痤瘡丙酸桿菌促進(jìn)小鼠外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）的動(dòng)員在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的作用

1、痤瘡丙酸桿菌促進(jìn)小鼠外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）的動(dòng)員在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的作用（河北省滄州市屮西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院河北滄州061000）【摘要】目的：探討?zhàn)畀彵釛U菌促進(jìn)小鼠外周血屮樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）的動(dòng)員在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的作用。方法：c578bl7l6j（b6）小鼠注射痤瘡丙酸桿菌 后分離外周單核細(xì)胞，予以流式細(xì)胞儀將f4/80-b220-cd11c+細(xì)胞，體外加入 tnf-α> il-4、gm-csf等細(xì)胞因子培養(yǎng)，由混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、表型分析、 形態(tài)學(xué)觀察鑒定其能否分化為成熟dc;將痤瘡丙酸桿菌動(dòng)員的樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載 h癌抗原后致敏細(xì)胞，觀察體外t細(xì)胞活化后對(duì)h癌細(xì)胞的殺傷效

2、應(yīng)。結(jié)果：實(shí) 驗(yàn)組注射痤瘡丙酸桿菌后lh、6h、id、2d、3d、5d、7d后小鼠外周血屮 f4/80-b220-cdc+細(xì)胞變化顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），實(shí) 驗(yàn)組第id后顯著升高，第3天達(dá)高峰后逐漸降低；h癌細(xì)胞與b16細(xì)胞相比， 痤瘡丙酸桿菌動(dòng)貝的dc活化的t細(xì)胞及骨髓來(lái)源的dc活化的t細(xì)胞屮 ifn-γ干擾素的分泌水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。結(jié)論：痤瘡丙酸 桿菌可對(duì)f4/80-b220-cd11c+細(xì)胞迅速動(dòng)仍進(jìn)入小鼠外周血，細(xì)胞因子誘導(dǎo)后口j 分化為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，體外誘導(dǎo)特異性t淋巴細(xì)胞系傷胃癌細(xì)胞，

3、同時(shí)合并 分泌大量inf-γ?！娟P(guān)鍵詞】實(shí)驗(yàn)研究；胃癌；樹(shù)突狀細(xì)胞；痤瘡丙酸桿菌【中圖分類號(hào)】r735.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】b 【文章編號(hào)】1003-5028 （2015）7-0230-02胃癌在我國(guó)各種惡性腫瘤屮居首位，胃癌除進(jìn)行化療及手術(shù)外，近年來(lái) 認(rèn)為對(duì)胃癌患者進(jìn)行腫瘤免疫治療臨床效果較佳，而其屮主要為痤瘡丙酸桿菌動(dòng) 員外周血屮的樹(shù)突狀細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生系傷效應(yīng)，效果確切1-2。探析痤瘡 丙酸桿菌促進(jìn)小鼠外周血屮樹(shù)突狀細(xì)胞的動(dòng)貝效應(yīng)具有重要的臨床價(jià)值，故本研 究探究痤瘡丙酸桿菌（p.acnes）促進(jìn)小鼠外周血屮樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）的動(dòng)員在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，效果滿意，現(xiàn)

4、報(bào)道如下。1資料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心上海分中心提供8-10周齡的雌性 balb/c 小鼠及 c578bl/6j (b6)鼠。1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑美國(guó)bd公司提供的鼠tnf-α、il-4、 gm-csf、重組鼠干細(xì)胞因子(scf),中科院上海細(xì)胞所提供的黑色素瘤b16細(xì) 胞株及胃癌細(xì)胞株scg-7901,美國(guó)pharmigen公司生產(chǎn)的pe標(biāo)記的抗la、 cd8αncd86 單抗、fitc 標(biāo)i己的抗 cdllb、cd80、f4/80、cd40 單抗，fitc 標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗，鼠dec-205單抗，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的cdlc

5、單抗， 藻紅元熒光素(pe)標(biāo)記的b220單抗，生物素標(biāo)記的cy-chrome-conjugated streptavidin二抗及f4/80單抗;德國(guó)miltenyi公司生產(chǎn)的結(jié)合鼠cd3單抗的免 疫磁珠，美國(guó)endogen公司生產(chǎn)的鼠γ干擾素elisa檢測(cè)試劑盒。1.2實(shí)驗(yàn)方法1)分離小鼠外周血f4/80-b220-cd11c+細(xì)胞:b6小鼠分 為八組，每組5只；實(shí)驗(yàn)組將火活的痤瘡丙酸桿菌(lmg/100μipbs)由尾靜 脈注射，對(duì)照組予以pbs100μl注射，在注射前、注射lh、1、2、3、5、7d 后小鼠后心臟予以乙醚麻醉，穿刺采集0.

6、8ml外周血，肝素抗凝，外周血單個(gè)核 心板予以密度梯度離心法分離，細(xì)胞標(biāo)記后由流式細(xì)胞儀進(jìn)行f4/80-b220-cd11c+細(xì)胞分離，純度超過(guò)99%; 2)觀察及表型分析f4/80-b220-cd1c+細(xì)胞的形態(tài)學(xué)：選擇注射痤瘡丙酸桿菌24h后分選的 f4/80-b220-cd1c+細(xì)胞，在 24 孔培養(yǎng)板上接種，加入 10ng/mlll-4 及 4ng/mlgm-csf, 培養(yǎng)五天后更換新培養(yǎng)板，后用50ng/mltnf-α及4ng/mlgm-csf培養(yǎng)五天； 培養(yǎng)吋每隔2日予以培養(yǎng)基半量換液，用非特異性酯酶和giemsa染色后光鏡下 觀察；取分選的f4/80-b220

7、-cd1c+細(xì)胞，標(biāo)記后予以流式細(xì)胞儀檢測(cè)共刺激分子 dec205、cd86、cd80 及 mhc-ii。3)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr):采集 balb/c 小鼠脾臟細(xì)胞，應(yīng)用密度梯度離心法分離mncs,將結(jié)合鼠cd3單抗的磁珠加入 后分選，注射痤瘡丙酸桿菌24h后的f4/80-b220-cd11c+細(xì)胞，將細(xì)胞因子及絲 裂霉素c (mmc)做相m處理后備用。將刺激細(xì)胞及反應(yīng)t細(xì)胞加入96孔板，同吋設(shè)置單一細(xì)胞對(duì)照。培養(yǎng)五天后每孔加入mtt繼續(xù)培養(yǎng)4h離心后除去上清 液，加入異丙醇55nm酶標(biāo)儀檢測(cè)0d值;4)t效應(yīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)、檢測(cè)ifn-γ： 凍融3次的腫瘤細(xì)胞懸液離心后

8、，上清液做可溶性抗原，痤瘡丙酸桿菌動(dòng)員的 f4/80-b220-cd11c+及骨髓來(lái)源的dc經(jīng)細(xì)胞因子培養(yǎng)五日后，將腫瘤細(xì)胞抗原加 入每系dc，培養(yǎng)2日后收集懸浮細(xì)胞則為負(fù)載胃癌抗原的致敏dc;制備balb/c 小鼠脾臟t細(xì)胞，分別與痤瘡丙酸桿菌動(dòng)員或骨髓來(lái)源的致敏dc培養(yǎng)五日，同 吋加入il-4及gm-csf，t細(xì)胞活化后為效應(yīng)細(xì)胞，將b16細(xì)胞或胃癌細(xì)胞加入 96孔板每孔內(nèi)，根據(jù)1:1、5:1、10:1、25:1、50: 1、100:1的效：靶比加入t效 應(yīng)細(xì)胞；培養(yǎng)20h后予以mtt法檢測(cè)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析采用spss17.0軟件系統(tǒng)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料 數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示

9、，組間比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05則具奮統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異。2結(jié)果2.1痤瘡丙酸桿菌注射后小鼠外周血中f4/80-b220-cdc+細(xì)胞變化實(shí)驗(yàn) 組注射痤瘡丙酸桿菌后lh、6h、id、2d、3d、5d、7d后的小鼠外周血中 f4/80-b220-cdc+細(xì)胞變化顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),實(shí) 驗(yàn)組第id后顯著升高，第3天達(dá)到高峰后逐漸降低，見(jiàn)表1。2.2痤瘡丙酸桿菌動(dòng)員的f4/80-b220-cdc+細(xì)胞表型和形態(tài)學(xué)的分析注 射痤瘡丙酸桿菌24h后分選的f4/80-b220-cdc+細(xì)胞下顯示細(xì)胞多貼壁生長(zhǎng)，少 數(shù)冇突起，較??；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞共刺

10、激分子dec205、cd86、cd80、mhc-ii 低表達(dá)，cd40中表達(dá)，cdllb高表達(dá)，加入細(xì)胞因子后，懸浮細(xì)胞逐漸增多， 產(chǎn)生毛刺狀短突起，第0d顯示為大多數(shù)細(xì)胞懸浮，非特異性脂酶染色光鏡下觀 察，細(xì)胞表面突起顯著增多，形成典型樹(shù)突狀，共刺激分子dec205、cd80、cd86 及mhc-ii高表達(dá)，與骨髓來(lái)源的成熟dc表型一致，見(jiàn)表2。2.3特異性ctl反應(yīng)中γ干擾素分泌情況胃癌細(xì)胞與b16細(xì)胞相比，痤瘡丙酸桿菌動(dòng)員的dc活化的t細(xì)胞及骨髓來(lái)源的dc活化的t細(xì)胞中ifn-γ干擾素的分泌水平(1652.76±42.37)/

11、( 124.76±10.65)、 (1540.12±36.08)/( 40.12±6.08)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =78.21, t =4.53,p<0.05)o3討論本研究探析痤瘡丙酸桿菌促進(jìn)小鼠外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞的動(dòng)員對(duì)胃癌 的殺傷作用，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組注射痤瘡丙酸桿菌后lh、6h、id、2d、3d、5d、 7d后的小鼠外周血中f4/80-b220-cdc+細(xì)胞變化顯著高于對(duì)照組，差異奮統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(p<0.05),實(shí)驗(yàn)組第id后顯著升高，第3天達(dá)到高峰后逐漸降低；注射 痤瘡丙酸桿菌24h后分選的

12、f4/80-b220-cdc+細(xì)胞下顯示細(xì)胞多貼壁生長(zhǎng)，少數(shù) 有突起，較小3-4;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞共刺激分子dec205、cd86、cd80、mhc-ii 低表達(dá)，cd40中表達(dá)，cdllb高表達(dá)，加入細(xì)胞因子后，懸浮細(xì)胞逐漸增多， 產(chǎn)生毛刺狀短突起，第10d顯示為大多數(shù)細(xì)胞懸浮，非特異性脂酶染色光鏡下觀 察，細(xì)胞表面突起顯著增多，形成典型樹(shù)突狀，共刺激分子dec205、cd80、cd86 及mhc-ii高表達(dá)，與骨髓來(lái)源的成熟dc表型一致；胃癌細(xì)胞與b16細(xì)胞相比， 痤瘡丙酸桿菌動(dòng)員的dc活化的t細(xì)胞及骨髓來(lái)源的dc活化的t細(xì)胞中 ifn-γ干擾素的分泌水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義(p<0.05)，與牛超，徐建婷 等5】的研究結(jié)果人體一致，注射痤瘡丙酸桿菌后，外周血中f4/80-b220-cdc+細(xì) 胞顯著升高，與單核細(xì)胞十分相似，而體外mlr中刺激異源性t細(xì)胞增殖能力 較弱，經(jīng)由細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，外形上出現(xiàn)典型的樹(shù)枝狀突起，而dec205、cd86、 cd80、cdllc、mhc ii類分子高表達(dá)，體外出現(xiàn)較強(qiáng)的t細(xì)胞增殖能力，dc缺 少特異性表面標(biāo)志，經(jīng)由功能、表型、形態(tài)等方面綜合分析確定。綜上所述，痤 瘡丙酸桿菌可對(duì)f4/80-b220-cd11c+細(xì)胞迅速動(dòng)員進(jìn)入小鼠外周血，細(xì)胞因子誘 導(dǎo)后可分化為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，體外誘導(dǎo)特異性t淋巴細(xì)胞殺傷胃癌細(xì)胞，同 吋合并分泌大量inf-γ。參考文獻(xiàn)：1】陳彥，汪良，張雁云.痤瘡丙酸桿菌促樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞動(dòng)員及其對(duì)胃癌的治療效應(yīng).江蘇醫(yī)藥,2012,32(9):144-145.2】肖偉明，吳克艷，龔衛(wèi)娟，等.胃癌組織中cdla樹(shù)突狀細(xì)胞密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子表達(dá)及其相關(guān)性.中國(guó)腫瘤臨床,2012,31(21):179-182.3】張錦英，束永前,黃普文，等.抗原負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞刺激細(xì)胞因