實(shí)驗(yàn)二 GSTZ基因的PCR擴(kuò)增

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 gstz基因的基因的pcr擴(kuò)增擴(kuò)增amplifying gstz gene by polymerase chain reaction核酸的體外擴(kuò)增v真核細(xì)胞內(nèi)dna的復(fù)制v聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction，pcr）the nobel prize in chemistry 1993for contributions to the developments of methods within dna-based chemistry for his invention of the polymerase chain reaction (pcr) met

2、hod kary b. mullisla jolla, ca, usa b:1944 一、一、pcr的基本原理：的基本原理：一種模擬天然dna復(fù)制的體外擴(kuò)增法pcr反應(yīng)三部曲：變性(denature)：加熱使雙鏈dna解開螺旋退火(annealing) 在退火溫度條件下引物同模板雜交延伸(extend)在taq dna聚合酶，dntps，mg2+和合適ph緩沖液存在條件下延伸引物 dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 reaction buffer mgcl2 試劑原液濃度工作濃

3、度50l體系pcr緩沖液 1015l上游引物10mol/l0.5mol/l2.5l下游引物10mol/l0.5mol/l2.5ldntps2.5mmol/l 200mol/l4lmgcl225mmol/l1.5mmol/l3ldna模板 0.110ngddh2o補(bǔ)足47.5ltaq酶1u/l2.5u/50l體系2. 5lpcr parametervpre-denature: 94 5minvpcr cycles:denature 94 40secannealing 58 35secextend72 1min30secvtotally 3540 cyclesvpost-extend: 72 7m

4、in dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 reaction buffer mgcl2 dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 reaction buffer mgcl2 引物-人工合成的寡核苷酸v一般pcr反應(yīng)中引物的終濃度為0.1-1mol/l，在此范圍內(nèi)產(chǎn)物量基本相同。引物濃度低于0.1mol/l時(shí)，產(chǎn)物量降低；引物濃度過(guò)高會(huì)引導(dǎo)非特異產(chǎn)物擴(kuò)增，還會(huì)增加引物二聚

5、體的形成。引物設(shè)計(jì)原則：軟件+經(jīng)驗(yàn)v引物長(zhǎng)度以15-30個(gè)堿基為宜；v引物堿基盡可能隨機(jī)分布，g+c含量宜在4555%左右；v引物內(nèi)部、引物之間不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；v避免重復(fù)多聚堿基；v引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其他序列無(wú)明顯同源性；v兩個(gè)引物的tm值要盡可能接近； 重組時(shí)引物設(shè)計(jì)的其它幾個(gè)問(wèn)題：1.移碼突變 2.酶切位點(diǎn)3.保護(hù)堿基引物引物aattggatccatggcgaattccggcgaaga (bamh i)引物引物baccaagcttgatggtggaagaaggagc (hind iii) dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 t

6、aq dna polymerase 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 reaction buffer mgcl2 三磷酸脫氧核苷（dntps）v四種三磷酸脫氧核苷（datp、dctp、dgtp、dttp）是dna合成的基本原料，工作濃度應(yīng)為20200mmol/l。所用的四種dntp的濃度應(yīng)相等，以使錯(cuò)誤摻入率降至最低。dntps濃度過(guò)低則反應(yīng)速度下降， dntps濃度過(guò)高則擴(kuò)增特異性降低，而且當(dāng)dntp濃度高于50mm時(shí)也會(huì)抑制taq dna聚合酶的活性。 dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖

7、液 reaction buffer mgcl2 耐熱dna聚合酶 vtaq聚合酶是從耐熱菌（thermus aquatious）中提取出來(lái)的耐熱酶，95仍有活性。該酶的應(yīng)用濃度一般為12.5u/50l反應(yīng)體系，然而，酶的用量可依據(jù)不同的模板分子或引物而變化。酶濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；過(guò)低時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量很低。 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液vtris-hclvkclv酶的穩(wěn)定劑a typical reaction buffer for pcr would something like: 10mm tris, ph 8.3 50mm kcl 0.01% gelatin dna模板模板 template

8、 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 reaction buffer mgcl2 mg2+ vmg2+ 是taq dna聚合酶活性所必需的。mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性、產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等等。generally, low mg2+ leads to low yields (or no yield)high mg2+ leads to accumulation of nonspecific products (mispriming).the mgcl2 concentration in

9、the final reaction mixture is usually between 0.5 to 5.0mm, 試劑原液濃度工作濃度50l體系pcr緩沖液 1015l上游引物10mol/l0.5mol/l2.5l下游引物10mol/l0.5mol/l2.5ldntps2.5mmol/l 200mol/l4lmgcl225mmol/l1.5mmol/l3ldna模板 0.110ngddh2o補(bǔ)足47.5ltaq酶1u/l2.5u/50l體系2. 5l循環(huán)參數(shù) v變性溫度和時(shí)間變性溫度和時(shí)間 v復(fù)性溫度和時(shí)間復(fù)性溫度和時(shí)間 v延伸溫度和時(shí)間延伸溫度和時(shí)間 v循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù) 變性溫度與時(shí)間變性

10、溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致pcr失敗的最主要原因。一般情況下，93941min足以使模板dna變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或pcr產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致pcr失敗。 退火 (復(fù)性)溫度與時(shí)間v退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：tm值(解鏈溫度)=4(g+c)2(a+t)復(fù)性溫度=tm值-(210)v在tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高pcr反應(yīng)的特異性。v復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與

11、模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時(shí)間vtaq dna聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150核苷酸/s/酶分子70 60核苷酸/s/酶分子55 24核苷酸/s/酶分子vpcr反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。vpcr延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1kb以內(nèi)的dna片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定pcr擴(kuò)增程度。pcr循環(huán)次數(shù)主要取決于模板dna的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選

12、在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840cyclernthreshold104103102pcr parametervpre-denature: 94 3minvpcr cycles:denature 94 30sec1minannealing tm-(210) 30sec1minextension72 based on the length of ampliconvtotally 30-40 cyclesvpost-extension:72 7min 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)

13、物 非特異性擴(kuò)增 拖尾 假陽(yáng)性 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. bufferbuffer對(duì)樣品不合適對(duì)樣品不合適3.3. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解解4.4. 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時(shí)間太短伸時(shí)間太短 原原因因?qū)?duì)策策1.1. 純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提取模板模板dnadna或加大模板的用量或加大模板的用量2.2. 更換更換bufferbuffer或調(diào)整濃度或調(diào)整濃度3.3. 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）

14、或者換一管新引物管新引物4.4. 降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)； 非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：pcrpcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶?；蛐?，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。1.1.引物特異性差引物特異性差2.2.模板或引物濃度過(guò)高模板或引物濃度過(guò)高3.3.酶量過(guò)多酶量過(guò)多4.4.mgmg2+2+濃度偏高濃度偏高5.5.退火溫度偏低退火溫度偏低6.6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原原因因?qū)?duì)策策1.1.重新設(shè)計(jì)引物

15、或者使用巢重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式式pcrpcr2.2.適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)降低模板或引物濃度3.3.適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量4.4.降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度5.5.適當(dāng)提高退火溫度或使用適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴(kuò)增 拖尾 現(xiàn)象：現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠上呈smear狀態(tài)狀態(tài)。 m 1 21.1.模板不純模板不純2.2.bufferbuffer不合適不合適3.3.退火溫度偏低退火溫度偏低4.4.酶量過(guò)多酶量過(guò)多5.5.dntpdntp、mgmg2+2+濃度偏高濃度偏高6.6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原原因因?qū)?duì)策

16、策1.1.純化模板純化模板2.2.更換更換bufferbuffer3.3.適當(dāng)提高退火溫度適當(dāng)提高退火溫度4.4.適量用酶適量用酶5.5.適當(dāng)降低適當(dāng)降低dntpdntp和鎂離子的和鎂離子的濃度濃度6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 假陽(yáng)性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況) )原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 對(duì)策：1. 1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2.2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑

17、或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3.3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。 pcr的應(yīng)用v高特異性v高靈敏度 防止污染v簡(jiǎn)便快速v用途廣泛：dna測(cè)序測(cè)序各對(duì)病毒特異性引物各對(duì)病毒特異性引物pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果bsendai；chpiv 1；dhpiv 2；esv 5；fhpiv 3；ghpiv 4；hinf a；iinf b；a為分子量為分子量marker（2kbp,1kbp,750bp,500bp,25

18、0bp,100bp）abcdefghi病原體檢測(cè)病原體檢測(cè)定量定量pcrpcrpcr phasestraditional pcr detectiony=x 2n轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染p15質(zhì)粒及質(zhì)粒及sirna后后p15基因表達(dá)情況基因表達(dá)情況a：轉(zhuǎn)染p15質(zhì)粒及sirna后p15基因的表達(dá)情況m: 分子marker dl 2,000; 1 control; 2 轉(zhuǎn)空載體; 3 轉(zhuǎn)入p15質(zhì)粒; 4 轉(zhuǎn)入p15質(zhì)粒+ p15 sirna; 5.轉(zhuǎn)入p15質(zhì)粒+ 無(wú)意義sirna半定量半定量pcr “semi-qpcr”實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量pcr “real-time qpcr” cap pcr vesselth

19、ermal block samplelens0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.900510152025303540pcr cycle numberbaseline regionthresholdctno template control samplenormalised reporter fluorescence (rn)geometric phasepcr efficiency1ct: threshold cyclethe calculated fractional cycle number at which the fluorescence pas

20、ses the fixed thresholdct值極具重現(xiàn)性pe公司在同一臺(tái)pcr儀上對(duì)相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖ct與初始模板的關(guān)系初始dna量越多, 熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(ct 值)越少起始模板的對(duì)數(shù)濃度與ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840cyclernthreshold104103102常用的熒光定量常用的熒光定量pcrpcr試劑試劑taqman probehybridises with the target ampliconis 3

21、 terminally blocked (cannot be extended by the polymerase) has two fluorescent dyes attached:1. reporter (r)2. quencher (q) 35fluorogenic 5 nuclease assay(taqman chemistry)rqforward primerreverse primer33553551. polymerisationproberq33553552. strand displacementq33553553. cleavager3553554. polymerisation completedqrr = reporterq = quencher3v隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，taqman探針釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系vtaqman探針應(yīng)用基因檢測(cè)、病毒定量、細(xì)胞因子基因定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測(cè)等v其結(jié)果都具有高特異性與高敏