微生物限度檢查法驗證方案模板

1、10/11驗 證 文 件 文件編號：svp yf-0-01-00驗證文件*微生物限度檢查法驗證方案*有限責任公司目 錄1 適用范圍2 目的3 概述4 驗證所需要的儀器設(shè)備及文件5 可接受的限度范圍標準6 測試方法7 異常情況處理8 測試結(jié)果9 結(jié)論10 再驗證周期 11附表1適用范圍本驗證方案適用于*微生物限度檢查法的驗證。2目的建立該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法，并對其有效性進行評價，確保試驗方法的完整性，保證檢驗結(jié)果的可靠性。3概述3.1*處方中含有鹽酸氨基葡萄糖以及常用輔料等成分，文獻報道鹽酸氨基葡萄糖有抑菌活性。根據(jù)以上特點，按中國藥典2010年版附錄 j微生物限度檢查法方法的“供試品的制

2、備”項下需用特殊方法制備供試液中（6）制備供試液?！凹毦?，霉菌，酵母菌計數(shù)”項下檢查法2薄膜過濾法進行細菌，霉菌及酵母菌的計數(shù)方法驗證，控制菌檢查項下控制菌的檢查法驗證。3.2驗證時間：*批平行三次試驗。4驗證所需要的儀器設(shè)備及文件4.1驗證需用儀器設(shè)備器具名稱規(guī)格型號檢定日期檢定單位有效期電熱恒溫培養(yǎng)箱hg101-3多用生化培養(yǎng)箱sp-80蒸汽滅菌器zdx-35b4.2驗證所需要的文件及存放地方資料名稱存放地點hg101-3電熱恒溫培養(yǎng)箱操作維護保養(yǎng)sopsp-80型生化培養(yǎng)箱操作維護保養(yǎng)sopzdx-35b蒸汽滅菌器操作維護保養(yǎng)sop微生物限度檢查法sop5可接受的限度范圍標準5.1*微生

3、物限度檢查質(zhì)量標準項目標準規(guī)定細菌總數(shù)1000個/g霉菌、酵母菌100個/g大腸埃希菌不得檢出5.2細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果判斷在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌；若任一次試驗中實驗組的菌回收率低于70%，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。5.3控制菌檢查方法驗證結(jié)果判斷若試驗組檢出試驗菌（檢出試驗菌判斷如下），按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行驗證。5.4

4、大腸埃希菌檢查結(jié)果判斷如mug陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如mug陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如mug陽性、靛基質(zhì)陰性，或mug陰性、靛基質(zhì)陽性，則應取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h。瓊脂判供試品檢出大腸埃希菌；若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判定供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗，確認是否為大腸埃希菌。培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，

5、圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤6測試方法6.1供試品*，批號(*)。6.2培養(yǎng)基及菌種6.2.1采用符合中國藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基，中國藥品生物制品檢定所制。6.2.2枯草芽孢桿菌cmcc(b) 63501、金黃色葡萄球菌cmcc(b) 26003、大腸埃希菌cmcc（b）44102、白色念珠菌cmcc (f) 98001、 黑曲霉cmcc(f)98003。6.3菌液制備6.3.1細菌、霉菌及酵母菌的檢查的菌液制備6.3.1.1取新鮮的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉

6、湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)32.5±2.5培養(yǎng)1824h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.1.2取新鮮的白色念珠菌的培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)25.5±2.5培養(yǎng)2448h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.1.3取新鮮的黑曲霉培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng)25.5±2.5培養(yǎng)57d，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或

7、紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.2控制菌的檢查菌液的制備取新鮮的大腸埃希菌的培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)32.5±2.5培養(yǎng)1824h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含細菌數(shù)約為10100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.3供試品制備取供試品10g，加ph7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。6.4驗證試驗方法: 細菌、霉菌及酵母菌檢驗方法驗證采用上述供試品，進行3次平行試驗，分別人工污染

8、上述5種代表試驗菌株?？刂凭鷻z驗方法驗證采用上述批供試品進行實驗。6.4.1細菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)方法驗證試驗6.4.1.1試驗分組6.4.1.1.1供試品對照組：取上述供試液1ml，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底細菌數(shù)；取上述供試液1ml，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)；6.4.1.1.2菌液組：分別取上述5種試驗菌懸液1ml，制備濾膜，按菌落計數(shù)方法測定所加的試驗菌數(shù)。6.4.1.1.3試驗組：取1：10供試液1ml，過濾，沖洗，分別在最后一次的沖洗液中加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗菌懸液各1ml，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。取1：10供試液1ml，過濾，沖

9、洗，分別在最后一次的沖洗液中加入白色念珠菌和黑曲霉懸液各1ml，過濾，按薄膜過濾法測定霉菌數(shù)。6.4.1.1.4稀釋劑對照組：取實驗用的稀釋液1ml代替供試品，加入實驗菌，制備濾膜，按菌落計數(shù)方法測定所加的試驗菌數(shù)。6.4.1.2驗證試驗操作6.4.1.2.1取供試品10g，加ph7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。取上述供試液1ml，加至適量稀釋劑中，混勻，過濾，用ph7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜,沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。6.4.1.2.2陰性對照試驗取實驗用的稀釋液1ml

10、，制備濾膜，濾膜菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，均不得有菌生長。6.4.1.2.3培養(yǎng)和計數(shù) 細菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當延長培養(yǎng)時間至57天進行菌落計數(shù)報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級別兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特

11、殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌，細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上細菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為計數(shù)結(jié)果。6.4.1.3菌數(shù)報告規(guī)則以相當于1g供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數(shù)，或<1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌落數(shù)。6.4.1.4計算公式試 驗組的菌回 收率 % 6.4.2控制菌的檢查驗證試驗6.4.2.1試驗分組6.2.2.1.1試驗組取1：10供試液10ml，過濾，沖洗，在最后一次

12、的沖洗液中加入大腸埃希菌試驗菌懸液1ml，過濾，濾膜接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。6.2.2.1.2供試品組取1：10供試液10ml，制備濾膜，濾膜接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。6.4.2.2陽性對照試驗取大腸埃希菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應檢出大腸埃希菌。6.4.2.3陰性對照試驗取稀釋液10ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。6.4.2.4大腸埃希菌的試驗取供試液10 ml（相當于供試品1g），制備濾膜，濾膜接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳酸培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48h。取上述培養(yǎng)物0.2

13、ml，接種至含5mlmug培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的mug培養(yǎng)基作為本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為mug陽性；不呈現(xiàn)熒光，為mug陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應為mug陰性和靛基質(zhì)陰性。7異常情況處理嚴格按照微生物限度檢查法sop操作，如在檢測中出現(xiàn)不符合要求的情況出現(xiàn)，分析問題原因后，決定是否需對本方案中設(shè)定的*的微生物限度檢查方法進行修改，并重新進行驗證。8測試結(jié)果8.1細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果見附表1。8.2控制菌的檢查方法驗證結(jié)果見附表2。

14、8.3按確定的驗證方法檢驗三批產(chǎn)品微生物限度檢查結(jié)果見附表3。9結(jié)論9.1按照*檢驗操作規(guī)程，我們設(shè)定了該產(chǎn)品的微生物限度檢驗方法，對*批*進行了微生物方法學驗證，結(jié)果各項指標 標準規(guī)定，證明該標準操作規(guī)程 檢驗需要， gmp要求， 使用。9.2通過*的檢驗，各項指標的回收率均大于70%，說明*用薄膜過濾法檢驗無抑菌性，故適用于*的微生物的檢驗。確定*微生物限度檢查法如下： 質(zhì)量負責人： 審核人： 檢驗人10再驗證周期10.1*的處方發(fā)生變動或其它因素變更導致*的物料性質(zhì)改變時，需要對本方案進行調(diào)整后作方法學再驗證。10.2國家相關(guān)微生物限度檢查標準修改后需要對本方法重新進行再驗證。11附表附表1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果 試驗分類實驗次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌試驗組123菌液組123稀釋劑對照組123供試品對照組1供試品對照組2供試品對照組3陰性對照組1陰性對照組2陰性對照組3稀釋劑對照組菌回收率223試驗組的菌回收率123結(jié)果判定備注：*驗證一批平行三次，批號：*結(jié)論：按照*微生物限度檢查法驗證方案檢驗，結(jié)果實驗日期： 報告日期： 檢 驗 人： 復 核 人： 質(zhì)量部qa: 統(tǒng)計日期： 附表2