PCR引物流程設(shè)計(jì)詳解

1、本文目的：復(fù)制出 IL-4 基因片段一、查找基因序列1、進(jìn)入 NCBI 主頁(yè)，下拉選框選擇 Nucleotide ，在搜索欄輸入要查找的目的基 因，即 IL-4 ，點(diǎn)擊搜索2 、在搜索結(jié)果選擇靈長(zhǎng)類( Homo sapiens )2、在靈長(zhǎng)類IL-4基因中選擇需要的mRN序列3、查看基因的相關(guān)信息外顯子區(qū)域CDs區(qū)域4、點(diǎn)擊FASTA格式，并將序列保存到文檔二、使用 primer premier 設(shè)計(jì)引物1、建立新文件，將所得的序列復(fù)制進(jìn)輸入框內(nèi)2、點(diǎn)擊搜索按鈕，搜索引物3、設(shè)置引物設(shè)計(jì)參數(shù)（因?yàn)樵谥安檎一蛐蛄械臅r(shí)候獲知，外顯子區(qū)域分別 為：1-200、201-248、249-425、42

2、6-618，又知在引物設(shè)計(jì)時(shí)引物位置最好 跨越一個(gè)內(nèi)含子，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度通常為100-150bp，故設(shè)定上游引物位置為 201-248，下游引物位置為 249-425，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 100-150bp）4、確認(rèn)條件后，顯示搜索結(jié)果4、雙擊選中得分最高的引物查看引物情況（上圖為上游引物情況，下圖為下游引物情況）5、將設(shè)計(jì)的上下游引物復(fù)制出來，保存到文檔中三、使用 oligo 對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)1、建立新文件，將從cnki上獲得的cDNA復(fù)制進(jìn)輸入框，并點(diǎn)擊accept接收2、接收后顯示出該序列的相關(guān)信息3、點(diǎn)擊 edit 按鈕錄入用 primer 設(shè)計(jì)的上游引物， 每一次輸入新數(shù)據(jù)后都需要 點(diǎn)擊 accept 按鈕接收4、同理，錄入下游引物5、分析上下游引物二聚體形成情況6、分析上下游引物發(fā)卡形成情況7、分析上下游引物 GC%8、檢測(cè)上下游引物與PCR莫板其它位置錯(cuò)配情況9、分析PCF整體情況四、引物特異性檢驗(yàn)( primer blast )1、進(jìn)入NCBI主頁(yè)，并選擇blast2、選擇 primer blastget3、在輸入框內(nèi)輸入莫板序列和上下游引物，并設(shè)定對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)，點(diǎn)擊primer 進(jìn)行對(duì)比4、查看 blast 結(jié)果3'端沒有完全互Blast 結(jié)果顯示，