它是一種微型操作過(guò)程，因此，有時(shí)就直接稱之為微繁（micropropagation）4. 植物脫毒時(shí)外植體的選擇:1)腋芽增殖；2）不定芽增殖；3）體細(xì)胞胚增殖；4）愈傷組織增殖5. 花藥培養(yǎng)：把發(fā)育到一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育分化成為支柱的過(guò)程。屬于器官培養(yǎng)，獲得單倍體。6. 花粉培養(yǎng)：又叫小孢子培養(yǎng)，從花藥中分離出花粉粒，使之成為分散的狀態(tài)，通過(guò)培養(yǎng)，使花粉粒脫分化進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過(guò)程。7. 花藥培養(yǎng)的基本程序：外植體選擇外植體預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)8. 花粉的發(fā)育時(shí)期：四分體

14、小孢子單核花粉雙核花粉花藥取材時(shí)期：?jiǎn)魏嘶ǚ弁砥诘诫p核花粉早期。培養(yǎng)時(shí)，蔗糖濃度，10-12 蔗糖在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的功能主要是：提供碳源；維持適宜的滲透壓；抑制花藥壁的分裂而促進(jìn)花粉細(xì)胞分裂花粉取材時(shí)期：四分體到單核花粉早期花粉的分離方法：1）機(jī)械分離法；2）花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法；3）磁拌法9.花粉的培養(yǎng)方法：1）直接培養(yǎng) 從不經(jīng)預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)的新鮮花藥中直接分離出花粉粒，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。 2）預(yù)培養(yǎng) 將花藥在液體培養(yǎng)基中先漂浮培養(yǎng)，然后擠出花粉，經(jīng)離心洗滌純化后懸浮于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。3）哺育培養(yǎng)。4）看護(hù)培養(yǎng)(濾紙起看護(hù)作用)10.根據(jù)在培養(yǎng)中所取的部位不同，植物胚胎培養(yǎng)包

15、括胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)。胚培養(yǎng)包括成熟胚培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)。11.胚培養(yǎng)在實(shí)踐中的意義：1） 克服雜交育種中雜種胚的早期夭折；2） 克服珠心胚干擾，提高育種效率；3） 理論研究領(lǐng)域的應(yīng)用12.植物胚胎發(fā)生過(guò)程：原胚球形胚心型胚魚雷胚子葉胚13.植物幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)： 1)取材時(shí)期 大多數(shù)幼胚培養(yǎng)成功實(shí)例證明，適宜于幼胚培養(yǎng)的胚發(fā)育時(shí)期多為球形胚至魚雷型胚。以幼胚搶救為目的的胚培養(yǎng)取材，必須在胚退化衰敗之前。 2)幼胚剝離 幼胚是一種半透明、高粘稠狀組織，剝離過(guò)程中極易失水干縮，一定要注意保濕，且操作要迅速。球形胚以前的幼胚培養(yǎng)，胚剝離時(shí)應(yīng)帶胚柄。 3)培養(yǎng)條件的控制 剝離出來(lái)的幼

16、胚要立即接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)之前必須對(duì)所培養(yǎng)的對(duì)象在自然發(fā)育條件下的特性充分了解，比如胚的休眠問(wèn)題、是否需要春化作用、胚萌發(fā)的溫度等。14. 幼胚離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育方式：1)胚性發(fā)育 幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，依然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚(有時(shí)甚至可能類似種子)，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成成熟植株。這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個(gè)幼胚將來(lái)就是一個(gè)植株。2)早熟萌發(fā) 幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長(zhǎng)而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱之為早熟萌發(fā)。在大多數(shù)情況下，一個(gè)有胚萌發(fā)成一個(gè)植株。但有時(shí)會(huì)由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)

17、象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。3）愈傷組織 在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。一般來(lái)講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。15.幼胚培養(yǎng)條件:1）培養(yǎng)基 蔗糖濃度：4-12%，幼胚所處的發(fā)育階段越早，所要求的蔗糖濃度越高。 激素：低濃度的GA3和KT能促使幼胚早熟萌發(fā)，GA3有時(shí)甚至具有胚柄的作用。 附加成分：胚乳提取物。 2）光照：培養(yǎng)初期的黑暗條件是必要的。 3）溫度：該植物種子萌發(fā)的適宜溫度為好。16.懸浮培養(yǎng)：是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。17.愈傷組織誘導(dǎo) 要求：松散性好、

18、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素；必要的附加物質(zhì)。18.一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件：1）懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30-50個(gè)細(xì)胞以下。2）均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。3）細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2-3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。19.懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)：延遲期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期直線生長(zhǎng)期減慢期靜止期（在減慢期可進(jìn)行繼代培養(yǎng)，方法是離心，加新鮮培養(yǎng)液）20.影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：1）起始愈傷組織的質(zhì)量；2）接種細(xì)胞密

19、度；3）培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期21.細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。22.同步化的方法：分選法；饑餓法；抑制劑法；低溫法23.單細(xì)胞培養(yǎng)：1）平板培養(yǎng)；2）看護(hù)培養(yǎng)；3）微室培養(yǎng)；4)雙層濾紙培養(yǎng)(6)第五章 原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜交1.原生質(zhì)體（protoplast）：除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。2.亞原生質(zhì)體（subprotoplast）：由于細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成的較小原生質(zhì)體。3.核質(zhì)體（nuclearplast）：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。4.胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核僅含部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。5.原生質(zhì)體的分

20、離：基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解收集與純化活力測(cè)定材料預(yù)處理: 用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。 預(yù)處理與酶解: 1) 酶：細(xì)胞壁降解酶 （酶解時(shí)間，酶解溫度，酶濃度）2) 滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等6. 原生質(zhì)體的收集和純化：1）沉降法：甘露醇作滲透壓調(diào)節(jié)劑，低速離心，原生質(zhì)體沉降于管底。2）漂浮法：蔗糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑，離心，原生質(zhì)體漂浮于溶液表面。3）梯度離心法：利用比重不同的溶液，離心，原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間。7. 原生質(zhì)體活力測(cè)定：1)熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)生綠色熒光。2)酚藏花紅染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。3)熒光增白劑染色法：有活力的原生質(zhì)體隨著細(xì)胞壁的再生產(chǎn)生綠色熒光。4）伊凡藍(lán)染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。8. 影響原生質(zhì)體活力的因素：1)分離材料的生理狀態(tài)；2)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、滲透壓；3)分離條件：離心次數(shù)、速度等；4)環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響9. 原生質(zhì)