生物化學(xué)實驗教案

1、生物化學(xué)實驗生物化學(xué)實驗教案侯沁文侯沁文目目 錄錄實驗一實驗一 糖的顏色反應(yīng)糖的顏色反應(yīng).1實驗二實驗二 糖的還原作用糖的還原作用.3實驗三實驗三 多糖的實驗多糖的實驗.4實驗四實驗四 糖的旋光性和變旋現(xiàn)象糖的旋光性和變旋現(xiàn)象.5實驗五實驗五 血糖的定量測定（葡萄糖氧化酶法）血糖的定量測定（葡萄糖氧化酶法）.7實驗六實驗六 人血清中總膽固醇的測定人血清中總膽固醇的測定.8實驗七實驗七 牛奶中粗脂肪含量的測定牛奶中粗脂肪含量的測定.9實驗八實驗八 牛奶中牛奶中酪蛋白的提取酪蛋白的提取.11實驗九實驗九 牛奶中酪蛋白含量的測定牛奶中酪蛋白含量的測定.12實驗十實驗十 氨基酸的紙層析氨基酸的紙層析.

2、14實驗十一實驗十一 醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì).16實驗十二實驗十二 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng).18實驗十三實驗十三 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng).20實驗十四實驗十四 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量.21實驗十五實驗十五 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度.22實驗十六實驗十六 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度.24實驗十七實驗十七 紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度.25實驗十八實驗十八 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定.

3、27實驗十九實驗十九 過氧化物酶的作用過氧化物酶的作用.28實驗二十實驗二十 溶菌酶的提純結(jié)晶溶菌酶的提純結(jié)晶.29實驗二十一實驗二十一 酵母酵母 RNA 的提取的提取.30實驗二十二實驗二十二 RNA 的定量測定（苔黑酚法）的定量測定（苔黑酚法）.31實驗二十三實驗二十三 DNA 的提取及含量測定的提取及含量測定.32實驗二十四實驗二十四 蕎麥中總黃酮的定性定量研究蕎麥中總黃酮的定性定量研究.321實驗一 糖的顏色反應(yīng)實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?1. 掌握莫式（Molisch）試驗鑒定糖的原理和方法。2. 掌握塞式（Seliwanoff）試驗鑒定酮糖的原理和方法。3. 掌握杜式(Tolle

4、n)試驗鑒定酮糖的原理和方法。實驗原理實驗原理1莫式試驗：糖經(jīng)無機酸（濃硫酸、濃鹽酸）脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，后者在濃無機酸作用下，能與 -萘酚生成紫紅色縮合物。2塞式試驗：酮糖在濃酸的作用下，脫水生成 5-羥甲基糠醛，后者與間苯二酚作用，呈紅色反應(yīng)；有時亦同時產(chǎn)生棕紅色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鮮紅色溶液。3杜式試驗：戊糖在濃酸溶液中脫水生成糠醛，后者與間苯三酚結(jié)合成櫻桃紅色物質(zhì)。實驗儀器及用品實驗儀器及用品儀器：水浴鍋。器皿：吸管、試管。實驗藥品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、-萘酚、濃硫酸、95%乙醇、間苯二酚、鹽酸、間苯三酚。實驗試劑實驗試劑 莫式試劑：-萘酚 5g,溶于

5、 95%乙醇并稀釋至 100ml?，F(xiàn)用現(xiàn)配，并貯于棕色試劑瓶中。 塞式試劑：間苯二酚 50mg，溶于 100ml 鹽酸（VH2O：VHCl=2:1），現(xiàn)用現(xiàn)配。 杜式試劑：2%間苯三酚乙醇溶液（2g 間苯三酚溶于 100ml95%乙醇中）3ml,緩緩加入濃鹽酸15ml 及蒸餾水 9ml。臨用時配制。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、莫式實驗于 4 支試管中，分別加入 1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少許纖維素（棉花或濾紙浸在 1 ml 水中），然后各加莫式試劑 2 滴，搖勻，將試管傾斜，沿管壁慢慢加入濃硫酸 1.5 ml（切勿振搖！），硫酸層沉于試管底部與糖溶液分成兩層，觀察

6、液面交界處有無紫色環(huán)出現(xiàn)。二、塞式試驗于 4 支試管中，分別加入 0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式試劑 2.5ml，搖勻，同時置沸水浴內(nèi)，比較各管顏色及紅色出現(xiàn)的先后順序。 三、杜式試驗2于 3 支試管中加入杜式試劑 1ml，再分別加入 1 滴 1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和 1%阿拉伯糖溶液，混勻。將試管同時放入沸水浴中，觀察顏色的變化，并記錄顏色變化的時間。四、實驗現(xiàn)象記錄仔細觀察實驗中的顏色變化，對于塞式試驗和杜式試驗還需記錄下顏色變化的時間。3實驗二 糖的還原作用實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?掌握糖的還原反應(yīng)來鑒定糖的原理和方法。實驗原理實驗原理費

7、林(Fehling)試劑和本尼迪(Benedict)試劑均為含 Cu2+的堿性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身則被還原成紅色或黃色的 Cu2O，此法常用作還原糖的定性或定量測定。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗儀器：水浴鍋實驗器皿：吸管、試管實驗試劑：硫酸酮、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、無水碳酸鈉、淀粉、蔗糖、葡萄糖。實驗試劑實驗試劑1. 費林試劑試劑 A：CuSO45H2O 34.5 g,溶于蒸餾水并稀釋至 500 ml。試劑 B：氫氧化鈉 125 g，酒石酸鉀鈉 137 g，溶于蒸餾水并稀釋至 500 ml。臨用時將試劑 A 與試劑 B 等體積混合。2. 本尼迪試劑：檸檬酸

8、鈉（Na3C6H3O711H2O）及 50 g 無水碳酸鈉，溶于 400 ml 蒸餾水中。另溶解 8.5 g 硫酸銅于 50 ml 熱水中。將硫酸銅溶液緩緩加入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，如有沉淀可過濾。此混合液可長期使用。實驗內(nèi)容及步驟于 3 支試管中加入費林試劑 A 和 B 各 1 ml，混勻，分別加入 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和 1%淀粉溶液 1 ml，置沸水浴中加熱數(shù)分鐘，取出，冷卻，觀察各管的變化。另取 3 支試管，分別加入 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和 1%淀粉溶液 1 ml，然后每支試管加本尼迪試劑 2 ml，置沸水浴中加熱數(shù)分鐘，取出，冷卻，和上面結(jié)果比較。4實驗

9、三 多糖的實驗實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?1熟悉淀粉多糖的碘試驗反應(yīng)原理和方法。2進一步了解淀粉的水解過程。實驗原理實驗原理淀粉廣泛分布于植物界，谷、果實、種子、塊莖中含量豐富，工業(yè)用的淀粉主要來源于玉米、山芋、馬鈴薯。本實驗以馬鈴薯為原料，利用淀粉不溶或難溶于水的性質(zhì)來制備淀粉。淀粉遇碘呈藍色，是由于碘被吸附在淀粉上，形成復(fù)合物，此復(fù)合物不穩(wěn)定，極易被醇、氫氧化鈉和加熱等使顏色褪去，其他多糖與碘呈特異的顏色，此類呈色物質(zhì)極不穩(wěn)定。淀粉在酸催化下加熱，逐步水解成分子較小的糖，最后水解成葡萄糖。實驗儀器及用品實驗儀器及用品器材：研缽、布氏漏斗、抽濾瓶、表面皿、白瓷板、膠頭滴管、電爐、石棉網(wǎng)、紗

10、布、試管、燒杯、吸管、量筒、試管夾。試劑：碘化鉀、碘、淀粉、氫氧化鈉、本尼迪試劑，濃硫酸、碳酸鈉。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、馬鈴薯淀粉的制備將馬鈴薯去皮，在研缽中充分研碎，加水混合，用紗布過濾，除去粗顆粒，濾液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽濾，濾餅放在表面皿上，在空氣干燥中即得。二、淀粉與碘的反應(yīng)1置少量自制淀粉于白瓷板上，加 1-3 滴稀碘液（配制 2%碘化鉀溶液，加入適量碘，使溶液呈淡黃棕色即可），觀察顏色變化。2取試管 1 支，加 0.1%淀粉 5 ml，再加 2 滴稀碘液，搖勻后，觀察其顏色變化。將管內(nèi)液體分成 3 份，其中 1 份加熱，觀察顏色是否褪去。冷卻后，顏色是

11、否全部恢復(fù)。另 2 份加入乙醇或10%NaOH 溶液，觀察顏色變化并解釋之。三、淀粉的水解反應(yīng)在一小燒杯中加入 1%淀粉溶液 25 ml 及 20%硫酸 1 ml，放在石棉網(wǎng)上小火加熱，微沸后每隔兩分鐘取出反應(yīng)液 2 滴置于白瓷板上做碘試驗。與此同時另取反應(yīng)液三滴，用 10%碳酸鈉中和后，做本尼迪試驗，記錄試驗結(jié)果并解釋之。5實驗四 糖的旋光性和變旋現(xiàn)象實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?了解糖的變旋現(xiàn)象，掌握用糖的旋光性測定糖濃度的方法。2學(xué)會使用旋光儀。實驗原理實驗原理光是一種電磁波，光波振動的方向與光的前進方向垂直。普通光的光波在各個不同的方向上振動。但如果讓它通過一個尼科爾(Nicol)棱鏡

12、（用冰洲石制成的棱鏡），則透過棱鏡的光就只在一個方向（偏振面）上振動，這種光就叫做平面偏振光。偏振光能完全通過晶軸與其偏振面平行的尼科爾棱鏡，而不能通過晶軸與其偏振面垂直的尼科爾棱鏡。當(dāng)平面偏振光通過某種介質(zhì)時，有的介質(zhì)對偏振光沒有作用，即透過介質(zhì)的偏振光的偏振面保持不變。而有的介質(zhì)卻能使偏振光的偏振面發(fā)生旋轉(zhuǎn)。這種能旋轉(zhuǎn)偏振光的偏振面的性質(zhì)叫做旋光性。具有旋光性的物質(zhì)叫做旋光性物質(zhì)或光活性物質(zhì)。具有不對稱結(jié)構(gòu)的手性化合物都有旋光性。6能使偏振光的偏振面向右旋的物質(zhì)，叫做右旋物質(zhì)；反之，叫做左旋物質(zhì)。通常用d（拉丁文 dextro 的縮寫，右的意思）或+表示右旋；用l（拉丁文 laevo 的縮

13、寫，左的意思）或-表示左旋。偏振光的偏振面被旋光物質(zhì)所旋轉(zhuǎn)的角度，叫做旋光度，用表示。旋光度的大小不僅取決于物質(zhì)的本性，還與溶液的濃度、液層的厚度、光的波長、測定溫度以及溶劑的性質(zhì)等等有關(guān)。偏振光通過厚度為 1dm，濃度含有 1g/ml 的待測物質(zhì)的溶液所測得的旋光度稱為比旋光度，它是物質(zhì)的一個特性常數(shù)，如下式所示：t=/cl式中 t：測定時的溫度； ：測定時所用光源的波長； ：實測的旋光度； c：溶液的濃度（g/ml）； l：玻管的長度（dm）。一個有旋光性的溶液放置后其比旋光度改變的現(xiàn)象稱為變旋。變旋的原因是糖從 -型變?yōu)?-型或由 -型變?yōu)?-型。一切單糖都有變旋現(xiàn)象。無 -，-型的糖類

14、即無變旋性。實驗儀器及用品實驗儀器及用品儀器：旋光儀、電子天平。器皿：容量瓶、燒杯、玻棒。試劑：未知濃度的蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、利用糖的旋光性測定糖的濃度1轉(zhuǎn)開樣品管螺母，洗凈玻管，然后向管中注滿蒸餾水，蓋上玻片，注意管中不能有氣泡，玻片上的水漬必須擦干。2把樣品放入旋光儀內(nèi)，打開電源，待鈉光源穩(wěn)定 1-2min 后，轉(zhuǎn)動刻度盤，使目鏡中兩半圓的亮度相等，記下刻度盤的讀書，以此為零點。3用蔗糖代替蒸餾水測其旋光度，并按公式計算出蔗糖的濃度。二、糖的變旋現(xiàn)象用新配制的 10%葡萄糖溶液按上法測其旋光度并計算比旋光度，以后每隔 2h 測定其旋光度，計算比旋光度

15、直至比旋光度不再改變，說明 -，-型互變已達平衡。7實驗五 血糖的定量測定（葡萄糖氧化酶法）實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙笳莆掌咸烟茄趸阜y定血糖含量的原理和方法。實驗原理實驗原理D-葡糖糖 D-葡萄糖酸+ H2O2 實驗儀器及試劑實驗儀器及試劑試管、移液管、UNICO-2000 型分光光度計、恒溫水浴鍋。酶試劑：葡萄糖氧化酶（GOD）、過氧化物酶（POD）、4-氨基安替吡啉（4-AAP）。酚試劑：苯酚。 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：100 mg/dL (5.55 mmol/L)。實驗步驟實驗步驟按下表加入各反應(yīng)物：加入物（ml）空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.020_血清樣品0.020酶試劑1.501

16、.501.50酚試劑1.501.501.50混勻，37保溫 15min，以空白管調(diào)零，505nm 波長處測定各管吸光度值。計算 血糖含量=A樣/A標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度實驗注意事項實驗注意事項1. 分離血清要求使用未溶血樣品，否則測定結(jié)果偏大。2. 要求在 30 min 內(nèi)分離血清，糖酵解在全血中以 7%/h 進行。3. 樣本在 4-8可穩(wěn)定 24h,樣本放置時間過長會使結(jié)果偏低。GODPODH2O2+4-AAP+苯酚紅色醌化物+H2O8實驗六 人血清中總膽固醇的測定實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙髮W(xué)會利用氧化酶法測定血清中總膽固醇含量的原理和方法。實驗原理實驗原理膽固醇脂+H2O 膽固醇+游離脂肪酸膽固

17、醇+O2 4-膽甾烯酮+H2O22H2O2+4-AA+4-氯仿 醌亞胺（紅色）+4H2OCEH：膽固醇脂酶 POD：過氧化物酶 CHOD：膽固醇氧化酶 4-AA：4-氨基安替吡啉醌亞胺在 500nm 有特征吸收，且生成量與樣本中的膽固醇含量成正比，可通過測定標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)生成的醌亞胺的吸光度值，計算出樣本中膽固醇的濃度。實驗儀器及試劑實驗儀器及試劑試管、移液管、UNICO-2000 型分光光度計、恒溫水浴鍋。標(biāo)準(zhǔn)血清、樣本血清、蒸餾水、酶試劑盒。實驗步驟實驗步驟按下表加入各反應(yīng)物：l空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣本管酶試劑200020002000蒸餾水20_標(biāo)準(zhǔn)血清_20_樣本血清_20A500nm各管混勻，37

18、反應(yīng) 6 min，以空白管校零。 CEHCHODPODA樣本A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)血清濃度膽固醇含量=9實驗七 牛奶中粗脂肪含量的測定實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙髮W(xué)習(xí)和掌握粗脂肪的定量測定法索氏提取法。實驗原理實驗原理本實驗用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個提取過程均在索氏提取器中進行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點為 30C -60 C 的石油醚。用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。索氏提取器 (如圖所示)利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┹腿。裙?jié)約溶利萃

19、取效率又高。萃取前先將固體物質(zhì)研碎，以增加固液接觸的面積。然后將固體物質(zhì)放在濾紙?zhí)變?nèi)，置于提取器中，提取器的下端與盛有溶劑的圓底燒瓶相連，上面接回流冷凝管。加熱圓底燒瓶，使溶劑沸騰，蒸氣通過提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶劑和固體接觸進行萃取，當(dāng)溶劑面超過虹吸管的最高處時，含有萃取物的溶劑虹吸回?zé)?，因而萃取出一部分物質(zhì)，如此重復(fù)，使固體物質(zhì)不斷為純的溶劑所萃取，將萃取出的物質(zhì)富集在燒瓶中。實驗儀器及試劑實驗儀器及試劑索氏提取器、干燥箱、電子分析天平、濾紙、棉線、干燥器、烘箱。 全脂牛奶、無水乙醚或石油醚。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟1、牛奶中水分含量的測定 準(zhǔn)確稱取一定量牛奶，吸附

20、于70過夜烘干的層析濾紙上，70烘干后（約20分鐘）稱量，計算水分含量。水分含量%=（M牛奶-M干物質(zhì)）/M牛奶100%M干物質(zhì)=M帶有干物質(zhì)的層析濾紙-M層析濾紙2、牛奶中粗脂肪含量的測定將洗凈的索氏提取器小燒瓶用鉛筆在磨口處編號，103-105烘干2小時，取出，置于干燥器中冷卻，然后用電子分析天平稱重，并記錄。將測完水分含量帶有干物質(zhì)的層析濾紙用定性濾紙包裹，稱量后置索氏抽提瓶，連接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無水乙醚，加量為接受瓶的23體積，恒溫水浴加熱，控制水溫，以每小時回流3-5次為宜至抽提完全為止（用濾紙試） 。10取下接受瓶，在水浴上蒸干乙醚，再于100105干燥

21、2小時，取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘，稱重，重復(fù)操作至恒重。取出濾紙包，于戶外晾至無乙醚味，置入恒溫箱內(nèi)，烘干，然后移入干燥缸內(nèi)冷卻后稱重，重復(fù)操作至恒重。計算 ：（1）粗脂肪含量%=（M提取前紙包-M提取后紙包）/M干物質(zhì)100%（2）粗脂肪含量%=（M接受瓶+粗脂肪-M接受瓶）/M干物質(zhì)100%注意事項注意事項1、乙醚為易燃有機溶劑，實驗室應(yīng)保持通風(fēng)并禁止任何明火。2、抽提用的乙醚或石油醚要求無水、無醇、無過氧化物，揮發(fā)殘渣含量低。因水和醇可導(dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測定結(jié)果偏高，被測樣品也要事先烘干。過氧化物會導(dǎo)致脂肪氧化，在烘干時也有引起爆炸的危險。3、裝樣品的濾紙筒

22、一定要嚴(yán)密，不能往外漏樣品，但也不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時高度不要超過回流彎管，否則超過彎管的樣品中的脂肪不能提盡，造成誤差。11實驗八 牛奶中酪蛋白的提取實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙笳莆找环N提取酪蛋白及檢測牛乳質(zhì)量的方法。實驗原理實驗原理酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，占乳蛋白的 80%-82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為 35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)可以檢測牛乳中是否摻假。酪蛋白在其等電點（pH4.6）時由于靜電荷為零，溶

23、解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就可從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個性質(zhì)被用來從酪蛋白粗制品中將脂類雜質(zhì)除去。實驗儀器及用品實驗儀器及用品溫度計、布氏漏斗、pH 試紙、抽濾瓶、水浴鍋、燒杯、量筒、表面皿、天平、離心機。市售全脂牛奶、無水乙醇、無水乙醚、pH4.7 乙酸鈉緩沖液 0.2mol/L。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟1、酪蛋白等電點沉淀 將 100mL 牛乳放到 500mL 燒杯中，加熱到 40，加入到同樣 40的乙酸鈉緩沖液中，調(diào)到pH4.7。此時有絮狀的蛋白質(zhì)沉淀析出。將懸浮液冷卻至室溫，放置分層 ，3000 r/min 離心 15 min，收集沉淀。2、

24、水洗將 pH4.7 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋 10 倍，洗滌粗制品三次，離心 10 分鐘，得到沉淀蛋白。 3、去脂 向粗制品中加入 10 ml 無水乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準(zhǔn)確稱重后，計算出每 100mL 牛 乳所制備出的酪蛋白質(zhì)量（g/100 mL），并與理論產(chǎn)量（3.5g/100mL）相比較，求出實際獲得百分率。12實驗九 牛奶中酪蛋白含量的測定實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?、學(xué)會用紫外吸收光譜法測定核酸蛋白混合物中蛋白質(zhì)含

25、量的方法。2、掌握 A224.0nm-A233.3nm測定蛋白含量的原理和方法。實驗原理實驗原理蛋白質(zhì)中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波長處有最大吸收。核酸及其衍生物有吸收紫外線的性質(zhì)，其最高吸收峰在 260nm 處。由于核酸在 280nm 處也有光吸收，因此當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和核酸共同存在時，測定其中任何一種物質(zhì)均存在干擾。核酸在 230nm 波長附近吸收值極小，如果將核酸測定值以 230nm 為中心，兩側(cè)存在對稱而又相等的等吸收點，224nm 波長處的吸收值和 233.3nm 波長處的吸收值相等。蛋白質(zhì)則不同，從 240nm 波長處向短波長處移動時，其吸收值對波長的減小吸收

26、值呈線性增加。因此，在 240nm 以下短波長一側(cè)的核酸等吸收點中，如果測定蛋白質(zhì)和核酸混合光密度值，兩點間的光密度之差和蛋白質(zhì)成比例關(guān)系。該方法是格羅夫斯等 1968 年建立起來的，能夠?qū)舛葹?5-180 微克/毫升的樣品作微量測定。該方法有快速，靈敏，不破壞樣品原有性質(zhì)的優(yōu)點，在測定完蛋白質(zhì)含量后可用于其他分析。實驗儀器及試劑實驗儀器及試劑試管、移液管、容量瓶、燒杯、玻璃棒、UNICO-2000 型分光光度計。 pH7 磷酸緩沖液。13實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟 用 pH7 的磷酸緩沖液溶解上次實驗制得的酪蛋白，配置成 5-180g/ml 的溶液，測定其在 224 nm 波長處和 23

27、3.3 nm 波長處的光密度值。按公式 C蛋白質(zhì)（mg/ml）=(A224-A233.3)210，計算濃度并反推回至每 100 ml 牛奶中的蛋白含量。注意事項注意事項1、在用紫外吸收光譜定量測定蛋白質(zhì)時，280nm 波長處蛋白質(zhì)吸收光譜主要由色氨酸和酪氨酸引起，但在 224-240nm 波長處的紫外吸收譜不僅由這些氨基酸引起，與苯丙氨酸，組氨酸，蛋氨酸，胱氨酸及半胱氨酸也有關(guān)，因此與其他吸收紫外線的不純物質(zhì)共同存在時，就會受到顯著影響，這一點也應(yīng)引起注意。2、pH 值對核酸測定的等吸收點有影響。14實驗十 氨基酸的紙層析實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?了解并掌握氨基酸紙層析法的原理和方法。實驗

28、原理實驗原理用濾紙為支持物進行層析的方法，稱為紙層析法。紙層析所用的展層溶劑大多由水和有機溶劑組成，濾紙纖維與水的親和力弱，因此在展層時，水是固定相，有機溶劑是流動相。溶劑由下向上移動的，稱為上行法；由上向下的，稱下行法。將樣品點在濾紙上，進行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動相移動的速率就不同，形成距原點距離不等的層析點，于是便將這些氨基酸分離開來。溶質(zhì)在濾紙上的移動速率用 Rf表示： Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離只要條件不變，Rf是常數(shù)，故可根據(jù) Rf值作定性依據(jù)。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：濾紙、燒杯

29、、剪刀、層析缸、微量注射器（10l）、電吹風(fēng)、722 型分光光度計。實驗試劑：氨基酸混合液堿相熔劑： V正丁醇:V12%氨水:V95%乙醇=13:3:3酸相溶劑： V正丁醇:V80%甲酸:V水=15:3:2顯色貯備液：V0.4mol/L 茚三酮-異戊醇:V甲酸:V水=20:1:5 實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸單向上行層析法1濾紙準(zhǔn)備；2點樣；3展層和顯色。二、混合氨基酸雙向上行紙層析1.準(zhǔn)備2點樣；3展層和顯色；4定性鑒定與定量測量。三、數(shù)據(jù)記錄和處理151計算出每種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的 Rf值；2混合氨基酸的 Rf值；3對照標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的 Rf值，指出氨基酸的名稱。實驗注意事項實驗注意事

30、項. 必須選用新華 1 號濾紙。. 點樣時，樣點的直徑不能超出 0.5mm。16實驗十一 醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶W(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理。實驗原理實驗原理醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。帶電物質(zhì)在電場力作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。由于各種蛋白質(zhì)都有特定的等電點，如將蛋白質(zhì)置于pH 值低于其等電點的溶液中，則蛋白質(zhì)將帶正電荷而向負(fù)極移動。反之，則向正極移動。因為蛋白質(zhì)分子在電場中移動的速度與其帶電量、分子的形狀及大小有關(guān)，所以，可用電泳法將不同的蛋白質(zhì)分離開來。血清中含有多種蛋白質(zhì)，它們的等電點都在

31、 pH 7.5 以下。將血清置于 pH 8.6 的緩沖液電泳時，所有的血清蛋白都帶有負(fù)電荷，在電場中將向正極移動。由于各種血清蛋白在相同pH 時所帶電荷數(shù)量不等，分子顆粒大小不一，因而泳動速度不同，經(jīng)電泳被分離開來。血清蛋白質(zhì)的等電點和分子量見下表。蛋白質(zhì)名稱等電點（pI）相對分子質(zhì)量清蛋白4.8869 0001-球蛋白5.00200 0002-球蛋白5.06300 000-球蛋白5.129 000150 000-球蛋白6.857.50156 000300 000本實驗以醋酸纖維素薄膜（簡稱 CAM）為支持物分離血清中的不同蛋白質(zhì)。它是一種良好的呈均一泡沫狀疏松薄膜，厚約 120m，具有一定的

32、吸水性。實驗材料、儀器及試劑實驗材料、儀器及試劑1材料：健康人血清或雞血清。2儀器：電泳儀、電泳槽。3試劑：（1）醋酸纖維素薄膜；（2）pH8.6 巴比妥緩沖液（離子強度 0.060.07）：取巴比妥 0.83 克，巴比妥鈉 6.38 克，加蒸餾水加熱溶解后，定容至 500ml。17（3）染色液：取氨基黑 10 B 0.5 克，溶于 50ml 甲醇中，再加冰醋酸 10ml，蒸餾水 40ml 混勻。（4）漂洗液：95%乙醇 4.5ml，冰醋酸 5ml，蒸餾水 50ml 混合。（5）透明液：95%乙醇 80ml，冰醋酸 20ml 混合。實驗方法實驗方法1準(zhǔn)備薄膜：將切割整齊的 2.56cm 的薄膜

33、條，浸入巴比妥緩沖液中浸透后，取出，用吸水紙吸去多余緩沖液。2點樣：仔細辯認(rèn)薄膜的粗糙面與光滑面，在粗糙面距離薄膜一端 1.5cm 處，用鉛筆輕輕劃一條直線。用玻棒蘸上血清樣品，涂于蓋玻片邊緣處（邊緣長度應(yīng)比膜條寬度窄），將此邊緣按壓在直線上。注意：樣品應(yīng)點在薄膜的粗糙面一側(cè)。待血清完全滲入薄膜后，將膜面翻轉(zhuǎn)，點樣面（粗糙面）朝下，置電泳槽中，薄膜點樣端放于負(fù)極一側(cè)。3電泳：打開電源，調(diào)節(jié)電壓 110130V，電流 0.40.6m A/cm 寬，電泳時間 4560 分鐘，電泳完畢后，關(guān)閉電源。4染色漂洗：將薄膜從電泳槽中取出，直接浸入染色液中約 5 分鐘，再轉(zhuǎn)入漂洗液中反復(fù)浸洗 34 次，直至

34、背景顏色脫凈為止。此時，正常血清蛋白在薄膜上顯示出五條區(qū)帶。從前端至點樣處的方向分別為清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白及 -球蛋白。5定量測定：將膜條用濾紙壓平吸干，按區(qū)帶分段剪開，分別浸在體積 0.4mol/L 氫氧化鈉溶液中，并剪取相同大小的無色帶膜條作空白對照，進行比色。或者將干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡 23 分鐘后，取出貼于潔凈玻璃板上，干燥后，即為透明薄膜圖譜，可用光密度計直接測定。注意事項注意事項1點樣好壞是電泳圖譜是否清晰的關(guān)鍵，點樣量要適當(dāng)。2漂洗時應(yīng)多漂洗幾次，直至無蛋白區(qū)底色脫凈為止。18實驗十二 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?掌握鑒定蛋白質(zhì)

35、的原理和方法。實驗原理實驗原理蛋白質(zhì)分子中的某種或某些基團與顯色劑作用，可產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng)，不同蛋白質(zhì)所含氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白質(zhì)物質(zhì)亦可產(chǎn)生相同顏色反應(yīng)，因此不能僅根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果來決定被測物是否是蛋白質(zhì)。顏色反應(yīng)是一些常用蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。雙縮脲反應(yīng)：將尿素加熱，兩分子尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故能呈此反應(yīng)。黃色反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境中變?yōu)?/p>

36、黃色的硝苯衍生物。茚三酮反應(yīng)：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，則產(chǎn)生藍紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及 -氨基酸所共有。含氨基酸的其他物質(zhì)亦呈此反應(yīng)。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：雞蛋白、吸管、滴管、試管、水浴鍋、電爐。實驗試劑：卵清蛋白、0.1%茚三酮、尿素、10%NaOH、濃硝酸、1%硫酸銅溶液。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟1. 雙縮脲反應(yīng)（1）取少許結(jié)晶尿素放在干燥試管中，微火加熱，尿素熔化并形成雙縮脲，釋出的氨可用紅色石蕊試紙試之。至試管內(nèi)有白色固體出現(xiàn)，停止加熱，冷卻。然后加 10%NaOH 溶液 1ml 搖勻，再加 2 滴 1%CuSO4溶液，混勻，觀察有無紫

37、色出現(xiàn)。（2）另取一支試管，加蛋白質(zhì)溶液 10 滴，再加 10%NaOH 溶液 10 滴及 1% CuSO4溶液 2 滴，混勻，觀察是否出現(xiàn)紫玫瑰色。2. 黃色反應(yīng)19于一試管內(nèi)，加入蛋白質(zhì)溶液 10 滴及濃硝酸 3-4 滴，加熱，冷卻后再加 10%NaOH 溶液 5 滴，觀察顏色變化。3. 茚三酮反應(yīng)取 1ml 蛋白質(zhì)溶液置于燒杯中，加 2 滴茚三酮試劑，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)。實驗注意事項實驗注意事項1在雙縮脲反應(yīng)中，硫酸銅不能多加。2茚三酮反應(yīng)需在 pH5-7 下進行。20實驗十三 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?. 熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。2. 進一步掌握蛋白質(zhì)的相關(guān)性質(zhì)

38、。實驗原理實驗原理多數(shù)蛋白質(zhì)是親水膠體，當(dāng)其穩(wěn)定因素被破壞或與某些試劑結(jié)合成不溶解的鹽后，即產(chǎn)生沉淀。蛋白質(zhì)鹽析作用：向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽至一定濃度，蛋白質(zhì)即沉淀析出，這種作用稱為鹽析。乙醇沉淀蛋白質(zhì)：乙醇為脫水劑，能破壞蛋白質(zhì)質(zhì)點的水化層使其沉淀出來。重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽類而沉淀。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：試管、吸管、吸濾瓶、布式漏斗。實驗試劑：蛋白質(zhì)試液、硫酸銨結(jié)晶體、飽和硫酸銨溶液、95%乙醇、結(jié)晶氯化鈉、1%醋酸鉛、5%鞣酸溶液、1%硫酸銅溶液、飽和苦味酸溶液、1%醋酸溶液。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、蛋白質(zhì)鹽析作用1. 取蛋白質(zhì)溶液

39、 5ml，加入等量飽和硫酸銨溶液，微微搖動試管，使溶液混合靜置幾分鐘，球蛋白即析出。2. 將上述混合液過濾，濾液中加硫酸銨粉末，至不再溶解，析出的即為清蛋白。再加水稀釋，觀察是否溶解。二、乙醇沉淀蛋白質(zhì)取蛋白質(zhì)溶液 1ml，加晶體 NaCl 少許，待溶解后再加入 95%乙醇 2ml 混勻。觀察有無沉淀析出。三、重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)取試管 2 支，各加蛋白質(zhì) 2ml，一管內(nèi)滴加 1%醋酸鉛溶液，另一管內(nèi)滴加 1%CuSO4 溶液，至有沉淀生成。21四、生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)取 2 支試管各加 2ml 蛋白質(zhì)溶液及 1%醋酸溶液 4-5 滴，向一管中加 5%鞣酸溶液數(shù)滴，另一管內(nèi)加飽和苦味酸溶液數(shù)滴，

40、觀察結(jié)果。實驗十四 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?了解 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法的原理，并學(xué)會用這種方法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。實驗原理實驗原理聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質(zhì)量。SDS 是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，其負(fù)電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取

41、決于分子大小這一因素，就可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的對數(shù)對遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來求得未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：直流穩(wěn)壓電泳儀、垂直平板電泳槽、移液器、微量注射器、燒杯、試管、滴管、直尺。實驗試劑：凝膠貯備液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、10%SDS、樣品緩沖液、電極緩沖液、10%過硫酸銨、1.5%瓊脂、染色液、脫色液、待測分子質(zhì)量的樣品。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟1裝配電泳槽。2分離膠的選擇和配制。3分離膠的灌制。4濃縮膠的配制和灌注。5樣品的制備：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的制備。22（2）待測蛋白質(zhì)樣品的制備。6電泳。7染色與脫色。8相對分子質(zhì)量的計算

42、。9數(shù)據(jù)記錄和處理：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對分子質(zhì)量。實驗十五實驗十五 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?了解并掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。實驗原理實驗原理具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與銅離子形成紫色配合物，在 540nm 處有最大吸收。在一定濃度的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和濃度與雙縮脲反應(yīng)所呈的顏色深淺成正比，可用比色法定量測定。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：容量瓶、試管、吸管、722 型（或 7220 型）分光光度計

43、。實驗試劑：1、雙縮脲試劑：0.175g CuSO45H2O 溶于約 15 ml 蒸餾水，置于 100 ml 容量瓶中，加入 30 ml濃氨水，30 ml 冰冷的蒸餾水和 20 ml 飽和 NaOH 溶液，搖勻，室溫放置 2h，再加蒸餾水至刻度，搖勻備用。2、牛血清白蛋白（2 mg/ml）溶液3、未知濃度蛋白樣品實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將 6 只 10 ml 容量瓶編號，按下表加入試劑，即得 6 種不同濃度的蛋白質(zhì)溶液。瓶號牛血清白蛋白（2mg/ml）溶液/ml蒸餾水蛋白質(zhì)濃度/（mg/ml）11.0稀釋至刻度0.222.0稀釋至刻度0.433.0稀釋至刻度0.644.0

44、稀釋至刻度0.855.0稀釋至刻度1.066.0稀釋至刻度1.223取干凈試管 7 只，按 0、1、2、3、4、5、6 編號，1-6 號管分別加入上述不同濃度的蛋白質(zhì)液3.0ml。0 號為對照管，加入 3.0ml 蒸餾水。各管加入雙縮脲試劑 2.0ml，充分混勻，即有紫色出現(xiàn)，用 540nm 光測定各管吸光度，繪制濃度-吸光度曲線。二、樣液的測定取未知濃度的蛋白質(zhì)溶液 3.0ml 置試管內(nèi)，加入雙縮脲試劑 2.0ml，混勻，測其 540nm 吸光度。三、數(shù)據(jù)記錄和處理 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，在坐標(biāo)紙上繪制出濃度-吸光度曲線，測出未知液的吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知液的濃度。24實驗十六 考馬

45、斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?學(xué)會用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度。實驗原理實驗原理考馬斯亮藍能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍 G250 的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在 465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍色，其最大吸收峰改變?yōu)?595nm，考馬斯亮藍 G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍 G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在 595nm 下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可用于蛋白質(zhì)濃度的測定。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：旋渦混合器、試管、吸管、722 型分光光度計、容量瓶、

46、量筒、電子分析天平。實驗試劑：（1）0.9%NaCl；（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白液:牛血清白蛋白（0.1 mg/ml）；（3）染液：考馬斯亮藍 G250（0.01%），稱取 0.1g 考馬斯亮藍 G250 溶于 50ml95%乙醇中，再加入 100 ml 濃磷酸，加蒸餾水定容到 1000 ml；（4）樣品液：取牛血清白蛋白（0.1 mg/ml）溶液，用 0.9%NaCl 稀釋至一定濃度。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 7 支干凈試管，按下表進行編號并加入試劑。試劑 1234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.80.9%NaCl/ml1.00.90.80.70.60

47、.40.2考馬斯亮藍染液/ml4.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)濃度/（ug/ml）0102030406080A59525混勻，室溫靜置 3 min，以第一管為空白，于波長 595nm 處比色，讀取吸光度。二、樣液的測定 另取一干凈試管，加入樣品 1.0 ml 及考馬斯亮藍染液 4.0 ml，混勻，室溫靜置 3min，于波長595nm 處比色，讀取吸光度。三、數(shù)據(jù)記錄和處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，在坐標(biāo)紙上繪制出濃度-吸光度曲線，測出未知液的吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知液的濃度。實驗十七 紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?1、了解紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度的

48、原理。2、熟悉紫外分光光度計的使用。實驗原理實驗原理蛋白質(zhì)組成中含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內(nèi)其濃度與吸光度成正比，故可用紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質(zhì)濃度。 由于核酸在 280nm 波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)測定有一定的干擾作用，但核酸的最大吸收峰在 260nm 處，如同時測定 260nm 的光吸收，通過計算可以消除其對蛋白質(zhì)測定的影響。因此如溶液中存在核酸時必須同時測定 280nm 及 260nm 的吸光度，方可計算測得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。實驗儀器及用品實驗儀器及用品實驗器材：UV-9100 型分光光度計、容量瓶、試管、吸管。

49、實驗試劑：卵清蛋白液、未知濃度蛋白質(zhì)溶液、0.9%氯化鈉。實驗內(nèi)容及步驟實驗內(nèi)容及步驟一、直接測定法在紫外分光光度計上，將未知的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以生理鹽水做對照，測得280nm 和 260nm 兩種波長的吸光度，代入下式計算蛋白質(zhì)濃度：C=1.45A280nm-0.74A260nm二、標(biāo)準(zhǔn)曲線法1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取 8 支干凈試管，編號，按下表加入試劑。012345671mg/ml 卵清蛋白液/mL00.51.01.52.02.53.04.0蒸餾水4.03053.02.52.01.51.0026蛋白質(zhì)濃度/（mg/ml）00.1250.250.3750.50.6250.751.

50、0A280nm加畢，混勻，用紫外分光光度計測 A280nm，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖。2、未知樣液的測定取未知濃度的蛋白液 1.0ml，加蒸餾水 3.0mL，測 A280nm，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。三、數(shù)據(jù)記錄和處理1、直接測定法做三組平行實驗，取算術(shù)平均值。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法用坐標(biāo)紙繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知液的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)濃度。27實驗十八 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙髮W(xué)會谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活力測定方法。實驗原理實驗原理丙氨酸+-酮戊二酸丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶+L-谷氨酸丙酮酸+2,4-二硝基苯胺丙酮酸 2,4-二硝基苯腙丙酮酸 2,4-二硝

51、基苯腙在堿性溶液中呈現(xiàn)棕色，吸收峰為 520nm。實驗步驟實驗步驟按下表順序加入反應(yīng)物：加入物（ml）空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管樣本0.1丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液0.1丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶基質(zhì)液0.50.50.537水浴保溫 30min2,4-二硝基苯肼溶液0.50.50.537水浴保溫 20min堿性溶液5.05.05.010min 后測 A520計算：ALT（U/L）=A樣/A標(biāo)準(zhǔn)95 （U/L）28實驗十九 過氧化物酶的作用實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康牧私膺^氧化物酶的作用。實驗原理實驗原理過氧化物酶能催化過氧化氫釋放出新生氧以氧化某些酚類和胺類物質(zhì)，例如氧化溶于水的焦性沒食子酸生成不溶于水的焦性沒食子橙（橙紅色），氧化愈

52、創(chuàng)木脂中的愈創(chuàng)木酸成為藍色的愈創(chuàng)木酸的臭氧化物。實驗器材及試劑實驗器材及試劑白菜梗、棉花或紗布、吸管、膠頭滴管、研缽、漏斗試管、電子天平。1%焦性沒食子酸溶液、2%H2O2。白菜梗提取液：白菜梗約 5g，切成細塊，置研缽內(nèi)，加蒸餾水約 15ml。研磨成漿，經(jīng)棉花或紗布過濾，濾液備用。實驗步驟實驗步驟取四支干凈試管，按表標(biāo)號并加入試劑。搖勻后，觀察并記錄各管顏色變化和沉淀的出現(xiàn)。管號1%焦性沒食子酸/ml2%H2O2/滴蒸餾水/ml白菜梗提取液/ml煮沸的白菜梗提取液/ml1222-22-2-322-2-422-229實驗二十 溶菌酶的提純結(jié)晶目的要求目的要求學(xué)習(xí)溶菌酶的提純方法。實驗原理實驗原

53、理雞蛋清內(nèi)含有豐富的溶菌酶，向蛋清中加入一定量的中性鹽，并調(diào)節(jié) pH 至溶菌酶的等電區(qū)，溶菌酶即可結(jié)晶析出。如結(jié)晶不純，可重結(jié)晶。器材與試劑器材與試劑1. 雞蛋清：將新鮮雞蛋兩端各敲一小洞，使蛋清流出。蛋清的 pH 若低于 8.0 則不能使用。紗布、燒杯 100ml（1）、真空干燥器 25cm（1）。2. 氯化鈉：應(yīng)研細。3. 五氧化二磷：工業(yè)品，做吸水使用。4. 1mol/L 氫氧化鈉溶液。5. 溶菌酶晶種：將無定形的溶菌酶配制成 5水溶液，每 10ml 加入 NaCl 0.5g，滴加 1mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 至 9.510.0，置冰箱中（4），1-2 天內(nèi)溶菌酶晶體即析出。

54、吸濾取得晶體，用冷丙酮（0以下）洗晶體 2 次，置放有五氧化二磷和石蠟的真空干燥器中干燥。操作步驟操作步驟1. 將兩只雞蛋的蛋清置于小燒杯中（蛋清 pH 不得低于 8.0），慢慢攪拌數(shù)分鐘，使蛋清稠度均勻，然后用兩層紗布濾去卵帶或碎蛋殼，量記蛋清體積。2. 按 100ml 蛋清加 5g 氯化鈉的比例，向蛋清內(nèi)慢慢加入氯化鈉細粉，邊加邊攪，使氯化鈉及時溶解，避免氯化鈉沉于容器底部，否則將因局部鹽濃度過高而產(chǎn)生大量白色沉淀。3. 加完 NaCl，用 1mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 9.510.0，邊加邊攪勻，避免局部過堿。加入少量溶菌酶結(jié)晶作為晶種，4放置數(shù)天。當(dāng)肉眼觀察有結(jié)晶形成后，吸取

55、晶液一滴，置載玻片上，用顯微鏡觀察（100）。記錄晶形。4. 結(jié)晶用布氏漏斗濾得，用 0丙酮洗滌數(shù)次，置真空干燥器干燥。30實驗二十一 酵母 RNA 的提取實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康恼莆障A法提取酵母 RNA 的原理和方法。實驗原理實驗原理酵母核酸中 RNA 含量較多，DNA 則少于 2。RNA 可溶于堿性溶液，當(dāng)堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗 RNA 制品。用堿液提取的 RNA 有不同程度的降解。器材與試劑器材與試劑干酵母粉（市售）、鮮酵母（市售）、pH 試紙、電子天平、抽濾瓶 500ml、布氏漏斗10cm、吸管、離心機。0.2氫氧化鈉溶液：2g NaOH 溶于蒸餾水并稀釋至 1000m

56、l。乙酸、95乙醇、無水乙醚、氨水。 10硫酸溶液：濃硫酸（比重 1.84）10ml，緩緩傾于水中，稀釋至 100ml。5硝酸銀溶液：5g AgNO3 溶于蒸餾水并稀釋至 100ml，貯于棕色瓶中。苔黑酚三氯化鐵試劑：將 100mg 苔黑酚溶于 100ml 濃鹽酸中，再加入 100mg FeCl36H2O。臨用時配制。操作步驟操作步驟1. RNA 的提取稱取 8g 干酵母粉于 100ml 燒杯中，加入 0.2 NaOH 溶液 40ml，沸水浴加熱 30 分鐘，經(jīng)常攪拌。冷卻，加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（pH56，用石蕊試紙試之），離心 1015 分鐘（4000r/min）。取上清液，加入 2

57、 倍體積的 95乙醇，邊加邊攪。加畢，靜置，待完全沉淀，過濾。濾渣先用 95乙醇洗 2 次（每次約 10ml），繼而用無水乙醚洗 2 次（每次 10ml），洗滌時可用細玻璃棒小心攪動沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗 RNA，可作鑒定和測定含量用。2. 鑒定31取上述 RNA 約 0.5g，加 10濃硫酸 5ml，加熱至沸 12 分鐘，將 RNA 水解。取水解液0.5ml，加苔黑酚三氯化鐵試劑 1ml，加熱至沸 1min，觀察顏色變化。水解液 2ml，加氨水 2ml及 5硝酸銀溶液 1ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀的嘌呤銀化合物。實驗二十二 RNA 的定量測定（苔黑酚法）實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康恼莆沼锰诜臃y定

58、RNA 含量的原理和方法。實驗原理實驗原理在酸性條件下，RNA 分子中的核糖基轉(zhuǎn)變成 呋喃甲醛，后者與苔黑酚作用生成綠色復(fù)合物，可用比色法測定。當(dāng)核糖核酸濃度在 10100g/ml 范圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系。實驗器材與試劑實驗器材與試劑1. 粗制 RNA（上一個實驗所得）、試管 7 支、吸管若干、分光光度計、水浴鍋。2. 標(biāo)準(zhǔn) RNA 母液：準(zhǔn)確稱取 RNA10.0mg，用少量蒸餾水溶解（如果不溶，可滴加濃氨水，調(diào) pH7.0），定容至 10.0ml，此溶液濃度為 1mg/ml。標(biāo)準(zhǔn) RNA 溶液：取母液 1.0ml，置 10ml 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。此溶液為100gRNA/

59、ml。3. 樣品溶液：將一定量的 RNA 粗品用蒸餾水溶解并定容，RNA 濃度在 10100g/ml 范圍內(nèi)。4. 苔黑酚三氯化鐵試劑：參見上一個實驗。操作步驟操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取試管 6 支，按下表編號并加入試劑 試劑012345RNA 標(biāo)準(zhǔn)液/ml00.40.81.21.62.0蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40苔黑酚試劑/ml2.02.02.02.02.02.032加畢，混勻，置沸水浴中加熱 45min，冷卻，測定各管 A670nm。以 A670nm為縱坐標(biāo)，RNA 量（g）為橫坐標(biāo)作圖。2. 樣品的測定取 1.0ml 樣品液置試管內(nèi)，加蒸餾水 1.0ml 及苔黑酚試

60、劑 2.0ml，沸水浴保溫 45min，冷卻，測定其 A670nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得 RNA 的質(zhì)量（g）。式中 ：RNA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）；m1：樣品液中測得的 RNA 的質(zhì)量（g）；m2：樣品液中樣品的質(zhì)量（g）。實驗二十三 DNA 的提取及含量測定實驗?zāi)康募耙髮嶒災(zāi)康募耙?1. 學(xué)習(xí)和掌握用濃鹽法從動物肝臟中提取 DNA 的原理和方法。2. 學(xué)習(xí)和掌握用二苯胺法測定 DNA 含量的原理和方法。實驗原理實驗原理1DAN 的提取核酸和蛋白質(zhì)在生物體中以核蛋白的形式存在，其中 DNA 主要存在于細胞核中，RNA 主要存在于核仁及細胞質(zhì)中。動植物的 DNA 核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液，但在