大蒜素對(duì)大鼠肝損傷細(xì)胞因子保護(hù)作用

1、大蒜素對(duì)大鼠肝損傷細(xì)胞因子保護(hù)作用【摘要】目的研究大蒜素對(duì)高脂飲食致大鼠慢性肝損 傷的保護(hù)作用及內(nèi)毒素(lps)刺激引起肝臟枯否細(xì)胞(kcs) 分泌細(xì)胞因子的變化。方法wistar大鼠隨機(jī)分為3組，10 周后腹主動(dòng)脈采血測(cè)定血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、白細(xì) 胞介素(il) 6、il (10)、腫瘤壞死因子(tnf) a水平，取肝組織用于組織病理切片的制備。分離培養(yǎng)kcs，檢測(cè)在 lps刺激下kcs上清液中i l 6、il 10、tnf a的水 平。結(jié)果大鼠發(fā)生慢性肝損傷時(shí)，血清alt及il 6、tnfcl水平明顯升高(p【關(guān)鍵詞】大蒜素 大蒜素作為一種來(lái)源廣泛的含硫化合物，其對(duì)四氯化碳、酒

2、精等引起的肝損傷有明顯保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì) 高脂飲食引起的慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，但機(jī)制尚未 闡明。為此，我們通過(guò)復(fù)制大鼠慢性肝損傷模型，觀察大蒜 素對(duì)肝臟枯否細(xì)胞(k c s)分泌調(diào)節(jié)的影響。1材料與方法1 1材料111實(shí)驗(yàn)動(dòng)物wistar雌性大鼠，體重150170g (山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)。2主要試劑及藥物膽固醇(北京化學(xué)試公司)；大蒜素膠囊(湖北金龍藥業(yè)公司)；iv型膠原酶、胎牛血清培養(yǎng)液(dmem)、percoll 液、內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,lpsfromescher ichiacoliolll：b4）（美國(guó) sigma公司）； 白細(xì)胞介素（il）

3、 6、il 10、腫瘤壞死因子（tnf） a （解 放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放射免疫所）；胎牛血清（杭州四季 青生物工程公司）。12方法121動(dòng)物模型的建立選用雌性wi star大鼠36只，正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，對(duì)照組正常飲食飼養(yǎng)； 模型組給予高脂飲食（普通飼料+5%的膽固醇+15%的玉米油）; 藥物組高脂飲食同時(shí)隔日大蒜素（0 5%, 10ml/kg）灌胃。10周后各組取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8只，1%戊巴比妥納麻醉后腹主動(dòng)脈 采血處死動(dòng)物，取肝左葉置于10%中性福爾馬林固定備做病 理切片。122血清指標(biāo)的檢測(cè)采集的血液經(jīng)肝素抗凝后，3000r/min離心15min，分離血漿，用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶（

4、alt）、il 6、il 10、tnf a水平的檢測(cè)，按試 劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。123枯否細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定采用改進(jìn)seglen膠原酶兩步灌流和percoll密度梯度離心法分離得到 各組大鼠肝臟細(xì)胞，經(jīng)5%c02、37°c恒溫培養(yǎng)箱孵育4h，洗 去未貼壁細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)非特導(dǎo)性酯酶染色，活性和純度分 別達(dá)到95%時(shí)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5x106,接種于48孔培養(yǎng)板中， 每組8孔。124培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的檢測(cè)于培養(yǎng)液中加入100 mg/mllps2滴，4h后收集培養(yǎng)上清，用于il 8、 tnf a、il10 的測(cè)定。1 3統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用土s表示，采用spss120軟件進(jìn)行方差分析(sn

5、k法)。2 結(jié)果2 1慢性肝損傷結(jié)果211肝組織病理學(xué)變化肝組織病理學(xué)顯示，模型組與藥物組大鼠體肝組織均出現(xiàn)不同程度的彌漫性改變， 肝內(nèi)可見(jiàn)到大量的脂肪空泡(肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞/總細(xì)胞 數(shù)1/3)及肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)和匯管區(qū)有大量的以單 核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)明顯肝纖維 化，表明慢性損傷大鼠發(fā)生脂肪肝炎；與模型組相比，藥物 組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。212血清alt的變化對(duì)照組為(615±126)u/l,而模型組與藥物組alt水平明顯升高，分別為(2103 ±1054), (1441±729)u/l,與對(duì)照組比較，p2 13 血清i

6、l 6、il 10,tnf a的變化(表1) 隨著動(dòng)物發(fā)生慢性肝損傷，模型組與藥物組il 6、tnf a 水平明顯升高，il10則明顯下降；藥物組il 6水平明顯低于模型組，而tnf a降低及il 10升高，差異無(wú)統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。表1大蒜素對(duì)血漿胞因子的影響注：與對(duì)照組比較，ap2 2枯否細(xì)胞的分離、培養(yǎng)結(jié) 果221 kcs形態(tài)的改變與對(duì)照比較分離kcs結(jié)果表明，對(duì)照組kcs體積較小，形態(tài)相對(duì)規(guī)整，胞漿突起纖細(xì)， 胞漿內(nèi)僅有少量空泡。而模型組kcs體積明顯增大，核漿比 例增大，胞漿突起明顯增多、變粗、胞漿高度空泡化，吳典 型的活化狀態(tài)。222 kcs分泌細(xì)胞因子的變化（表2）加入lps后，模型組

7、與藥物組培養(yǎng)上清液中il 6、tnf a水平明 顯高于對(duì)照組，il 10、水平發(fā)生明顯下降。藥物組與高 脂組比較il 6、tnf a水平顯降低，而il 10水平顯 著升高。表2大蒜素對(duì)大鼠kcs培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的影響注：與對(duì)照組比較，ap3 討論近年來(lái)，非酒精性脂肪肝炎發(fā)病率明顯增高，盡管該病 的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但對(duì)先天肥胖性ob/ob小鼠和 fa/fa大鼠研究表明，kcs分泌功能紊亂參與了疾病的發(fā)生。 其自然發(fā)展成為脂肪肝，特征有胰島素抵抗、肥胖、脂質(zhì)代 謝紊亂，與人類(lèi)的非酒精性脂肪肝炎直接相關(guān)1 ）。yang 等2提出肥胖個(gè)體枯否細(xì)胞功能紊亂可以增加肝細(xì)胞對(duì) 內(nèi)毒素的敏感性，從而加

8、速脂肪肝炎的形成。對(duì)肥胖、瘦素 受體功能紊亂的大鼠、小鼠枯否細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，枯否細(xì) 胞表型異常，在給予內(nèi)毒素刺激后與對(duì)照比較，促炎因子il6、tnf ci表迗?jiān)黾樱盅滓蜃觟l 10表迗抑制3）。 盡管肝臟各種細(xì)胞均可產(chǎn)生tnf a ,但普遍認(rèn)為內(nèi)毒素活 化枯否細(xì)胞是tnf a產(chǎn)生的主要來(lái)源。研究表明，tnf a在脂肪肝炎的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，其不僅可通過(guò) 活化受體，產(chǎn)生各種適應(yīng)性蛋白、促進(jìn)肝細(xì)胞的抗凋亡（4 ）， 也可引發(fā)肝細(xì)胞線粒體釋放出活性氧引起肝細(xì)胞死亡、凋亡 和肝臟的炎病浸潤(rùn)。il 6是肝臟kcs產(chǎn)生的另一種重要促 炎因子，可與tnf a在協(xié)同促進(jìn)肝內(nèi)炎癥的產(chǎn)生。相反il1

9、0可通過(guò)抑制各種促炎因子的生成，從而減少肝內(nèi)中性 粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。大蒜素是從大蒜中提取出的一種有效成分， 其作用十分廣泛。有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)cc14及乙醇所致的急、 慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用5, 6）。在我們以往的研究 中也發(fā)現(xiàn)，其對(duì)高脂飲食所致肝臟慢性損傷也有較好的保護(hù) 作用。為進(jìn)一步證實(shí)大蒜素是否可能通過(guò)調(diào)節(jié)kcs分泌功能 來(lái)改善肝組織慢性損傷，實(shí)驗(yàn)中以高脂飲食復(fù)制慢性肝損傷 模型。檢測(cè)結(jié)果表明，模型組大鼠發(fā)生脂肪肝炎時(shí)，血漿促 炎因子il 6、tnf a明顯升高而抑炎因子il 10顯著 降低，大蒜素可抑制il 6水平的升高。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步 證實(shí)，大蒜素可降低kcs對(duì)il 6、tnf a的表迗

10、，在提 高il 10的表達(dá)方面作用十分顯著。說(shuō)明大蒜素可通過(guò)調(diào)節(jié)kcs的分泌，改善肝臟內(nèi)促炎因子與抑炎因子的失衡，參 與對(duì)肝臟慢性損傷的保護(hù)作用。【參考文獻(xiàn)】1) yelley mounterma, cullenmf , bakermb, etoftheob eseprobuctonbodywe ightregulationinob obmice j. science，1995,269:540-543.2 yangsq,linhz,la nemd,etincreasetoe ndotoxinliverinjur y：implicationsforp athogenesis j . pro cncadacadsicusa, 19 97,94： 2557-2563.3 ) lefkowitchjh , hay thejh,regentcellag gregationandperive nlardistributionin steatohepatitis j . modpathol,2002,15 ： 699-704.4) faggi onir, shigenagaj,mo srea, etofucp2genee xpressionbylps：apotentialmechanismforincreasedthermogenesisdur