胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 2016.07.21

1、-作者xxxx-日期xxxx胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 2016.07.21【精品文檔】胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，原代與繼代培養(yǎng)及鑒定劉亭 .21目錄前言21分離制備PMSC組織的選取32臍帶，胎盤MSC的分離與純化5胎盤組織的獲取，存儲與清洗52-2 臍帶，胎盤MSC的分離及純化方法63 原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)103-1培養(yǎng)基103-2培養(yǎng)密度113-3培養(yǎng)條件113-4換液113-5 傳代培養(yǎng)123-6細(xì)胞形態(tài)與生長速度123-7 MSC的凍存與復(fù)蘇：124細(xì)胞表面抗原檢測135生長曲線136細(xì)胞周期137分化潛能13參考文獻(xiàn)13附件1不同實(shí)驗(yàn)室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分離MSC的方法1

2、5臍帶血15臍帶15羊膜17絨毛膜18蛻膜層18胎盤19整體灌注法20附件2 背景知識20附件3 PMSC實(shí)驗(yàn)所需試劑21前言干細(xì)胞（Stem cell，SC）是一種能夠自我更新且未分化并可分化成兩個或兩個以上其它品系的細(xì)胞。在一定的條件下，干細(xì)胞能夠分化成為多種成熟細(xì)胞類型。按照來源和分化潛能不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESC）和成體干細(xì)胞（Adult stem cell，ASC）兩類。胚胎干細(xì)胞來源于早期的胚泡和胚胎內(nèi)層的細(xì)胞群，并且具有向3個胚層細(xì)胞分化的能力。但是胚胎干細(xì)胞應(yīng)用時產(chǎn)生的免疫排斥、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中引發(fā)腫瘤生成以及所涉及的倫理問題等影響并

3、制約了臨床應(yīng)用。成體干細(xì)胞形成于原腸胚形成后的胎兒和成體組織，早期研究認(rèn)為，成體干細(xì)胞主要分化為其來源組織的細(xì)胞類型。然而，近幾年來的很多研究表明，成體干細(xì)胞具有能夠分化成為除來源以外的其他胚層組織的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又稱為基質(zhì)干細(xì)胞，是屬于成體干細(xì)胞的一種，最早從骨髓中分離而來。MSC是由早期中胚層發(fā)育而來的非造血成體干細(xì)胞，該細(xì)胞在體外可以貼壁生長，并呈現(xiàn)梭狀。胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形，1-3個核仁。在適當(dāng)?shù)臈l件下可以大量擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)祖細(xì)胞，進(jìn)而分化成包括三個胚層的各種組織細(xì)胞，如脂肪、骨、軟骨、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。MSC具

4、有低的免疫原性、能向腫瘤遷移、具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持等功能，而且易于外源基因?qū)氡磉_(dá)，是基因治療中重要的載體細(xì)胞。此外，一些研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，MSC具有類似免疫抑制劑作用，可抑制T淋巴細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，并同時抑制T細(xì)胞的異基因增殖反應(yīng)。所以，MSC在治療組織缺損、器官退行性疾病、腫瘤及免疫疾病具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。近年來MSC已逐步成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)（張慧娟等，2014）。 目前所報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取骨髓需要經(jīng)歷一個比較痛苦的手術(shù)，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機(jī)會；由于人體骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量極其稀少，

5、每105-106個單個核細(xì)胞中大約只有1個；而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用中受到限制。其他組織中，如動員的外周血、乳牙、臍帶、臍血也存在間充質(zhì)干細(xì)胞，然而，從這些組織中獲得的細(xì)胞數(shù)量較為有限。以上因素，都限制了間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和臨床中的運(yùn)用。目前胎盤或臍帶屬于臨床廢棄物，容易獲得，并且無污染，取材研究和應(yīng)用基本無倫理學(xué)爭議，研究表明胎盤或臍帶含有豐富的MSC。有研究表明PMSC比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更容易分離培養(yǎng)，細(xì)胞活性更好，還可誘導(dǎo)分化成脂肪，成骨等多種細(xì)胞。并且這些胎盤源的間充質(zhì)干細(xì)胞（placenta-deriv

6、ed mesenchymal stem cells，PMSCs）具有極低的免疫原性，大多數(shù)患者對于胎盤或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有天然的免疫耐受，因此，人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在研究相關(guān)疾病的動物模型中，即便是人-動物模型間的異種間移植，由于存在天然的免疫耐受，對實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果影響甚小，這對于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。目前MSC主要臨床應(yīng)用于抑制移植物抗宿主反應(yīng)。動物模型研究結(jié)果表明PMSC對子宮內(nèi)膜損傷（劉芳，2013），大鼠肝組織損傷（宮黎明等，2011），APP+轉(zhuǎn)基因鼠阿爾茨海默?。ü鶃喣械龋?009）均有療效，也可以用于構(gòu)建組織工程皮膚（徐彪等，2013）。所以，綜合充分利用胎盤和臍

7、帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞新來源，優(yōu)化分離純化以及傳代培養(yǎng)條件，加快細(xì)胞繁殖速度，降低培養(yǎng)成本以高效率獲取大量的PMSC對于的各種疾病實(shí)驗(yàn)研究及醫(yī)院各個科室的臨床應(yīng)用，都具有重要意義。1分離制備PMSC組織的選取胎盤起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層，人足月娩出的胎盤由羊膜層、絨毛膜層和蛻膜層組成。從臍帶血（于海微等，2009；管英華等，2011），臍帶（徐燕等，2009；韓之波等，2012；管英華等，2011；李艷琪等，2014；趙琳等，2016），整個胎盤（陸琰等，2009；沙文瓊等，2010；劉洋等，2015；賴平等，2016），胎盤的羊膜層（宮黎明等，2011；徐彪等，2013；張慧娟等，2014；叢

8、姍等，2015），絨毛膜層（洪艷等，2014；韓之波等，2012）和蛻膜層（韓之波等，2013）分離培養(yǎng)MSC均有報(bào)道。目前大多數(shù)研究者取胎盤小葉（包括絨毛層和絨毛滋養(yǎng)層）進(jìn)行分離（洪艷等，2014）。胎盤的細(xì)胞成分較復(fù)雜，既有滋養(yǎng)細(xì)胞，也有間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和Hofbauer細(xì)胞（沙文瓊等，2010）。由胎盤組織分離制備MSC時不可避免會有其它細(xì)胞的干擾（苗宗寧等，2009），其中以數(shù)量最多的血細(xì)胞干擾為主。分離MSC選取組織時需要考慮哪個部位的組織可能含有最多的MSC，并且盡可能降低其它種類細(xì)胞的干擾，以獲得純度高，活力強(qiáng)的MSC。對于人臍帶血來源的MSC（human umbilica

9、l cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否穩(wěn)定傳代擴(kuò)增，曾有一定爭議，后來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)臍帶血中存在MSC，并表明臍帶血來源MSC與骨髓來源MSC具有相同的生物學(xué)特性及功能特征（于海微等，2009）。但是臍帶血中也存在多能成體干/祖細(xì)胞，分離間充質(zhì)干細(xì)胞的過程以丟失造血干細(xì)胞為代價，而且個體差異大（徐燕等，2009）。臍帶包括一條靜脈和兩條動脈，周圍是Whartons Jelly，外層由羊膜來源的上皮包裹，從發(fā)育角度來說，臍帶是干細(xì)胞形成及所經(jīng)通路（管英華等，2011）。不同研究機(jī)構(gòu)均從人臍帶組織中分離到MSC（human umbilical cord MSC, hUC

10、-MSC）。已有研究表明人臍帶的結(jié)締組織是間充質(zhì)干細(xì)胞豐富的組織來源（徐燕等，2009），故制備hUC-MSC一般剝離臍帶動靜脈和外層上皮。管英華等（2011）比較了臍血和臍帶兩種來源的MSC原代培養(yǎng)過程，結(jié)果表明臍血中細(xì)胞成分復(fù)雜，原代培養(yǎng)多見成纖維樣和大圓形破骨樣兩種形態(tài)的貼壁細(xì)胞，隨著換液和傳代破骨樣細(xì)胞逐漸減少和消失，剩下形態(tài)較為單一的呈漩渦樣的細(xì)胞集落; 臍帶來源培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞不會隨換液丟失，且細(xì)胞形態(tài)以成纖維樣細(xì)胞為主，種類單一。hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培養(yǎng)的時間短，培養(yǎng)成功率明顯增高。羊膜是胎膜最內(nèi)層，胎盤包裹胎兒面的一層薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成，在

11、胎盤面與絨毛膜相貼，由人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞組成，其表面沒有神經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織。人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞來源于原條期的胚胎中胚層，而人羊膜上皮細(xì)胞來源于胚胎外胚層。越來越多的研究已證實(shí)，人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞都具有干細(xì)胞的特征。其中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（human amnion-derived mesenchymal cells, hAD-MSCs）不但表達(dá)成體干細(xì)胞特性中的間充質(zhì)干細(xì)胞特性也表達(dá)部分胚胎干細(xì)胞特性，相關(guān)研究表明人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞全能型標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子基因OCT4、SOX2和NANOG（張惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、

12、Oct-4等胚性標(biāo)志（宮黎明等，2011），近年來發(fā)現(xiàn)hAD-MSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，可分化成來自3個胚層的所有細(xì)胞（宮黎明等，2011）。有研究比較人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量在各時間點(diǎn)均明顯高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（徐彪等，2013）。洪艷等（2014）分別從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層分離并培養(yǎng)MSC，發(fā)現(xiàn)在分離過程中，從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層得到的細(xì)胞量都很多，絨毛滋養(yǎng)層的細(xì)胞量甚至?xí)浇q毛膜的細(xì)胞量。但是在接種后培養(yǎng)時，由于絨毛滋養(yǎng)層血細(xì)胞較多，血細(xì)胞難以處理，影響間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁，無法貼壁就無法繼續(xù)生長，由此導(dǎo)致后期細(xì)胞生長慢，收獲細(xì)

13、胞少。韓之波等（2013）的研究表明來自母體的底蛻膜組織也可以分離制備MSC。苗宗寧等（2009）將胎盤組織分為3 組，分別是中央帶組即臍帶附著處，邊緣帶組即距臍帶附著點(diǎn)最遠(yuǎn)處和中間帶組即兩者之間中點(diǎn)處。分別全層連續(xù)切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分別做免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞表達(dá)及分布分布區(qū)域，結(jié)果表明中間層的陽性細(xì)胞數(shù)量與表達(dá)水平強(qiáng)于絨毛板層和底板層；同為中間層，中央帶較中間帶及邊緣帶表達(dá)更強(qiáng)。由此推測，在接近血管豐富的臍帶附著部的胎盤中間層取材易于獲得較豐富的PMSCs。2臍帶，胎盤MSC的分離與純化胎盤組織的獲取，存儲與清洗母血檢測 HBV、HCV

14、、HIV、CMV、EBV、梅毒均為陰性。產(chǎn)婦無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病。臨床足月正常剖宮產(chǎn)后胎盤，大小及質(zhì)量在正常范圍內(nèi)，胎盤臍帶附著點(diǎn)均在胎盤中央稍偏位。經(jīng)與產(chǎn)婦及其家屬簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。在產(chǎn)房無菌條件下獲取臍帶，胎盤。文獻(xiàn)報(bào)道中取組織后有如下處理方法：立即浸入胎盤儲存袋（加拿大LABPLAS公司的無菌采樣袋，含99%低糖DMEM，1%雙抗即青鏈霉素的組織保護(hù)液），在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。臍帶靜置于冰箱12h， 觀察保存臍帶的PBS液， 若無渾濁說明無感染。臍帶采集后在6 h內(nèi)進(jìn)行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分。無菌采集健康足月剖宮產(chǎn)羊膜，冰盒中2 h

15、內(nèi)運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入試驗(yàn)流程。無菌采集健康足月剖宮產(chǎn)胎盤，并立即進(jìn)入分離提取程序。文獻(xiàn)報(bào)道中組織塊的用量及獲得：胎盤組織約 50 g35個胎盤小葉剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL眼科手術(shù)剪將組織剪碎（細(xì)碎小塊；1mm3大??；呈肉糜狀，以能用吸管吸取為標(biāo)準(zhǔn)；約3mm；5 mm3大小的碎塊）組織絞碎分離機(jī)（近似肉糜）文獻(xiàn)中的組織浸泡液/清洗液：# 生理鹽水# D-Hanks平衡液# 磷酸緩沖液（PBS）# 杜氏磷酸緩沖液（D-PBS）# 含肝素的PBS# 含有雙抗生素的PBS (0.1%的青鏈霉素，1%的青鏈霉素, 100 U/mL青霉素, 100 µg/mL鏈霉素)# 含有青霉素和鏈霉素

16、的無血清 DMEM /F12 培養(yǎng)基2-2 臍帶，胎盤MSC的分離及純化方法已報(bào)道臍帶，胎盤MSC的分離方法有組織塊貼壁法，酶消化法以及整體灌注法。組織貼壁培養(yǎng)法得到的細(xì)胞純度較高，對細(xì)胞傷害小，操作相對簡單，將組織塊剪碎、貼壁后加培養(yǎng)基培養(yǎng)即可，但原代培養(yǎng)所需周期較長、獲得細(xì)胞數(shù)量相對有限。李艷琪等（2014）在首次組織塊貼壁培養(yǎng)獲得MSC后，將組織塊轉(zhuǎn)移到新的培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，兩三天后仍可見到貼壁細(xì)胞，第5 天可形成明顯的細(xì)胞克隆。這種改進(jìn)的組織塊二次貼壁方法可在較短時間內(nèi)獲得大量原代細(xì)胞。 酶消化法可直接將消化得到原代細(xì)胞，但是獲得的細(xì)胞純度略低、狀態(tài)不均一，由于消化時間不易掌握，消化時間

17、過短不能得到足量細(xì)胞，消化時間過長會對細(xì)胞造成傷害，損傷細(xì)胞膜成分，導(dǎo)致無法貼壁生長，影響細(xì)胞的成活率和增殖能力，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，給后續(xù)培養(yǎng)帶來困難（李艷琪等，2014）；對于某些組織如臍帶Whartons膠經(jīng)酶消化后的膠體黏稠，不易離心。徐燕等2009比較，植塊法培養(yǎng) 610 d 可見成纖維樣細(xì)胞從植塊邊緣爬出，在原代細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞產(chǎn)率、傳代時間及擴(kuò)增倍數(shù)上明顯好于膠原酶消化法（1 g/L膠原酶3.05.0 mL， 置于含雙抗的PBS中，37 孵育0.5 h）比較存在差異；而膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法（1 g/L膠原酶于37 孵育16 h，以PBS洗滌后加入25 g/L胰酶于37 孵育0.5

18、 h）接種后未見明顯貼壁細(xì)胞。常用的酶包括胰蛋白酶，膠原蛋白酶，和。胰蛋白酶消化能力強(qiáng)，型膠原酶消化能力相對較弱，但對細(xì)胞膜損害較小。很多研究者對酶的濃度，消化時間，消化方式，多種消化酶聯(lián)合消化做了大量探索。尋求既能充分的分離細(xì)胞，又能避免細(xì)胞的損傷的方法（賴平等，2016）組織經(jīng)酶消化后需要用篩網(wǎng)/多層紗布過濾（100目，200目，300目，100 µm的濾器），除去未被消化的大組織塊。濾出的細(xì)胞成分復(fù)雜，常含有大量的血細(xì)胞?，F(xiàn)階段用于分離純化方法間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有以下幾種：一般離心、密度梯度離心法、貼壁篩選法、紅細(xì)胞裂解液法、淋巴細(xì)胞分離液( Ficoll) 、羥乙基淀粉沉

19、淀、流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法。因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異的表面標(biāo)志，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法會損失大量細(xì)胞，且成本高。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，使用紅細(xì)胞裂解液對于間充質(zhì)干細(xì)胞的損傷大，使用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離的可重復(fù)性較差，技術(shù)不穩(wěn)定（洪艷等，2014）。文獻(xiàn)中報(bào)道的消化酶的濃度，消化時間，次數(shù)及組合消化：機(jī)械剝離胎盤羊膜組織，PBS反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細(xì)碎小塊，0.25%胰酶37 消化10 min，過100目篩網(wǎng)過濾獲得細(xì)胞液。經(jīng)胰酶消化后的組織塊，繼續(xù)經(jīng)0.1%型膠原酶37消化15 min。含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的L-DMEM終止反應(yīng)后，過100目篩網(wǎng)獲得細(xì)胞液。兩次收集的

20、細(xì)胞液1 000 r/min離心10 min，棄上清液（徐彪等，2013）。將胎盤組織碎片置于200 mL無菌離心管中，聯(lián)合應(yīng)用0.25%胰蛋白酶和0.1%型膠原酶消化胎盤組織碎片。37 搖床消化30 min，去除組織留取消化液，經(jīng)1 500 r/min離心5 min，收集離心獲得的細(xì)胞沉淀。將離心后收集到的細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的-MEM培養(yǎng)基（劉洋等，2015）。剪碎羊膜，加入0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na消化液，37，200 r/min旋轉(zhuǎn)消化10 min，棄上清，再加入消化液， 37 旋轉(zhuǎn)消化30 min，棄上清，按同樣的程序再重復(fù)消化2次。經(jīng)胰酶

21、消化后剩余的組織用D-PBS液沖洗，加入0.75 g/L 型膠原酶-0.075 g/L DNase I消化液， 37 、200 r/min旋轉(zhuǎn)消化2.03.0 h，直至組織完全消化，經(jīng)300目 不銹鋼網(wǎng)過濾， 收集細(xì)胞濾液，1 500 r/min，離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于LG-DMEM培養(yǎng)基（宮黎明等，2011）。張慧娟等（2014）無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜剪成碎片，分別通過7 種消化方法，發(fā)現(xiàn)用 0.05 g/L 的胰蛋白酶連續(xù)消化 2 次每次消化 30 min，然后用 1 g/L 的膠原酶消化 60 min 是最合適的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)條件。0.05

22、 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L膠原酶消化60 min0.75 g/L膠原酶直接消化120 min0.05 g/L胰蛋白酶與0.75 g/L膠原酶同時消化60 min0.05 g/L的胰酶消化30 min后，再加0.75 g/L膠原酶消化30 min0.05 g/L的胰蛋白酶連續(xù)兩次消化30 min后，再加入0.75 g/L的型膠原酶消化60 min0.05 g/L的胰酶連續(xù)2次消化40 min后，再加0.75 g/L膠原酶消化60 min0.05 g/L的胰酶連續(xù)2次消化30 min后，再加1 g/L的型膠原酶消化60 min取前處理的樣品在37 下，用0.05 g/

23、L的胰蛋白酶連續(xù)2次消化30 min，用含體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，篩中組織經(jīng)PBS沖洗后裝入培養(yǎng)皿中，然后加入1 g/L的型膠原酶，在37 下消化60 min，之后用含體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，濾液在1 500 r/min的離心機(jī)中離心5 min，去上清液，換DMEM/F12培養(yǎng)基混懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿中（張慧娟等，2014）。用眼科手術(shù)剪將羊膜剪碎約1 mm×1 mm組織塊，加入等體積的0.05% trypsin-EDTA， 37 水浴震蕩消化30 min 后加入含血清的培養(yǎng)液， 離心

24、去上清， 如此反復(fù)消化兩次， 再用PBS洗23次， 盡可能去除上皮細(xì)胞。用細(xì)胞篩過濾后剩余的羊膜組織加入不同濃度型膠原酶、和2.00 mg/mL)，37 水浴震蕩消化60 min， 加入含血清的培養(yǎng)液終止消化， 混勻后用200 目細(xì)胞篩過濾， 再將濾液1 500 r/min 離心 5 min 收集細(xì)胞（叢珊等，2015）。按體積比約 16 加入型膠原酶( 0.1% ) ， 置于 37 恒溫水浴箱中消化30 min， 間隔 5 min 適當(dāng)混勻組織與消化液。之后紗布過濾，上淋巴細(xì)胞分離液（賴平等，2016）。使用、含25 mmol/LHEPES的D-Hanks作為消化緩沖液，加入終濃度為2.5

25、g/L胰酶和300 U/mL DNase組成消化液，沖洗后的胎盤組織分階段消化，每個階段在恒溫氣浴搖床中37 、180 r/min消化20 min（沙文瓊等，2010）。用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm3大小的碎塊型膠原酶10 mL （酶消化終濃度0.1%），置于搖床內(nèi)37 、250 r/min振蕩，約90 min后終止消化（洪艷等，2014）。文獻(xiàn)中報(bào)道的純化方法：將細(xì)胞懸液緩慢加至已配好的淋巴細(xì)胞分離液中。1 500 r · min-1， 4離心20 min，離心后可見“白膜層”，小心吸取該區(qū)域細(xì)胞，并加入 4 倍于該體積的 PBS 稀釋，1000 r·min

26、-1，常溫下離心 5 min。重復(fù)一次，棄上清（賴平等，2016）Percoll梯度密度分離： 在50 mL離心管中逐層鋪入7個密度的Percoll分離液，每個密度5 mL。再緩緩加入5 mL細(xì)胞懸液，使用水平離心機(jī)室溫下1 200 g離心20 min。 小心棄除離心管20 mL刻度以上的液體，收集12.520.0 mL刻度的細(xì)胞層(滋養(yǎng)細(xì)胞)和12.57.5 mL刻度(胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞)的液體，分別放入不同離心管里，用D-Hanks液稀釋5倍后，室溫下1 000 g離心15 min（沙文瓊等，2010）。陸琰等（2009）比較了四種胎盤組織分離純化從MSC的方法：膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、

27、膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+ 淋巴細(xì)胞分層液分離組、膠原酶+ 氯化銨裂解紅細(xì)胞組。與膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組比較，其余3 組獲取的細(xì)胞數(shù)均明顯減少（，）。在其他條件相同的情況下，膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組培養(yǎng)成功率為100%，其余3 組分別為80%，80%，20%。剪碎的胎盤組織與1 g/L膠原酶中， 37 消化45 min。然后過細(xì)胞篩網(wǎng)，收集各組細(xì)胞懸液，分別于室溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清。用PBS重懸細(xì)胞，加入60 g/L羥乙基淀粉（體積比為4:1）充分混勻，室溫靜置45 min，小心吸取上清，1 000 r/min離心5 min，棄上清， PBS洗滌2次

28、。以完全培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。按×109 L-1密度接種于T-25塑料培養(yǎng)瓶中（陸琰等，2009）。3 原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)3-1培養(yǎng)基從文獻(xiàn)報(bào)道可以看出，需要10%胎牛血清，低糖的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，100 U/mL青霉素+100 µg/mL鏈霉素，此外可選的有5 g/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子，10 g/L表皮生長因子，10 µg/L血小板衍生生長因子。文獻(xiàn)中報(bào)道的培養(yǎng)基：# 10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)基# 5 g/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子和10 g/L表皮生長因子的L-DMEM完全培養(yǎng)基#10%胎牛血清的-MEM培

29、養(yǎng)基# LG-DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55 mol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素)# DMEM/ F12+10% FBS+10 ng/mL bFGF+100 U/mL青霉素+100 µg/mL鏈霉素# 10%的胎牛血清的低糖DMEM# 含體積分?jǐn)?shù)為胎牛血清的DMEM/F12 # 含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基# 完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清、40% MCDB201、10

30、µg/L血小板衍生生長因子、10 µg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 µg/L表皮生長因子的DF12培養(yǎng)基)# DMEM+體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清+1% enicillin-Streptomycin+5 µg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子3-2培養(yǎng)密度原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種密度可能對成功培養(yǎng)有影響，于海微等（2009）試驗(yàn)了5×108 L-1、 1×109 L-1、 5×109 L-1、 1×1010 L-1的接種密度，發(fā)現(xiàn)以5×108 L-1密度接種時細(xì)胞一直無法傳代，以5×109 L-1的密度接種

31、時細(xì)胞貼壁時間、出現(xiàn)伸展時間及原代培養(yǎng)時間均顯著短于其他接種密度。文獻(xiàn)中報(bào)道的接種密度：×108 L-1×109 L-11×106/cm21×108 L-13×106/皿， 接種若干Ø100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿3-3培養(yǎng)條件37 、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3-4換液細(xì)胞生長消耗培養(yǎng)基的養(yǎng)分，同時產(chǎn)生代謝廢物，限制細(xì)胞生長，所以需要及時換液，但是換液太頻繁會造成浪費(fèi)，此外可以胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長，可以利用此特性在換液時與其他雜細(xì)胞進(jìn)一步分離，但在培養(yǎng)早期，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁不牢固，第一次換液時間過早將損失獲取的胎

32、盤間充質(zhì)干細(xì)胞。故需要通過實(shí)時觀察并根據(jù)實(shí)際情況探究合適的原代培養(yǎng)的第一次換液時間和后續(xù)培養(yǎng)的換液頻率。文獻(xiàn)中報(bào)道的首次換液時間有2d，3d，7d全量或半量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每三四天換液1次。文獻(xiàn)中報(bào)道的換液時間和方式：每3 d全量換液1次培養(yǎng)48 h后半量換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每三四天換液1次7 d后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，每三四天換液1次3 d后半量換液，1周后再次換液，此后每隔3 d換液1次57 d后全量換液，以后每3 d換液3d全量換液，以后每周換液2次3d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)2d后全量換液2d換液，以后每3 d換液1次3-5 傳代培養(yǎng)待原代培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁連生面積達(dá)7

33、0%90%后（貼壁細(xì)胞生長至 70% -90%融合時），用胰酶消化（2.5 g/L胰酶或0.25%胰酶或1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸），按1：2或1：3或14的比例傳代，或以（）×103/cm2密度接種傳代培養(yǎng)。（消化時間？去除培養(yǎng)基后加酶消化？胰蛋白酶用PBS還是培養(yǎng)基溶解？每個培養(yǎng)瓶用多少量的酶消化？）3-6細(xì)胞形態(tài)與生長速度3-7 MSC的凍存與復(fù)蘇：凍存液中DMSO的濃度可能對細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，叢珊等（2015）對此進(jìn)行過實(shí)驗(yàn)，將 3 組不同凍存液凍存的 hAMSCs 凍存 48 h后進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。冷凍保護(hù)液一： 5% 二甲基亞砜(dimethylsulf

34、oxide, DMSO)50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+45% DMEM/F12。冷凍保護(hù)液二：10% DMSO50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+40% DMEM/F12。冷凍保護(hù)液三：20% DMSO50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+30% DMEM/F12。結(jié)果顯示， DMSO濃度為5%時，細(xì)胞在 2 h后開始貼壁， 4 h時幾乎全部細(xì)胞貼壁；DMSO濃度為10%和20%的兩組活力較差，細(xì)胞仍是圓形，且無貼壁現(xiàn)象。復(fù)蘇培養(yǎng)：解凍時從液氮罐中取出冷凍管，將其放入37 水浴鍋迅速融化約12 min（或放入37、5% CO2、 飽和濕度的培養(yǎng)箱中使其融化）。將凍存管中液體加入有培養(yǎng)基的離心管中，1500 r/min 離心5 mi

35、n，去掉上清，接種到新的培養(yǎng)基皿中，于37、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，第2天更換培養(yǎng)液（叢珊等，2015）。4細(xì)胞表面抗原檢測由于培養(yǎng)細(xì)胞的形狀不能作為鑒別細(xì)胞類型的主要特征標(biāo)志，因此，通常都采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面抗原分子進(jìn)行鑒定。不同的研究人員觀察到 MSC 表達(dá)不同的表面標(biāo)記，造成這種情況的原因有很多， 包括MSC的來源、 供者的年齡、提取的方法和擴(kuò)增的條件等都會影響MSC 的表面標(biāo)記（韓之波等，2012）。國際上對于 MSC 的鑒定仍具爭議，目前認(rèn)可度較高的 ISCT（國際細(xì)胞治療協(xié)會）間充質(zhì)干細(xì)胞委員會制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)。流式細(xì)胞儀分析鑒定MSC應(yīng)細(xì)胞表達(dá)黏附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記

36、 CD73、 CD90、 CD105， 整合蛋白家族CD29，以及透明質(zhì)酸鹽受體 CD44，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記 CD11b、 CD34、 CD45 和 HLA-DR。5生長曲線6細(xì)胞周期7分化潛能參考文獻(xiàn)郭亞男, 關(guān)方霞, 李國棟, 李祥生, 楊波, 杜英, 胡祥, 胡煒, 焦紅亮, 李遠(yuǎn). 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療阿爾茨海默病APP+轉(zhuǎn)基因鼠的有效性及安全性評估J.中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(10):1811-1818.韓之波, 王有為, 王濤, 池穎, 楊舟鑫, 及月茹, 孟磊, 楊萍, 韓忠朝. 人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其生物學(xué)特性研究J. 中國實(shí)驗(yàn)血液

37、學(xué)雜志, 2013, 21（3）：754-759.韓之波, 楊舟鑫, 池穎, 王有為, 王濤, 及月茹, 楊萍, 孟磊, 韓忠朝. 人臍帶胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較研究J. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2012, 20（3）：692-696.洪艷, 霍思維, 陸瑤, 章毅. 人胎盤不同組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性J. 中國組織工程研究, 2014, 18(19):3082-3087.李艷琪, 王洪一, 姚堯, 劉晶晶, 徐瀟, 張宇, 劉洋, 吳祖澤, 靳繼德. 人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)J. 中國組織工程研究, 2014, 18(10):1609-1614.劉芳，骨

38、髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素治療宮腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究D. 南方醫(yī)科大學(xué), 2013.劉洋, 李艷琪, 王洪一, 吳曉冰, 荊永光, 徐瀟, 姚堯, 張宇, 吳祖澤, 靳繼德. 胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的新方法J. 中國組織工程研究, 2015, 19(10):1608-1612.陸琰, 陳麗, 張洹. 人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 4 種消化分離方法的效果比較J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(6):10147-1020.苗宗寧, 徐秋嵐, 呂國忠, 王玲, 張學(xué)光. 間充質(zhì)干細(xì)胞在人胎盤組織中的染色定位及整體灌注分離培養(yǎng)J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(36):7

39、133-7137. 賴平, 陳懿建, 羅耀玲, 張敏鴻, 楊建瓊, 邱悅?cè)? 人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定J. 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，36(2)：183-186.沙文瓊, 王自能, 王冬菊. 人胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(10):1833-1837. 徐彪, 李芳, 孫青, 許云云, 趙娟, 梁含思, 馬樹立, 陳永珍. 羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚J. 中國組織工程研究, 2013, 17(41):7213-7220.徐燕, 李長虹, 孟恒星, 郝牧, 邱錄貴. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培

40、養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(32):6289-6294.于海微, 李佩玲, 莊如錦, 李會明. 人臍帶血和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、分化及生物學(xué)特性比較J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(6):1021-1024.附件1不同實(shí)驗(yàn)室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分離MSC的方法臍帶血分娩后穿刺臍靜脈抽取50 mL 臍帶血液，4冰箱保存，12 h 內(nèi)分離，用Hanks 平衡液稀釋臍帶血，稀釋血液緩慢疊加于Ficoll上，離心，吸出乳白色云霧狀單個核細(xì)胞，洗滌離心2 次，將獲得的單個核細(xì)胞分別以5×108/L

41、密度種植入25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基吹打，混勻。置于37、含體積分?jǐn)?shù)為0.05 的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，57 d后全量換液，以后每3 d換液，并逐日觀察細(xì)胞貼壁延伸時間、原代培養(yǎng)時間及細(xì)胞生長情況（于海微等，2009）。距胎兒5-7cm的臍帶處進(jìn)行雙結(jié)扎，剪斷臍帶，消毒母側(cè)臍帶斷端，穿刺臍靜脈抽取臍血40-120mL，加肝素抗凝，4h內(nèi)分離（管英華等，2011）。淋巴細(xì)胞分離液法: 將臍帶血與無血清DMEM/F12培養(yǎng)基1:1體積比混合，緩慢加至含有等體積的Ficoll ( 密度為1.077g/L ) 分離液上，1800r/min離心20min，取中間白膜層，經(jīng)培養(yǎng)基以100

42、0r/min離心10min洗滌2次，細(xì)胞接種密度為5*107接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37，5%的CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)到80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等，2011）。羥乙基淀粉沉降與淋巴細(xì)胞分離液兩步分離法: 將臍帶血與6%羥乙基淀粉按4:1的體積比混合，常溫下靜置30-45min，取上清液，1000r/min離心10min，棄去上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞將其緩慢加至含有等體積的Ficoll ( 密度1.077g/L )分離液上（管英華等，2011）。臍帶將無菌條件下取得的足月妊娠分娩胎兒臍帶，用PBS洗3 次，去掉殘留的血細(xì)胞。把臍帶剪切成2.0 cm左右的片段并

43、剔除血管（1 條臍靜脈，2條臍動脈），取出其中的凝膠狀組織，將其剪成大小約1 mm3的組織塊，然后置于培養(yǎng)瓶中。6 h后，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置在37、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d 后半量換液，1 周后再次換液，此后每隔3 d 換液1 次。觀察貼壁組織周圍的細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合度時，用胰酶消化傳代，并將組織轉(zhuǎn)移到一個新的培養(yǎng)瓶中，按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)，獲得第二次組織塊貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞（李艷琪等，2014）。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法: 在無菌條件下取出的臍帶組織，用含有青霉素和鏈霉素的無血清

44、DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌去除殘存血，去除外包膜與臍動靜脈血管，將剩余組織剪碎至1mm3大小，轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37、5%CO2飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中直接貼壁培養(yǎng)。5-7d首次換液，貼壁細(xì)胞融合接近80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等，2011）。酶消化培養(yǎng)法: 將以上方法處理的去除外包膜與動靜脈后的臍帶組織，經(jīng)0.1%膠原酶和0.25%胰酶消化，無血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌，以1.0*106/cm2接種到T2瓶（管英華等，2011）。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：臍帶采集后在6 h內(nèi)進(jìn)行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分，用含雙抗的PBS緩沖液充分沖洗臍帶外周以及臍靜脈內(nèi)腔，

45、用以下3 種方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，3 種方法均于培養(yǎng)的第14天計(jì)數(shù)集落數(shù)，超過50個細(xì)胞計(jì)為集落。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%80% 融合時，以含1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.55.0)×103/cm2密度接種傳代培養(yǎng)，計(jì)為第1 代(P1) 細(xì)胞。植塊法：沿臍靜脈內(nèi)腔縱向剪開血管，剝離臍靜脈內(nèi)膜，將剩余組織切成3.05.0 mm3小塊，貼于預(yù)先用1 mL完全培養(yǎng)基( 含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清、40% MCDB201 、10 µg/L血小板衍生生長因子、10 µg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 µg/L表皮生長因子的DF12培養(yǎng)

46、基) 潤濕的T25 培養(yǎng)瓶底壁，底壁朝上，置于37、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱中，過夜后翻轉(zhuǎn)。每24 h 加入1 mL上述培養(yǎng)基，72 h全量換液，以后每周換液2 次。觀察貼塊周圍貼壁細(xì)胞爬出情況。2 周后去貼塊。膠原酶消化法：夾閉臍靜脈一端，灌入1 g/L膠原酶3.05.0 mL ，置于含雙抗的PBS中，37 孵育0.5 h，收集酶液，并用PBS 反復(fù)灌洗，收集灌洗液，與酶液同時離心洗滌棄上清后，以完全培養(yǎng)基重懸，1×106/cm2接種于T25 培養(yǎng)瓶中，3 d后全量換液，以后每周換液2 次。觀察貼壁細(xì)胞生長。膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法：將臍帶組織切成1.02.0 mm3小塊，

47、直接加入1 g/L膠原酶于37孵育16 h ，以PBS 洗滌后加入25 g/L 胰酶于37孵育0.5 h；加入含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的培養(yǎng)基中和胰酶，以100 µm的濾器過濾細(xì)胞，收集濾液；PBS 洗滌棄上清后，以完全培養(yǎng)基重懸，按1×106/cm2接種于T25 培養(yǎng)瓶中，3 d后全量換液，以后每周換液2次。觀察貼壁細(xì)胞生長（徐燕等，2009）。羊膜羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：選取剖宮產(chǎn)足月胎兒的胎盤，機(jī)械剝離胎盤羊膜組織，PBS反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細(xì)碎小塊，0.25%胰酶37 消化10 min，100目篩網(wǎng)過濾。PBS充分清洗后收集經(jīng)胰酶消化后的組織塊，繼續(xù)經(jīng)0.

48、1%型膠原酶37消化15 min。含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的L-DMEM終止反應(yīng)后反復(fù)吹打，過100目篩網(wǎng)獲得細(xì)胞液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。收集羊膜來源的細(xì)胞按以下培養(yǎng)條件進(jìn)行體外培養(yǎng)：添加有5 g/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子和10 g/L表皮生長因子的L-DMEM完全培養(yǎng)基， 置于37 、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 d全量換液1次，12-14 d后細(xì)胞按常規(guī)方法傳代（徐彪等，2013）。hAD-MSCs的分離和培養(yǎng)： 無菌條件下，采用機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-PBS液反復(fù)沖洗以清除殘留血跡。剪碎羊膜，加入0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02%

49、 EDTA-2Na消化液，37 旋轉(zhuǎn)(200 r/min)消化10 min，棄上清，再加入消化液， 37 旋轉(zhuǎn)消化30 min，棄上清，按同樣的程序再重復(fù)消化2次。經(jīng)胰酶消化后剩余的組織用D-PBS液沖洗，加入0.75 g/L 型膠原酶-0.075 g/L DNase I消化液， 37 、200 r/min消化2.03.0 h，直至組織完全消化，經(jīng) 300 目 不 銹 鋼 網(wǎng) 過 濾 ， 收 集 細(xì) 胞 濾 液 ，1 500 r/min，離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于LG-DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 10 g/L非必需氨基酸、 5

50、5 mol/L 2-巰基乙醇、 1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素) 2%錐蟲藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，以2.2×108 L-1濃度接種于培養(yǎng)瓶，于37 、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境下培養(yǎng)， 3 d更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞連生面積達(dá)80%90%后行傳代培養(yǎng)（宮黎明等，2011）。絨毛膜在產(chǎn)房無菌條件下獲取胎盤，立即浸入胎盤儲存袋含99%低糖DMEM，1%抗生素( 雙抗即青鏈霉素) 的組織保護(hù)液 ，在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室（洪艷等，2014）。剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL，置于直徑10 cm 培養(yǎng)皿，平皿中裝有2/3體積的含有抗生素的(1% 的青

51、鏈霉素)PBS。用手術(shù)剪剪開大的組織塊，一邊將大的組織塊剪成小塊，一邊用手術(shù)鑷夾持進(jìn)行漂洗，避免溢出，如此重復(fù)3 遍，至漂洗液清亮，棄漂洗液。轉(zhuǎn)移絨毛膜層組織至50 mL 體積的離心管中，做好標(biāo)記，用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm3大小的碎塊。向各離心管中加入型膠原酶消化液，各加入型膠原酶10 mL ( 酶消化終濃度0.1%)，置于搖床內(nèi)37、250 r/min振蕩，約90 min 后終止消化。加PBS 至50 mL ，300r/min，5 min；收集上清，20 mL一管，加PBS 至50 mL ，2 000 r/min ，10 min棄上清。用10 mL PBS, 重懸細(xì)胞混勻并

52、一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min。棄上清，加入10 mL完全培養(yǎng)基，取20L細(xì)胞懸液加入80L的紅細(xì)胞裂解液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照計(jì)數(shù)結(jié)果3×106/皿，接種若干Ø100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 體積分?jǐn)?shù)5%CO2 培養(yǎng)。48 h 換液，以后每3 d換液1次，直至細(xì)胞可以進(jìn)行傳代（洪艷等，2014）。細(xì)胞生長至80%時，每皿加入1.0-2.0 mL的0. 25%胰酶( 含EDTA) 進(jìn)行消化傳代。傳代時，消化三至四分鐘，加含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并補(bǔ)加PBS至50 mL ，1 200 r/min ，離心5

53、 min，棄含消化液的上清，加入細(xì)胞完全培養(yǎng)液吹打混勻，計(jì)數(shù)，按照約1.5×106/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿(100 mm)中，置于37，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（洪艷等，2014）。蛻膜層將胎盤組織用無菌鹽水沖洗后，小心分離胎盤底蛻膜組織用無菌組織剪剪成小組織塊，使用膠原酶和胰酶消化，消化后的混合液體經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DF12培養(yǎng)液于37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合時，胰酶消化細(xì)胞，按1：3傳代培養(yǎng)（韓之波等，2013）。胎盤胎盤標(biāo)本處理：無菌條件下將娩出胎盤剝除羊膜，剪除胎盤母體面2.03.0 mm組織后，剪下35個

54、胎盤小葉，稱質(zhì)量約50 g，浸泡于含肝素的無菌PBS中。將剪下的胎盤小葉用手術(shù)剪剪碎，用生理鹽水反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無色。實(shí)驗(yàn)共采集5例標(biāo)本。組織消化：使用、含25 mmol/L HEPES的D-Hanks作為消化緩沖液，加入終濃度為2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNase組成消化液，每個標(biāo)本需消化液330 mL。沖洗后的胎盤組織分階段消化，每個階段在恒溫氣浴搖床中37 、180 r/min消化20 min。每次消化完畢后，小心將消化上清吸出，用新生牛血清終止反應(yīng)。然后將消化上清液，在25 1 000 g 離心15 min，使從組織中離解出的細(xì)胞充分沉淀，再用L-DMEM重懸。

55、所得細(xì)胞懸液中含有較多消化后的組織碎片，用200目的不銹鋼濾網(wǎng)濾除。過濾后再次離心，調(diào)整細(xì)胞懸液體積到5 mL（沙文瓊等，2010）。人胎盤標(biāo)本的留取：無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤，剝除羊膜，剪取胎兒側(cè)胎盤組織，PBS 反復(fù)沖洗至液體較清亮，用眼科剪剪碎（陸琰等，2009）。分組及干預(yù)：剪碎的胎盤組織稱取質(zhì)量，平均分為4組，每組5 份標(biāo)本：膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+ 淋巴細(xì)胞分層液分離組、膠原酶+ 氯化銨裂解紅細(xì)胞組。將第1 組置于1 g/L膠原酶中，37 消化45 min ；另外3 組置于1 g/L膠原酶中，37 消化45 min。然后過細(xì)胞篩網(wǎng)，收集

56、各組細(xì)胞懸液，分別按以下方法進(jìn)行對應(yīng)分離（陸琰等，2009）。羥乙基淀粉沉淀法：將收集到的膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組細(xì)胞懸液，分別于室溫以1 000 r/min離心5 min ，棄上清。用PBS 重懸細(xì)胞，加入60 g/L 羥乙基淀粉（體積比為4:1）充分混勻，室溫靜置45 min ，小心吸取上清，1 000 r/min 離心5 min ，棄上清，PBS 洗滌2次。以完全培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。按1.5×109L- 1密度接種于T-25 塑料培養(yǎng)瓶中，置于37 、體積分?jǐn)?shù)0.05 的CO2飽和濕度環(huán)境下，用含體積分?jǐn)?shù)為胎牛血清的DMEM/F12進(jìn)行培養(yǎng)。7 d 后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，每三四天換液1 次。細(xì)胞達(dá)80%匯合后，用2.5 g/L胰酶消化，按12的比例傳代，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)（陸琰等，2009）。淋巴細(xì)胞分層液分離法：將膠原酶+ 淋巴